JP4840588B2

JP4840588B2 - 分析用チップ及びその製造方法、分析装置並びに分析方法

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Publication number: JP4840588B2
Application number: JP2006258045A
Authority: JP
Inventors: 道均金; 栄一民谷
Original assignee: 有限会社バイオデバイステクノロジー
Priority date: 2006-09-22
Filing date: 2006-09-22
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2026-09-22
Also published as: JP2008076313A

Description

本発明は、試料中の対象物質を検出又は定量するための新規な分析用チップ及びその製造方法、分析装置、並びに分析方法に関する。

近年、生体物質の有する分子認識機能を利用して試料中の対象物質を検出又は定量する、いわゆるバイオセンサと呼ばれる分析装置の開発が盛んに行われている。しかしながら通常のバイオセンサでは生体物質を酵素や蛍光物質等で標識しなければならず分析操作が煩雑であるといったデメリットがあることから、標識不要な分析方法の開発が望まれている。

非標識で分析可能なセンサとしては、誘電体や半導体等の表面に金属微粒子が層状に固定されているような微細構造をセンサユニットとし、局在プラズモン共鳴（Localized surface plasmon resonance, ＬＳＰＲ）を応用して試料の屈折率を測定し、そこに含まれる物質を定量するセンサが知られている。すなわち、金属微粒子部分に測定光を照射し、透過又は反射した光の強度を測定するが、特定の波長でＬＳＰＲが生じて光の散乱や吸収が著しく増大するため、その波長の光の強度が顕著に減少する。このＬＳＰＲの発生する波長及び強度は金属微粒子の周辺に存在する物質の屈折率に依存し、屈折率が大きいほど長波長側にシフトし、散乱や吸収が大きくなることが知られている。このようなＬＳＰＲを利用したセンサの具体的な構造としては、例えば特許文献１において、基板表面に金属微粒子を単層膜の状態で固定した構造が提案されている。

ところで、前記特許文献１に記載される構造のセンサユニットにおいてピーク変化のばらつきを抑えるためには、金属微粒子の形状や大きさのばらつきを均一に制御し、基板全面にわたって偏り無く固定することが重要となる。しかしながら、形状や大きさのばらつきのない微小な金属微粒子を得るには高度な製造技術が要求され、コストの増大を招くという問題点がある。また、基板全面にわたって金属微粒子を均一に並べることも技術的に難しい。

そこで、特許文献２においては、層面に対して略垂直方向に複数の独立細孔を形成した層状の陽極酸化アルミナと、陽極酸化アルミナの独立細孔のそれぞれに充填され互いに孤立して形成した金属粒子とを一体に備えた構造体を、ＬＳＰＲを利用したセンサとして用いることが提案されている。特許文献２に記載の構造は、径、間隔、深さを比較的自由に制御できる陽極酸化アルミナの細孔内に金属微粒子を充填して形成するので、金属微粒子を均一サイズで作製できると共に、金属微粒子を規則正しく配置することができるという利点がある。この構造体は、複数の細孔の開口した陽極酸化アルミナ上に金属を被着させた後、陽極酸化アルミナの細孔開口面上の金属被着体を除去することによって作製される。また、特許文献３においては、ＬＳＰＲを応用したセンサに使用される微細構造体が形成されており、この微細構造体は、一表面に複数の微細孔が形成された層状の基体と、この基体の前記微細孔内に充填された金属微粒子と、この金属微粒子と概略その径以下の距離をおいた状態で前記一表面において前記微細孔の周囲部分に形成された金属薄膜とから構成される。

一方、生体物質の特異的結合を利用して試料中の対象物質を検出する方法として、干渉分光法を利用した分析方法も知られている。干渉分光法を利用した分析方法とは、例えば陽極酸化アルミナ基板等の規則的な微細孔に光を照射し、反射光の干渉を測定する物であり、微細孔内に試料を添加すると、微細孔内部の壁で起こる物質間の相互作用（結合）により、干渉光の波長のずれが生じ、その程度が結合量を反映することを利用したものである。このような原理を利用した分析のためのセンサ構造については、例えば被特許文献１，２等において提案されている。例えば非特許文献１においては、直径２００ｎｍ程度の細孔が規則的に配列された多孔質シリコン層を形成し、この細孔内部に例えばＤＮＡプローブ等を固定化したものをセンサとして用いている。また、前記非特許文献１の改良も試みられており、例えば非特許文献２においては、多孔質シリコンに代えて多孔質アルミニウム酸化物を用いることが提案されている。
特開２０００−３５６５８７号公報特開２００３−２６８５９２号公報特開２００４−２３２０２７号公報 Science,Vol.278, 840-843頁,1997年 Nano Lett., Vol.3, No.6, 811-814頁,2003年

しかしながら、特許文献２に記載される構造体は、特許文献１のセンサユニットに比較するとその作製は容易であるものの、陽極酸化アルミナの独立細孔に金属を充填するための蒸着に長時間が必要となり、また、蒸着後に開口面に堆積した金属の除去操作が煩雑であり、製造工程のさらなる簡略化が求められている。

