CN113072608A - 三萜皂苷类化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及三萜皂苷类结构及其用途，具体涉及5个新三萜类化合物及其制备方法和在制备预防或治疗神经退行性疾病药物领域中的应用，所述化合物的结构如下：

Description

三萜皂苷类化合物及其用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及文冠果种皮中三萜皂苷类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
文冠果(Xanthoceras sorbifolia)无患子科(Sapindaceae)文冠果属植物，单属单种。主要分布于我国东北、华北及陕西、甘肃等地的丘陵山坡等，各地亦常有栽培品。
文冠果心材、茎枝和果实等均可入药，其茎枝(文冠木)是传统蒙药，蒙药名为西拉·森登，能祛风湿，消肿止痛，主要用于治疗风湿性关节炎，曾列入《中华人民共和国药典》。文冠果中的化学成分具有抗氧化及改善学习记忆等多方面生物活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一系列三萜皂苷类化合物及其制备方法和医药用途。
本发明提供了三萜皂苷类化合物，其具有如下结构：
Figure BDA0002354453790000011
R1代表氢、β-D-吡喃葡萄糖基、2-当归酰基-β-D-吡喃葡萄糖基、3-当归酰基-β-D-吡喃葡萄糖基、β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-2-当归酰基-β-D-吡喃葡萄糖基；
R2代表氢、β-D-吡喃葡萄糖基、α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基；
R3代表氢或乙酰基。
具体包括以下5个三萜皂苷类化合物：
Figure BDA0002354453790000021
本发明还提供了所述的三萜类化合物1-5的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)文冠果(Xanthoceras sorbifolia)的种皮60％～95％乙醇提取，回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得粗提物经水溶解后，采用大孔吸附树脂法进行分离，依次采用30％～95％乙醇(30％、50％、70％、95％)洗脱，得到不同极性洗脱物；
(3)上述步骤(2)中所得不同极性洗脱物采用硅胶柱色谱法分离，以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂100：1～1：1、石油醚和丙酮混合溶剂100：1～1：1、氯仿和丙酮混合溶剂100：1～100：10、二氯甲烷和丙酮混合溶剂100：1～100：10、氯仿和甲醇混合溶剂100：1～100：10、二氯甲烷和甲醇混合溶剂100：1～100：10梯度洗脱；
(4)上述步骤(3)中各溶剂系统所得100:1～100:25流分经ODS柱色谱分离，以甲醇和水混合溶剂，或以乙腈和水混合溶剂为流动相梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇和水1:1～9:1、乙腈和水2:8～7:3洗脱物经制备型HPLC-UV进一步分离，以甲醇和水混合溶剂4:6～8:2，或以乙腈和水3:7～7:3混合溶剂为流动相梯度洗脱，得到化合物1-5；
本发明提供的所述三萜皂苷类化合物1-5的制备方法，步骤(1)中所述提取方法为加热回流提取或加热超声提取1～3次，所用溶剂为60％～95％的乙醇，优选75％～95％乙醇。药材：溶剂的重量体积比为1:5～1:20g/mL，优选1:10～1：15。
本发明提供的所述三萜类化合物1-5的制备方法，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂分离法，采用水溶解粗提物，采用30％～95％乙醇洗脱依次洗脱，优先采用60％～95％的乙醇洗脱，减压回收以上有机溶剂。
本发明提供的所述三萜类化合物1-5的制备方法，步骤(3)中所述洗脱溶剂石油醚和乙酸乙酯混合溶剂、石油醚和丙酮混合溶剂的体积比例为100：1～1：1，优选100：4～5：1；二氯甲烷和丙酮混合溶剂、氯仿和丙酮混合溶剂、二氯甲烷和甲醇混合溶剂、或氯仿和甲醇的混合溶剂的体积比例为100：1～100：10，优选100:1～100:6。
本发明提供的所述三萜类化合物1-5的制备方法，步骤(4)中所述甲醇和水混合溶剂的体积比例为1:1～9:1，优选6:4～8:2；乙腈和水混合溶剂的体积比例为2:8～7:3，优选4:6～6:4。