また、特許文献１，２に記載されるようなピーク波長の吸光度変化や、被特許文献１，２に記載されるようなピーク波長シフト等、様々な情報から試料中の物質の検出が可能であるものの、各情報を得るには各原理に対応した専用の分析用チップ等を用いて分析を行わなければならない。そのため、例えば分析の正確性を期することを目的として１つの事象を複数の原理に基づき多面的に分析したいような場合のように、それぞれの分析方法を試そうとするとコストの大幅な上昇を招くこととなる。

なお、特許文献１〜３等に記載されるＬＳＰＲを利用したバイオセンサにおいては、物質の吸着によってピーク波長の吸光度変化だけでなくピーク波長のシフトも生じることは知られているものの、そのシフト量は小さく、例えばシフト量を指標とした定量分析等は不可能である。また、ノイズも多く、安定した測定結果を得ることは難しい。

本発明はこのような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、ＬＳＰＲによる測定結果である吸収ピークの吸光度変化と干渉分光法による測定結果である吸収ピーク波長のシフトとの両方において大きな変化量を得ることが可能な分析用チップを提供することを目的とする。また、本発明は、前記分析用チップを比較的容易に製造することが可能な分析用チップの製造方法を提供することを目的とする。さらには、本発明は、前記分析用チップを用いた分析装置を提供することを目的とする。

前述の目的を達成するために、本発明者らは長期にわたり検討を重ねてきた。その結果、ＬＳＰＲによる吸光度変化を利用して物質の吸着等を検出するためには前述の特許文献１，２等のように互いに孤立した金属微粒子を規則的に配列させる必要があると思われてきたが、高度な規則性を持つ陽極酸化アルミナ皮膜等のような多孔質層の開口面と細孔の開口部近傍の内壁上方の孔壁面との両方に金属を成膜するという極めて単純な構造であっても、ＬＳＰＲにより特定波長において大きな吸光度変化を得ることができ、そればかりか、規則的な多孔質構造による光の干渉効果も大きく得ることができ、この光の干渉効果とＬＳＰＲとが相俟って波長シフトについても変化量が大きくなるという知見を得、本発明を完成させるに至った。

以上のような分析用チップの吸収スペクトルを測定すると、前述した構造を有する多孔質層の表面と細孔内部の開口部近傍とに形成した金属層が存在することで、ＬＳＰＲが生じ、特定の波長に吸収ピークが観察され、金属層近傍に物質が吸着又は堆積すると、吸収ピークが増大する。特に、多孔質層の表面のみならず多孔質層の細孔内部の開口部近傍にも金属層を設けることで、吸収ピークの変化量は大きなものとなる。このことから、この吸光度変化を指標として物質の検出又は定量が実現される。

以上のような分析用チップの吸収スペクトルを測定すると、前述した構造を有する多孔質層の表面と細孔内部の内壁上方の開口部近傍とに形成した金属層が存在することで、ＬＳＰＲが生じ、特定の波長に吸収ピークが観察され、金属層近傍に物質が吸着又は堆積すると、吸収ピークが増大する。特に、多孔質層の表面のみならず多孔質層の細孔内部の内壁上方の開口部近傍にも金属層を設けることで、吸収ピークの変化量は大きなものとなる。このことから、この吸光度変化を指標として物質の検出又は定量が実現される。

また、本発明の分析用チップは、互いに平行な方向に延びる細孔が略等間隔に配列された多孔質層の構造に起因して、吸収ピークの吸光度変化のみならず、吸収ピークの波長シフト変化量も非常に大きなものとなる。すなわち、本発明の分析用チップの金属層近傍に例えば物質が吸着又は堆積すると、細孔内の光の屈折率が変化し、光の干渉効果に起因した吸収ピーク波長のシフトが生じることから、この波長シフトを指標として物質の検出又は定量が実現される。

そして、以上のような分析用チップを用いることで、前述したような光の干渉効果とＬＳＰＲとの相乗効果により、吸収ピーク変化量と波長シフト変化量とが非常に大きなものとなり、高感度な分析が実現される。

また、本発明に係る分析用チップの製造方法は、互いに平行な方向に延びる多数の細孔が略等間隔に配列され、前記細孔が一方の面に開口した多孔質層を形成した後、前記細孔の孔壁面に対して傾いた方向から金属材料を被着し、前記多孔質層の開口面上と前記細孔の開口部近傍の孔壁面とに金属層を形成することを特徴とする。

以上のような分析用チップの製造方法においては、細孔の孔壁面に対して傾いた方向から金属材料を被着するといった容易な操作にて、多孔質層の開口面と細孔の開口部近傍の孔壁面との両方に金属層を形成することができる。このとき、細孔への金属材料の充填操作や開口面上に形成した金属層の除去操作は不要であり、分析用チップが簡単に作製される。

さらに、本発明に係る分析装置は、前記分析用チップと、光源と、検出器と、分光器とを備えることを特徴とする。本発明に係る分析方法は、前記分析装置を用い、局在プラズモン共鳴及び干渉効果による吸光度変化と波長シフトとの両方に基づいて試料中の対象物質を検出又は定量することを特徴とする。

以上のような分析装置を用いて試料中の物質を分析する際には、前述の分析用チップに対して光源から光を照射し、反射光を検出器で測定し、分光器で分光して吸収スペクトルを得る。そして、特定波長に生じている吸収ピークの吸光度変化と波長シフトとのいずれかから、物質の検出又は定量が実現される。したがって、本発明の分析用チップを用いた分析装置を用いることで、ＬＳＰＲの原理を利用した分析と、光の干渉を利用した分析との２種類の分析結果が得られ、これによって物質の検出又は定量分析が実現される。