本发明提供的所述三萜类化合物1-5的制备方法，步骤(5)所述的甲醇和水混合溶剂、乙腈和水混合溶剂，其中甲醇和水混合溶剂的体积比例为：1:1～9:1，优选6:4～8:2；乙腈和水混合溶剂的体积比例为3:7～8:2，优选4:6～6:4。
本发明以LPS诱导BV2小胶质细胞过度活化模型，对制备得到的新三萜类化合物1-5的抗神经炎症活性进行了评价。结果显示，新化合物1-5能够抑制LPS诱导的过度活化的BV2小胶质细胞NO的释放，表现出中等强度的抗神经炎症活性。因此，本发明中制备的三萜类化合物可在开发治疗神经退行性疾病药物方面应用。
本发明首次提供了以文冠果种皮为原料，制备、鉴定5个三萜类化合物的方法，并评价了其神经保护方面的活性，阐明了其在开发和治疗神经退行性疾病药物方面的应用。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此限制本发明。
实施例1
(1)文冠果种皮20kg用60％乙醇提取3次，每次2小时(用量为250L)，减压回收提取液得粗提物1.9kg；
(2)上述步骤(1)所得60％乙醇粗提物用D101大孔吸附树脂进行富集，采用30％、50％、70％、95％乙醇洗脱，收集50％-70％乙醇洗脱物175.0g；
(3)步骤(2)中60％-70％乙醇洗脱物经硅胶柱色谱分离，依次以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂100:1，100:3，100:8，100:10，1:1洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的石油醚和乙酸乙酯100:3-100:10流分经ODS色谱，用30:70，40:60，50:50，70:30，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(60:40～90:10)流分经HPLC-UV色谱分离制备，210nm检测，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝60:40，得到1(tR＝45min)(收率为0.0002％)、2(tR＝47min)(收率为0.00003％)、3(tR＝48min)(收率为0.00005％)、4(tR＝50min)(收率为0.0002％)、5(tR＝51min)(收率为0.0003％)。
根据化合物1-5的理化性质和波谱数据鉴定了其结构。
化合物1的结构鉴定数据如下：
白色粉末(甲醇)，HRESI-MS给出准分子离子峰[M-H]-m/z：797.4619(calcd.797.4687for C42H69O14)，其分子式为C42H70O14。1H-NMR(600MHz,C5D5N)高场区给出7个特征的甲基信号：δH 0.85(Me-25)，0.95(Me-24)，1.02(Me-26)，1.23(Me-30)，1.25(Me-29)，1.29(Me-27)，1.33(Me-23)；低场区给出2个糖端基氢信号：δH 4.95(1H,d,J＝7.6Hz,H-1')，4.98(1H,d,J＝7.7Hz,H-1”)。13C-NMR(150MHz,C5D5N)：共给出42个碳信号，其中7个甲基信号：δC 16.0(Me-25)，17.3(Me-24)，17.4(Me-26)，19.7(Me 30)，26.6(Me-27)，28.6(Me-23)，30.7(Me-29)；齐墩果烷型三萜C-12,13位双键特征碳信号：δC 124.0(C-12)，143.8(C-13)；4个三萜母核上连氧碳信号：δC 74.7(C-28)，75.1(C-22)，77.2(C-21)，89.1(C-3)；2个葡萄糖端基碳信号：δC 105.8，107.2。结合1D NMR数据分析，该化合物与已知化合物16-deoxybarringtogenol C的核磁数据较为相似，差别仅在于化合物1的C-3位向低场位移10.7、C-28位向低场位移6.3ppm，且可观测到增加了两组葡萄糖基碳信号，提示化合物1的C-3位和C-28位连糖基。进一步经酸水解确定为D-葡萄糖，根据糖端基偶合常数可知为β-D-葡萄糖。HMBC谱中δH 1.25(Me-29)，1.23(Me-30)同时与δC 77.2(C-21)相关，δH 3.81(H-21)，4.15(H-28)与δC 75.1(C-22)相关，推测21,22位同时被羟基取代；且δH 3.40(H-3)与端基碳δC 107.2相关确证3位连接糖基片段；δH 4.98和δC 74.7(C-28)观测到远程相关，提示C-28位糖苷化。综上，鉴定该化合物1为3,28-di-O-β-D-diglucopyranosyl-16-deoxybarringtogenol C。