以上のような分析用チップを用いた分析装置によれば、試料中の物質の検出又は定量を、ＬＳＰＲ及び光の干渉効果に起因する吸収ピークの吸光度変化とピーク波長シフトとの両方から知ることができ、しかもこれらの変化量は従来の構造のセンサを用いた場合に比較して顕著に大きなものとなる。すなわち、本発明の分析用チップを用いて分析を行うことで、既存の分析装置やセンサー等に比較して高感度な分析を実現することができる。また、物質を検出又は定量するに際して、吸収ピークの吸光度変化及びピーク波長シフトのいずれの結果を利用するか使用者が任意に選択することができ、多様な分析が可能となる。

また、以上のような分析用チップの製造方法によれば、１種類のチップで複数種類の原理に基づく分析が可能であり、且つ高感度分析を実現可能な分析用チップを容易に製造することができる。

さらに、以上のような分析装置によれば、１回の分析で吸収ピークの吸光度変化、及び、ピーク波長シフトという２種類の情報を得ることができ、多面的且つ高感度な分析を行うことが可能である。

以下、本発明に係る分析用チップ及びその製造方法、この分析用チップを用いた分析装置、並びにこの分析装置を用いた分析方法について、詳細に説明する。

先ず、本発明の分析用チップの構造について説明する。図１に示すように、本発明の分析用チップ１は、基材２上に形成された多孔質層３と、多孔質層３の開口面４の表面と多孔質層３に設けられた細孔６の開口部近傍の孔壁面との両方に形成された金属層５とを備えている。

多孔質層３は、互いに平行な方向に延びる多数の細孔６を有している。多孔質層３の細孔６が開口した側の面が開口面４とされる。細孔６同士は略等間隔に配列されており、これによって干渉分光法を利用した波長シフトの変化量を大きなものとすることができ、干渉分光法を利用した定量分析にも確実に対応することが可能となる。開口面４の表面形状は各細孔６を中心として凹んだような凹凸状でもよく、また、平坦であってもよい。

多孔質層３の細孔６の径及び深さは、実質的に等しくされていることが望ましい。ここで、細孔６の径は、原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscope:ＡＦＭ）で測定される開口径が４０ｎｍ〜８０ｎｍの範囲内であることが望ましい。また、細孔６の深さは、分析用チップを用いて得られた吸収スペクトルから、多孔質層の各深さにおける吸収ピークの吸光度の平均値と測定波長領域で現れた吸収ピーク数とを調べた結果、深さが０．５μｍ〜３μｍの範囲内であることが望ましい。細孔６の具体的な寸法は、多孔質層３の材料や分析対象等に応じて適宜設定すればよいが、例えば直径６０ｎｍ程度とされる。

多孔質層３を構成する材料としては、特に限定されないが、例えばＳｉ等の半導体、樹脂や金属酸化物のような絶縁体等を用いることができる。中でも、細孔６が表面に対してほぼ垂直に且つ互いに略等間隔に平行して配列するハニカム構造をとり、細孔６の径及び深さの制御が比較的容易であることから、多孔質層３を陽極酸化アルミナ皮膜で形成することが好ましい。

多孔質層３が陽極酸化アルミナ皮膜からなる場合、基材２はアルミニウムにより構成される。ただし、基材２の全体がアルミニウムで構成される必要はなく、少なくとも基材２の表面にアルミニウムが存在していればよい。

本発明の金属層５は多孔質層３の開口面４の表面に形成されている必要がある。このように金属層５を配することにより、この分析用チップ１を用いた１回の分析で局在プラズモン共鳴（Localized surface plasmon resonance, ＬＳＰＲ）によるピーク波長の吸光度変化の情報を得ることができる。また、本発明の分析用チップ１においては、金属層５は、開口面４の表面だけでなく、細孔６の開口部近傍の内壁上方の孔壁面にも形成される。開口面４の表面に金属層５が存在するだけでもＬＳＰＲの結果は得ることは可能であるものの、その効果を安定して且つ大きく得るうえでは、細孔６の開口部近傍の内壁上方の孔壁面も金属層５で覆うことが重要となる。さらに、細孔６の内壁上方の開口部近傍にも金属層５を形成することで、開口面４の表面だけの場合に比較して、チップあたりの金属層５の表面積の拡大が図られ、被検物質と相互作用する抗体や核酸等の生体成分の固定化密度を高めることができる。

なお、図１においては、金属層５が開口面４の全面を被覆した状態を示しているが、金属層５は開口面４上の少なくとも一部に存在していればよく、例えば金属層５によって被覆されずに多孔質層３が表面に露出している領域が存在してもよい。

本発明においては、多孔質層３の細孔６の内部に金属層５を構成する材料を存在させないようにする。これにより、ＬＳＰＲの結果だけでなく干渉分光の結果も確実に得ることができる。一方、細孔６の内部に金属材料を充填すると、多孔質層３の規則性が崩れ、干渉分光法を利用した結果を安定して得ることができなくなる。

金属層５を構成する材料としては、ＬＳＰＲを得ることのできる公知の金属材料を用いることができる。具体的には金、銀等が例示され、中でも蒸着が容易で化学的に安定であること等の理由から、金属層５には金が含まれることが好ましい。

金属層５は単層でもよいが、例えば図２に示すように、多孔質層３に接する第１金属層５ａと、第１金属層５ａ上に形成される第２金属層５ｂとの２層構造としてもよい。特に、多孔質層３が陽極酸化アルミナ皮膜からなる場合、第１金属層５ａがクロム（Ｃｒ）層であり、第２金属層５ｂが金（Ａｕ）層であることが好ましい。前記分析用チップ１においては、金属層５は主に細孔６の外側、すなわち多孔質層３の開口面４表面に設けられるため、細孔６内に金を充填する場合に比べて、金が剥離し易いことが問題となる。これに対して、アルミナからなる多孔質層３と金からなる金層（第２金属層５ｂ）との間にクロム層（第１金属層５ａ）を介在させることで、金の密着性を高めて剥離を防止することができる。下地となる第１の金属層５ａには、前述のクロムの他、チタニウム（Ｔｉ）、ニッケル（Ｎｉ）等を用いることも可能である。

分析用チップ１が生体物質の有する分子認識機能を利用したバイオセンサーとして用いられる場合、金属層５の表面には試料中の分析対象物質を認識するための分子が固定される。金属層５の表面に固定される分子としては、例えば抗体、抗原、核酸、核酸結合蛋白質、レセプター、リガンド等、分子認識機能を有する公知の物質を用いることができる。

以下、本発明の分析用チップ１の製造方法について、多孔質層３が陽極酸化アルミナ皮膜からなり、金属層５がクロムからなる第１の金属層５ａと金からなる第２の金属層５ｂとの２層構造とされた分析用チップ１を例に挙げ、詳細に説明する。

先ず、アルミニウムからなる基材２を準備する（図３（ａ））。アルミニウムからなる基材２の表面には、通常、アルミナ（Ａｌ_２Ｏ_３）からなる酸化膜１１が形成されている。

次に、研磨工程を行うことにより、基材２の表面に形成された酸化膜１１を除去し、アルミニウムからなる基材２を露出させる（図３（ｂ））。この研磨工程により、基材２の表面に存在する大きなうねりも平坦化される。具体的には、機械的研磨を行った後、電解研磨を行う。

次に、陽極酸化処理によって陽極酸化アルミナ皮膜からなる多孔質層３を形成する。陽極酸化アルミナ皮膜からなる多孔質層３は、１回の陽極酸化処理で形成することも可能であるが、多孔質層３における細孔６の径及び深さを均一とし、且つ細孔６を高度に規則的に配列させる観点より、以下に説明するように陽極酸化処理を２回行って形成することが好ましい。

具体的には、先ず、１回目の陽極酸化処理を行う。１回目の陽極酸化処理は、例えば印加電圧を３０Ｖ〜５０Ｖ程度、シュウ酸電解液等を用いて行う。これにより、アルミニウムからなる基材２の表面に陽極酸化アルミナ皮膜１２が形成される（図３（ｃ））。ここで得られる陽極酸化アルミナ皮膜１２も広い意味での多孔質構造を形成しているが、各孔１３の形状は内部で膨張したような形状であり、その径及び深さも均一ではない。また、陽極酸化アルミナ皮膜１２の表面における凹凸の分布や高さも不均一である。したがって、この段階の陽極酸化アルミナ皮膜１２を分析用チップに用いると、正確な測定が難しくなるおそれがある。

そこで、１回目の陽極酸化処理で得られる陽極酸化アルミナ皮膜１２をエッチングにより除去してアルミニウムからなる基材２を露出させ、再度、陽極酸化処理を行うことによって、陽極酸化アルミナ皮膜からなる多孔質層３を得ることが好ましい。

図３（ｄ）は、１回目の陽極酸化処理で得られる陽極酸化アルミナ皮膜１２を除去した後の状態を示している。この段階で露出したアルミニウム基材２の表面には、ナノオーダーの微小な凹凸パターンが規則的に配置されている。陽極酸化アルミナ皮膜１２のエッチングには、例えばリン酸やクロム酸を用いることができる。

図３（ｅ）は、２回目の陽極酸化処理後に得られる陽極酸化アルミナ皮膜からなる状態を示している。２回目の陽極酸化処理は、例えば印加電圧を３０Ｖ〜５０Ｖ程度、シュウ酸電解液等を用いて行う。これにより、陽極酸化アルミナ皮膜からなる多孔質層３が完成する。ここで、２回目の陽極酸化処理においては、アルミニウム基材２表面の微小な凹凸パターンに基づき、基材２の主面に略垂直方向に陽極酸化アルミナ皮膜が自己整合的に成長する。したがって、径及び深さが均一で、互いに等間隔に規則的に配列された細孔６を持つ多孔質層３を形成することが可能となる。

陽極酸化アルミナ皮膜からなる多孔質層３を形成した後、多孔質層３の開口面４に金属材料を被着し、金属層５を形成する。このとき、細孔６の孔壁面に対して斜め方向から金属材料を被着する。金属材料の被着は、蒸着、スパッタ等により実現することができる。