化合物2的结构鉴定数据如下：
白色粉末(甲醇)，HRESI-MS给出准分子离子峰[M+Na]+m/z：805.4725(calcd.805.4714 for C42H70NaO13)，其分子式为C42H70O13。1H-NMR(400MHz,C5D5N)高场区给出7个特征的甲基信号：δH 0.96(Me-25)，1.05(Me-24)，1.14(Me-26)，1.19(Me-30)，1.21(Me-29)，1.24(Me-23)，1.28(Me-27)，低场区给出2个糖端基氢信号：δH 4.75(1H,d,J＝7.6Hz)，6.61(1H,br s)。13C-NMR(150MHz,C5D5N)：共给出42个碳信号，包括8个甲基信号：δC16.1(Me-25)，16.8(Me-24)，17.1(Me-26)，19.2(Me-6”)，19.9(Me-30)，26.5(Me-27)，29.0(Me-23)，30.7(Me-29)；其中δC 19.2为鼠李糖末端甲基信号；齐墩果烷型三萜C-12,13位双键特征碳信号：δC 124.0，143.5；2组糖端基碳信号：δC 103.9，100.8；4个三萜母核上连氧碳信号：72.9(C-22)，75.0(C-28)，77.1(C-21)，78.3(C-3)为母核上的信号。结合1D NMR数据分析，该化合物与化合物1的核磁数据相似。HMBC谱中：δH 1.25(Me-29)，1.19(Me-30)同时与δC 77.1(C-21)相关，δH 3.81(H-21)，4.07(H-28)与δC 72.9(C-22)相关，推测21,22位同时被羟基取代，由偶合常数确定21,22位为反式偶合；δH 4.07(H-28)和δC 103.9观测到远程相关，提示C-28位糖苷化；由δH 4.30和δC 100.8相关，且与化合物1的28位葡萄糖信号相比，化合物2的葡萄糖的C-2'位向低场位移1.7，提示鼠李糖连在葡萄糖的C-2位，综上鉴定化合物2为28-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl-16-deoxybarringtogenolC。
化合物3的结构鉴定数据如下：
白色粉末(甲醇)，HRESI-MS给出准分子离子峰[M+Na]+m/z：1065.5643(calcd.1065.5610 for C53H86NaO20)，可知其分子式为C53H86O20。1H-NMR(400MHz,C5D5N)高场区给出7个特征的甲基信号：δH 0.91(Me-26)，1.03(Me-25)，1.03(Me-29)，1.06(Me-23)，1.09(Me-24)，1.17(Me-30)，1.21(Me-27)；1组当归酰基信号：δH 2.04(3H,br s)，2.12(1H,br d,J＝7.3Hz)，6.02(1H,br q,J＝7.3Hz)；低场区给出3个糖端基氢信号：δH 4.95(1H,d,J＝8.1Hz)，4.97(1H,d,J＝8.0Hz)，5.11(1H,d,J＝7.8Hz)。13C-NMR(150MHz,C5D5N)：共给出53个碳信号，其中7个特征的甲基信号：δC 16.3(Me-25)，17.1(Me-24)，17.3(Me-26)，20.7(Me-30)，26.6(Me-27)，28.5(Me-23)，30.0(Me-29)；齐墩果烷型三萜C-12,13位双键特征碳信号：δC 124.9(C-12)，142.5(C-13)；1组当归酰基信号：δC 16.5，21.5，129.0，138.4，167.5；3个糖端基碳信号：δC 104.4，105.8，105.8。经酸水解确定为D-葡萄糖，根据糖端基偶合常数可知为β-D-葡萄糖。HMBC谱，δH 4.95与δC 89.4(C-3)相关，确定C-3位糖苷化；δH5.11与δC 70.6，δH 4.86与δC 105.8互有远程相关，由此确定3位所连两个葡萄糖为1-6连接；由δH 5.65和δC 167.5相关确定当归酰基连在3位葡萄糖的C-2位；δH 4.97与δC 74.7存在远程相关，提示C-28位糖苷化。综上鉴定该化合物为3-O-[β-D-glucopyranosyl(1→6)](2'-O-angeloyl)-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosyl-16-deoxybarringtogenol。
化合物4的结构鉴定数据如下：