金属材料の蒸着は、例えば図４に示すような真空蒸着装置２１を用いて実現することができる。この真空蒸着装置２１は、真空容器２２内のステージ２３上に、金属層５の原料２４を収容した蒸着源が載置され、開口面４を下向きとして複数のチップ２５を支持可能な構成とされている。ここで、蒸着源２４と２次元状に並べられた複数のチップ２５との配置を適切に設定すると、チップ２５に対して金属層の原料２４は点状とみなすことができる。このような関係にあるとき、蒸発した金属材料の多くは多孔質層３の内壁上方の孔壁面に対して斜め方向から入射するので、結果として、多孔質層３の開口面４、又は開口面４と細孔６の内壁上方の孔壁面の開口部近傍とに金属材料を選択的且つ容易に被着することができる。多孔質層３の開口面４上に形成された金属層５は除去することなくそのまま分析用チップ１として用いる。以上のようにして、図１に示す構造の分析用チップ１が完成する。

以下、本発明の分析用チップ１を用いた分析装置について説明する。
図５に示す分析装置３１は、分析用チップ１の金属層５が設けられた面に対して測定光Ｉを入射させる光源である入射光ファイバ３２と分析用チップ１から反射した反射光Ｒを検出する検出器である反射光検出ファイバ３３とを備えた光源プローブ３４と、タングステンハロゲン光源３５と、検出器３３で検出された光を分光する分光光度計３６と、分光光度計３６で得られた結果を処理するコンピュータ３７とを備えている。光学プローブ３４においては、検出器３３を取り巻くように複数の光源３２が配置され、検出器３３と光源３２とが一体化されている。

以上のような分析装置３１を用いて試料中の物質を検出又は定量する場合には、以下のようにする。先ず、分析用チップ１の金属層５の表面に分析対象物質を認識する分子を予め固定しておく。次に、この分析用チップ１の金属層５と試料溶液とを接触させて反応させる。その後、光源３２から測定光Ｉを照射して得られる反射光Ｒを検出器３３で検出し、分光光度計３６で分光して吸収スペクトルを得る。

図６は、本発明の分析装置により得られる吸収スペクトルの一例である。金属層５に固定された分子に分析対象物質が結合すると、金属層５の近傍の屈折率等が変化し、その結果、得られる吸収スペクトルにおいては、ＬＳＰＲを利用した分析の結果として、吸収ピーク強度が結合前に比べて増大する。このため、この吸光度変化を指標として、物質の検出が実現される。また、得られる吸収スペクトルにおいては、干渉分光を利用した分析の結果として、分析対象物質の結合前後で波長シフトも観察される。この波長シフト量は比較的大きなものであることから、これを指標とした分析対象物質の検出も可能である。さらには、結合した分析対象物質の量に応じた吸収ピークの吸光度変化量及び波長シフト量が得られるため、これらのいずれかを指標として、分析対象物質の定量も可能である。以上のように、分析装置３１に用いられる分析用チップ１の表面への物質の吸着が、当該分析用チップ１に光を照射したとき、局在プラズモン共鳴及び干渉効果による吸光度変化及び波長シフトとして観察されるので、この２つの情報に基づき、試料中の分析対象物質の検出及び定量を行うことが可能となる。

以下、本発明の実施例について、実験結果を参照しながら説明する。

＜実験１：分析用チップの作製＞
先ず、１ｃｍ四方のアルミニウム基材を用意し、４８０℃で４０分間アニーリングした。次に、ダイヤモンド懸濁液を用いた機械研磨、その後、電解研磨を行うことにより基材表面の酸化膜を除去した。電解研磨は７０℃で１０分間、電流１．３Ａとした。電解研磨で用いた酸性溶液はＨ_３ＰＯ_４とＨ_２ＳＯ_４とＨ_２Ｏとを８．５：１：０．５の割合で混合し、３５ｇ／ＬのＣｒＯ_３を含んでいる。

次に、１回目の陽極酸化処理を行った。陽極酸化処理は、１０℃で１０〜１００分間、印加電圧４０Ｖの条件で行い、０．３Ｍシュウ酸溶液を用いた。

次に、１回目の陽極酸化処理で形成された陽極酸化アルミナ皮膜（Ａｌ_２Ｏ_３）を除去した。陽極酸化アルミナ皮膜の除去には、Ｈ_３ＰＯ_４とＨ_２Ｏとを８：２の割合で含む溶液に５０ｇ／ＬのＣｒＯ_３を加えたものを用いた。これによりアルミニウム基材が露出した。アルミニウム基材の表面には、高さ７ｎｍ程度の微小な凹凸が形成されていた。

その後、２回目の陽極酸化処理を行った。２回目の陽極酸化処理は、１回目と同様、１０℃、印加電圧４０Ｖの条件で行い、０．３Ｍシュウ酸溶液を用いた。これにより、厚さ３μｍの陽極酸化アルミナ皮膜からなる多孔質層が得られた。

ここで、２回目の陽極酸化処理後に得られた多孔質層について、開口面の表面形状を原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscope:ＡＦＭ）にて観察した。結果を図７（ａ）に示す。また、図７（ａ）中のＡ−Ｂ線における拡大断面を図７（ｂ）に示す。さらに、前記多孔質層の開口面と側面との境界部付近を走査型電子顕微鏡（Scanning Electrone Microscope：ＳＥＭ）により観察した。結果を図８に示す。

２回の陽極酸化処理で得られた陽極酸化アルミナ皮膜の細孔は図８に示すように膜面に対して垂直方向に形成されており、その径及び深さは殆ど等しかった。また、図７に示すように、細孔は互いに等間隔に、規則的に配列されていることがわかる。各細孔の径は６０ｎｍ、セルの大きさは１２０ｎｍであった。なお、ＡＦＭイメージである図７において描かれる細孔は、深さが深くなるに従って開口面積が減少していくような形状とされており、図８に示すＳＥＭ写真における細孔形状と異なっている。これは、細孔の径に比べてＡＦＭ観察に用いたカンチレバーが大きく、カンチレバーが細孔内部表面に追従できなかったためと推測される。

以上のように陽極酸化アルミナ皮膜からなる多孔質層を形成した後、図４に示すような真空蒸着装置（Sanyu Electron社製、SVC-700TM/700-2）を用いて多孔質層の開口面上に金属材料を真空蒸着し、金属層を形成した。具体的には、多孔質層が形成されたチップを２０枚用意し、開口面を下に向け、蒸発した金属が孔壁面に対して斜め方向で被着する位置にセットした。金属材料の付着を防ぐ目的で、蒸着源とチップ支持体との間の真空容器内壁をアルミニウム箔で覆った。その後、真空容器内を減圧し蒸着を行った。先ず初めにクロム（Ｃｒ）を蒸着し、その後金（Ａｕ）を蒸着した。蒸着の間、チップは移動させなかった。その結果、多孔質層の開口面上と細孔の孔壁面の開口部近傍との両方に、厚さ５ｎｍのクロム層と厚さ１５ｎｍの金層とがこの順に積層された２層構造の金属層が形成された。以上により、分析用チップが完成した。

多孔質層の開口面に金属層を形成した後、表面形状をＡＦＭにて観察した。結果を図９（ａ）に示す。また、図９（ａ）中のＡ−Ｂ線における拡大断面を図９（ｂ）に示す。図９より、多孔質層の開口面上に金属層が形成されていること、また、蒸着前（図７（ｂ））に比較して表面の開口部の径が４７ｎｍと狭くなっており、多孔質層の開口面だけでなく開口部近傍の内壁上方の孔壁面にも金属材料が被着していることがわかる。

＜実験２：金属層の有無の検討＞
次に、以上のように作製した分析用チップを図５に示すような分析装置に用い、グルコース溶液の分析を行った。分析用チップにおける多孔質層の膜厚は３μｍであった。

先ず、０〜１０ｍｇ／ｍＬのグルコース溶液を調製した。グルコースは乾燥粉末の状態で入手し、１８．３ＭΩ、ｐＨ７．４の超純水（ミリポア社製）に溶解して用いた。次に、グルコース溶液の分析を行った。具体的には、超純水で調製された０〜１０ｍｇ／ｍＬのグルコース溶液をそれぞれ分析用チップの表面にのせた後、５分後、溶液に浸けた状態のままグルコース濃度変化に対する吸収スペクトルの変化を観察した。得られた吸収スペクトルを図１０に示す。また、比較として、金属層を形成する前の段階の分析用チップ、すなわち、陽極酸化アルミナ皮膜からなる多孔質層のみを用いて、金属層有りの場合と同様にグルコース濃度変化に対する吸収スペクトルの変化を観察した。結果を図１１に示す。さらに、図１０及び図１１から把握されるグルコース濃度と吸光度変化量との関係を図１２（ａ）に、グルコース濃度と波長シフト変化量との関係を図１２（ｂ）に示す。

図１２より、金属層のない分析用チップ（金（Ａｕ）蒸着前）を用いた場合、グルコースの吸着による吸光度変化は認められなかった。なお、波長シフトは認められたもののその変化量はわずかであった。これに対し、本発明の分析用チップ（金（Ａｕ）蒸着後）を用いることで、グルコースの吸着によって波長シフトと吸光度変化との両方が観察されるようになり、金属層がない場合に比べてこれらの変化量も大幅に増加した。以上の結果より、本発明の分析用チップを用いた分析装置によって、波長シフトと吸光度変化との両方を指標として、グルコースの非特異的吸着の検出が可能であることが確認された。

＜実験３：ＤＮＡ検出＞
本実験においては、本発明の分析用チップを用いて試料中のプローブＤＮＡの検出を試みた。先ず、実験に先立ち、多孔質層の膜厚と吸光度変化との関係について調べた。

２回目の陽極酸化処理を行う際、陽極酸化処理の時間を１０〜１００分間の間で変化させることにより、多孔質層の膜厚を０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍと変化させた。それ以外は実験１と同様にして分析用チップを作製した。得られた分析用チップを用いて得られた吸収スペクトルを図１３に示す。なお、図１３は、金属層形成後の結果である。また、図１３における吸収スペクトルから、多孔質層の各厚さにおける吸収ピークの吸光度の平均値と測定波長領域で現れた吸収ピーク数とを調べた。結果を図１４に示す。図１３、図１４より、多孔質層の膜厚を厚くしていくことでピークにおける吸光度の平均値は次第に小さくなる傾向を示していた。この結果より、以下の実験では、適度なピーク数及び吸光度強度が得られる３μｍを、多孔質層の厚みとして主に設定することとした。

次に、金属層にプローブＤＮＡを固定し、これに相補的なＤＮＡやミスマッチＤＮＡ等を作用させたときの変化を調べた。先ず、プローブＤＮＡとして５’末端にチオール基を有するＤＮＡを用意し、これをＴＥバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に溶解し、本発明の分析用チップと反応させることにより、金層の表面にプローブＤＮＡを固定した。