白色粉末(甲醇)，HRESI-MS给出准分子离子峰[M+Na]+m/z：1049.5669(calcd.1049.5661 for C53H86NaO19)，其分子式为C53H86O19。1H-NMR(600MHz,C5D5N)高场区给出齐墩果烷型三萜母核7个特征的甲基信号：δH 0.83(Me-25)，0.92(Me-26)，1.08(Me-23)，1.10(Me-24)，1.20(Me-30)，1.22(Me-29)，1.29(Me-27)；在低场区给出12位烯氢质子信号：δH 5.36(1H,br s,H-12)；1组当归酰基特征信号：δH 2.05(3H,br s)，2.12(3H,br d,J＝7.0Hz)，6.03(1H,br q,J＝7.0Hz)；3个糖端基氢信号：δH 4.74(1H,d,J＝8.0Hz)，4.98(1H,d,J＝7.9Hz)，6.63(1H,br s)；13C-NMR(150MHz,C5D5N)：共给出53个碳信号，其中7个甲基信号：δC 16.0(Me-25)，17.1(Me-24)，17.2(Me-26)，20.0(Me-30)，26.6(Me-27)，28.4(Me-23)，30.8(Me-29)；齐墩果烷型三萜C-12,13位双键特征碳信号：δC 124.0，143.5；1组当归酰基特征信号：δC 16.5，21.3，129.0，138.3，167.5；3个糖端基碳信号：δC 100.8，103.9，104.3。该化合物的苷元部分的信号与化合物3完全一致，表明化合物4与化合物3具有相同的苷元结构及糖基取代位置。化合物4的28位连的糖基信号与化合物2的28位糖基信号基本一致，确定28位连有葡萄糖和鼠李糖，且鼠李糖连在葡萄糖的C-2位。进一步经酸水解确定为D-葡萄糖、L-鼠李糖，根据糖端基偶合常数可知为β-D-葡萄糖。在化合物4的HMBC谱中，δH4.98和δC 89.2(C-3)相关，δH 4.72和δC 75.0(C-28)相关，推测C-3和C-28位连接糖基片段；由δH 5.71和δC 104.3，76.6相关，同时与δC 167.5有远程相关，确定当归酰基连在3位葡萄糖的C-2位；综上鉴定该化合物为3-O-(2'-O-angeloyl)-β-D-glucopyranosyl-28-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranosyl-16-deoxybarringtogenol C。
化合物5的结构鉴定数据如下：
白色粉末(甲醇)，HRESI-MS给出准分子离子峰[M+Na]+m/z：1091.5775(calcd.1091.5767for C55H88NaO20)，HRESI-MS给出准分子离子峰[M-H]-m/z：1067.5810(calcd.1067.5791 for C55H87O20)，其分子式为C55H88O20。1H-NMR(600MHz,C5D5N)高场区给出7个特征的甲基信号：δH 0.89(Me-25)，0.99(Me-24)，1.08(Me-30)，1.12(Me-26)，1.23(Me-29)，1.28(Me-27)，1.30(Me-23)；齐墩果烷型三萜12位特征烯氢信号：δH 5.57(1H,br s,H-12)；1组当归酰基特征信号：δH 1.88(3H,br s)，1.98(3H,br d,J＝7.2Hz)，5.86(1H,br q,J＝7.2Hz)，低场区给出3个糖端基氢信号：δH 4.65(1H,d,J＝8.0Hz)，4.96(1H,d,J＝7.7Hz)，6.65(1H,br s)；13C-NMR(150MHz,C5D5N)：共给出55个碳信号，其中7个甲基信号：δC16.1(Me-25)，17.0(Me-26)，17.3(Me-24)，20.6(Me-30)，26.6(Me-27)，28.5(Me-23)，30.0(Me-29)；齐墩果烷型三萜C-12,13位双键特征碳信号：δC 124.0(C-12)，143.0(C-13)；1组当归酰基信号：δC 16.3，21.2，129.4，137.1，168.6，以及乙酰基信号：21.5，171.5；3个糖端基信号：δC 100.7，103.7，107.1；该化合物与已知化合物3-O-(3'-O-angeloyl)-β-D-glucopyranosyl-28-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranosyl-16-deoxybarringtogenol C相比，1D NMR基本一致，差别仅在于化合物5多了一组乙酰基信号以及C-21位向低场位移2.7ppm，C-22向高场位移4.6ppm，确定C-21被乙酰化。HMBC谱中：δH4.96和δC 89.4(C-3)相关，δH 4.65和δC 73.9(C-28)相关，证明C-3，C-28位连接糖基片段；δH 5.38(H-21)与δC 171.5观测到远程相关，进一步证明乙酰基连在21位；综上鉴定该化合物为：21-acetyl-3-O-(3'-O-angeloyl)-β-D-glucopyranosyl-28-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranosyl-16-deoxybarringtogenol C。