次に、ＴＥバッファーのみ、ミスマッチＤＮＡを含むＴＥバッファー、及び、相補的ＤＮＡを含むＴＥバッファーを用意し、これらを試料溶液としてプローブＤＮＡ固定化分析用チップと接触させ、ハイブリダイズした。反応後、吸収スペクトルを測定した。また、金蒸着前の多孔質層のみの分析用チップ、金蒸着後の分析用チップ（プローブＤＮＡなし）についても各種試料溶液を作用させ、吸収スペクトルを測定した。多孔質層の膜厚を０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍとした分析用チップについてそれぞれ検討した。代表として、多孔質層の膜厚が３μｍである分析用チップを用いたときの結果を図１５に示す。

また、多孔質層の膜厚と金属層へのプローブＤＮＡの固定化後又は相補的ＤＮＡの結合後における吸光度変化との関係を図１６（ａ）に、多孔質層の膜厚と金属層へのプローブＤＮＡの固定化後又は相補的ＤＮＡの結合後における波長シフトとの関係を図１６（ｂ）に示す。なお、本実験で用いたプローブＤＮＡやターゲットＤＮＡは乾燥粉末の状態で入手し、ＴＥバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に溶解して用いた。各ＤＮＡの塩基配列を下記表１に示す。

図１６（ａ）、（ｂ）に示すように、相補的ＤＮＡが結合すると、多孔質層の膜厚が厚くなっても、吸光度変化量と波長シフト量は多孔質層膜厚によらずほぼ一定であった。仮に多孔質層の開口面及び孔壁面を含む多孔質層の表面全体が金属層で被覆されているのであれば、多孔質層の膜厚（細孔の深さ）が異なると孔壁面に形成される金属層の厚みも変わるため、多孔質層の膜厚に応じて吸光度変化量と波長シフト量が異なってくると考えられる。ところが実際には、図１６（ａ）、（ｂ）に示すように、吸光度変化量と波長シフト量は多孔質層膜厚によらずほぼ一定であった。このことから、金属材料は細孔内部には殆ど進入せず、多孔質層の開口面及び孔壁面の開口近傍に止まっていると考えられる。

次に、ターゲットＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）濃度が１ｆＭ〜１００μＭとされた試料溶液を調製し、前記プローブＤＮＡが固定された分析用チップを用いた分析装置によって吸収スペクトルを測定した。なお、プローブＤＮＡを固定していない未処理の分析用チップ、及び、プローブＤＮＡを固定したのみで試料溶液と接触させていない分析用チップについても同様に吸収スペクトルを測定した。結果を図１７に示す。また、試料溶液中のＤＮＡ濃度と吸光度変化との関係を図１８（ａ）に、試料溶液中ＤＮＡ濃度と波長シフトとの関係を図１８（ｂ）にそれぞれ示す。

図１８（ａ）より、試料溶液中のＤＮＡ濃度と吸光度変化とは、ＤＮＡ濃度１０ｐＭ〜１０μＭの範囲内で直線関係にあった。また、図１８（ｂ）より、試料溶液中のＤＮＡ濃度と波長シフトも、吸光度変化と同じくＤＮＡ濃度１０ｐＭ〜１０μＭの範囲内で直線関係にあった。この結果より、吸光度変化と波長シフトのうち任意の一方と、分析対象物質濃度との関係を予め求めておくことで、試料中の分析対象物質の定量分析が可能であることがわかった。また、吸光度変化と波長シフトのどちらを指標とした場合も同じ結果を得ることができ、正確な定量分析が可能であることがわかった。さらに、本発明の分析用チップを用いた分析装置によって、１０ｐＭという高感度分析が可能であることが確認された。