表1.化合物1-5的1H NMR数据(DMSO-d6)
Figure BDA0002354453790000071
表2.化合物1-5的13C NMR数据(DMSO-d6)
Figure BDA0002354453790000081
Figure BDA0002354453790000091
实施例2
(1)文冠果种皮10kg用75％乙醇提取1次，(用量为50L)，减压回收提取液得粗提物0.8kg；
(2)上述步骤(1)所得75％乙醇粗提物用D101大孔吸附树脂进行富集，采用30％、50％、70％、95％乙醇洗脱，收集60％-95％乙醇洗脱物100.5g；
(3)步骤(2)中50％-70％乙醇洗脱物经硅胶柱色谱分离，依次以石油醚和丙酮混合溶剂100:1，100:3，100:8，100:10，1:1洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的石油醚和丙酮100:3-100:10流分经ODS色谱，用10:90，20:80，30:70，70:30，90:10乙腈-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得乙腈-水(40:60～60:40)流分经HPLC-UV色谱分离制备，210nm检测，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝80:20，得到1(tR＝23min)(收率为0.00023％)、2(tR＝27min)(收率为0.00004％)、3(tR＝28min)(收率为0.00005％)、4(tR＝30min)(收率为0.00025％)、5(tR＝31min)(收率为0.00033％)。
化合物结构鉴定见实例1。
实施例3
(1)文冠果种皮10kg用95％乙醇提取2次，(每次用量为200L)，减压回收提取液得粗提物1.2kg；
(2)上述步骤(1)所得95％乙醇粗提物用D101大孔吸附树脂进行富集，采用30％、50％、70％、95％乙醇洗脱，收集60％-95％乙醇洗脱物122.5g；
(3)步骤(2)中40％-95％乙醇洗脱物经硅胶柱色谱分离，依次以氯仿和丙酮混合溶剂100:1，100:3，100:5，100:8，1:1洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的氯仿和丙酮100:3-100:8流分经ODS色谱，用30:70，40:60，50:50，70:30，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得乙腈-水(30:70～70:30)流分经HPLC-UV色谱分离制备，210nm检测，流速为4mL/min，流动相为乙腈：水＝60:40，得到1(tR＝27min)(收率为0.0002％)、2(tR＝29min)(收率为0.00005％)、3(tR＝31min)(收率为0.00004％)、4(tR＝35min)(收率为0.00026％)、5(tR＝38min)(收率为0.0003％)。
化合物结构鉴定见实例1。
实施例4
(1)文冠果种皮10kg用75％乙醇提取1次，(用量为50L)，减压回收提取液得粗提物0.8kg；
(2)上述步骤(1)所得95％乙醇粗提物用D101大孔吸附树脂进行富集，采用30％、50％、70％、95％乙醇洗脱，收集60％-95％乙醇洗脱物122.0g；
(3)步骤(2)中40％-95％乙醇洗脱物经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和丙酮合溶剂100:1，100:3，100:5，100:7，1:1洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷和丙酮100:3-100:7流分经ODS色谱，用30:70，40:60，50:50，70:30，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(30:60～70:30)流分经HPLC-UV色谱分离制备，210nm检测，流速为4mL/min，流动相为乙腈：水＝55:45，得到1(tR＝30min)(收率为0.00021％)、2(tR＝33min)(收率为0.00003％)、3(tR＝37min)(收率为0.000052％)、4(tR＝39min)(收率为0.00023％)、5(tR＝42min)(收率为0.00031％)。