本発明の分析用チップの一例を示す概略断面図である。図１に示す分析用チップの金属層近傍を拡大して示す断面図である。本発明の分析用チップの製造方法の一例を説明するための図であり、（ａ）は基材２、（ｂ）は研磨工程、（ｃ）は１回目の陽極酸化工程、（ｄ）はエッチング工程、（ｅ）は２回目の陽極酸化工程を示す。各図中、上段はＡＦＭによる表面イメージ、下段は概略断面図である。金属層の形成に用いられる蒸着装置の一例を示す模式図である。本発明の分析装置の一例を示す模式図である。本発明の分析装置により得られる吸収スペクトルの一例であり、金属層近傍への物質の吸着の前後の状態を示す図である。２回目の陽極酸化処理後に得られた多孔質層（厚さ３μｍ）について、開口面の表面形状をＡＦＭにて観察した結果を示すものであり、（ａ）は表面形状の３次元イメージ図、（ｂ）は（ａ）中Ａ−Ｂ線における断面図である。（ａ）は２回目の陽極酸化処理後に得られた多孔質層（厚さ３μｍ）についてのＳＥＭ写真であり、（ｂ）は（ａ）中の細孔付近を拡大したＳＥＭ写真である。多孔質層上に金（Ａｕ）を蒸着して得られた分析用チップについて、開口面側の表面形状をＡＦＭにて観察した結果を示すものであり、（ａ）は表面形状の３次元イメージ図、（ｂ）は（ａ）中Ａ−Ｂ線における断面図である。（ａ）は本発明の分析用チップを用いてグルコース溶液を分析して得られた吸収スペクトルであり、（ｂ）は（ａ）に示す吸収スペクトルのうち波長８００ｎｍ〜８４５ｎｍの拡大図である。（ａ）は金属層のない分析用チップを用いてグルコース溶液を分析して得られた吸収スペクトルであり、（ｂ）は（ａ）に示す吸収スペクトルのうち波長８０５ｎｍ〜８３５ｎｍの拡大図である。（ａ）はグルコース濃度と吸光度変化量との関係を示す図であり、（ｂ）はグルコース濃度と波長シフト変化量との関係を示す図である。本発明の分析用チップを用い、多孔質層の膜厚を種種変化させたときに得られる吸収スペクトルである。多孔質層の膜厚と吸収ピークの平均値との関係、及び、多孔質層の膜厚と波長４００ｎｍ〜８５０ｎｍで現れた吸収ピーク数との関係を示す図である。膜厚３μｍの多孔質層を持つ分析用チップを用い、プローブＤＮＡに対する相補的ＤＮＡやミスマッチＤＮＡ等をハイブリダイゼーションした後に分析して得られた吸収スペクトルである。（ａ）は多孔質層の膜厚と金属層へのプローブＤＮＡの固定化後又は相補的ＤＮＡの結合後における吸光度変化との関係を示す図であり、（ｂ）は多孔質層の膜厚と金属層へのプローブＤＮＡの固定化後又は相補的ＤＮＡの結合後における波長シフトとの関係を示す図である。（ａ）は各種濃度のサンプルＤＮＡ溶液を本発明の分析用チップを用いて測定して得られた吸収スペクトルであり、（ｂ）は（ａ）に示す吸収スペクトルのうち波長８００ｎｍ〜８４０ｎｍの拡大図である。（ａ）はターゲットＤＮＡ濃度と吸光度変化との関係を示す図であり、（ｂ）はターゲットＤＮＡ濃度と波長シフトとの関係を示す図である。

符号の説明

１分析用チップ、２基材、３多孔質層、４開口面、５金属層、６細孔、１１酸化膜、１２陽極酸化アルミナ皮膜、１３孔、２１蒸着装置、２２真空容器、２３ステージ、２４蒸着源、２５チップ、３１分析装置、３２入射光ファイバ、３３反射光検出ファイバ、３４光学プローブ、３５タングステンハロゲン光源、３６分光光度計

Claims

互いに平行な方向に延びる多数の細孔が略等間隔に配列され、前記細孔が一方の面に開口した陽極酸化アルミナ皮膜である多孔質層と、前記多孔質層の開口面上に形成された金属層とを備え、前記金属層が前記多孔質層の開口面上と前記細孔の開口部近傍の内壁上方の孔壁面とに形成され、前記細孔の内部に金属微粒子が存在しない分析用チップであり、
当該分析用チップ表面への物質の吸着又は堆積が、当該分析用チップに光を照射したとき、局在プラズモン共鳴及び干渉効果による吸光度変化と波長シフトとして観察されることを特徴とする分析用チップ。
前記陽極酸化アルミナ皮膜は、アルミニウムの陽極酸化と、前記陽極酸化により形成された陽極酸化皮膜を除去するエッチングと、前記エッチングにより露出したアルミニウムの陽極酸化とをこの順に行うことにより形成されたものであることを特徴とする請求項１記載の分析用チップ。
前記金属層は、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｉから選ばれる少なくとも１種を含む下地層と、Ａｕ、Ａｇから選ばれる少なくとも１種を含む表面層とをこの順に積層して構成されることを特徴とする請求項１又は２記載の分析用チップ。
互いに平行な方向に延びる多数の細孔が略等間隔に配列され、前記細孔が一方の面に開口した多孔質層を形成した後、前記多孔質層の開口面上と前記細孔の開口部近傍の内壁上方の孔壁面とに金属層を形成し、前記細孔の内部に金属微粒子が存在しないようにするために、真空容器内のステージ上に金属層の原料を収容した蒸着源が載置され、前記細孔の開口面を下向きとして複数のチップを支持可能な構成として、前記細孔の内壁上方の孔壁面に対して傾いた方向から金属材料を被着することを特徴とする分析用チップの製造方法。
アルミニウムの陽極酸化による多孔質層は、アルミニウムの陽極酸化と、前記陽極酸化により形成された陽極酸化皮膜を除去するエッチングと、前記エッチングにより露出したアルミニウムの陽極酸化とをこの順に行うことにより前記多孔質層を形成することを特徴とする請求項４記載の分析用チップの製造方法。
前記金属層として、Ｃｒ、Ｔｉ、Ｎｉから選ばれる少なくとも１種を含む下地層と、Ａｕ、Ａｇから選ばれる少なくとも１種を含む表面層とをこの順に積層形成することを特徴とする請求項４又は５記載の分析用チップの製造方法。
請求項１〜３のいずれか１項記載の分析用チップと、光源と、検出器と、分光器とを備えることを特徴とする分析装置。
前記請求項７記載の分析装置を用い、局在プラズモン共鳴及び干渉効果による吸光度変化と波長シフトとの両方に基づいて試料中の対象物質を検出又は定量することを特徴とする分析方法。