化合物结构鉴定见实例1。
实施例5
(1)文冠果种皮20kg用75％乙醇提取1次，(用量为100L)，减压回收提取液得粗提物1.45kg；
(2)上述步骤(1)所得95％乙醇粗提物用D101大孔吸附树脂进行富集，采用30％、50％、70％、95％乙醇洗脱，收集60％-95％乙醇洗脱物250.0g；
(3)步骤(2)中40％-95％乙醇洗脱物经硅胶柱色谱分离，依次以氯仿和甲醇合溶剂100:1，100:3，100:5，100:7，1:1洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的氯仿和甲醇100:3-100:7流分经ODS色谱，用30:70，40:60，50:50，70:30，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(30:60～70:30)流分经HPLC-UV色谱分离制备，210nm检测，流速为4mL/min，流动相为流动相为乙腈：水＝40:60，得到1(tR＝35min)(收率为0.00021％)、2(tR＝38min)(收率为0.00003％)、3(tR＝42min)(收率为0.000052％)、4(tR＝45min)(收率为0.00023％)、5(tR＝49min)(收率为0.00031％)。
化合物结构鉴定见实例1。
实施例6
(1)文冠果种皮20kg用95％乙醇提取2次，(每次100L)，减压回收提取液得粗提物1.44kg；
(2)上述步骤(1)所得95％乙醇粗提物用D101大孔吸附树脂进行富集，采用30％、50％、70％、95％乙醇洗脱，收集60％-95％乙醇洗脱物250.0g；
(3)步骤(2)中40％-95％乙醇洗脱物经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和甲醇合溶剂100:1，100:3，100:5，100:7，1:1洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷和甲醇100:3-100:7流分经ODS色谱，用30:70，40:60，50:50，70:30，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(30:60～70:30)流分经HPLC-UV色谱分离制备，210nm检测，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝70:30，得到1(tR＝26min)(收率为0.00023％)、2(tR＝29min)(收率为0.00004％)、3(tR＝32min)(收率为0.00005％)、4(tR＝35min)(收率为0.00025％)、5(tR＝39min)(收率为0.00033％)。
化合物结构鉴定见实例1。
实施例7实例1-6中制备新颖三萜1-5的抗神经炎症活性测试
(1)实验原理：小胶质细胞活化介导的慢性炎症反应是神经退行性疾病的发生、发展过程中的重要环节，抑制小胶质细胞的激活可能成为药物发现的一个新的靶点。LPS激活小胶质细胞释放NO、促炎症细胞因子和活性氧等。本实验通过建立体外LPS激活BV2小胶质细胞异常活化的筛选模型，以激活小胶质细胞释放NO为指标，评价新三萜皂苷类1-5抗炎活性。
(2)实验方法：
①小鼠小胶质细胞系BV2的培养
细胞培养和模型建立中使用的所有玻璃器皿及金属器械(培养瓶，移液管，溶液瓶等)，均经过121℃高压灭菌30min，以彻底去除污染的LPS。以DMEM培养基作为基础配制成内含10％胎牛血清及50μM 2-巯基乙醇的细胞培养液。小胶质细胞以约4×105cells/ml的浓度在5％CO2，37℃培养瓶中传代培养，至第三天贴壁细胞约占培养瓶底面积50-60％，以胰酶消化贴壁细胞，传代至另一培养瓶。以-80℃超低温冰箱冻存复苏后的BV2作为第一代，选择第3-8代BV2细胞进行实验。
②药物配制方法
测试化合物均为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，浓度为50mM，储存于-20℃。临用时用DMEM培养液将其进行稀释，依次稀释为100μM、30μM、10μM、1μM。DMSO终浓度<1‰。
③Griess法检测化合物对LPS激活小胶质细胞的抑制作用
取对数生长期的BV2小胶质细胞，用含5％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至3×105cells/ml，接种于96孔板内，100μl/well，于37℃，5％CO2的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成无血清的新鲜培养液，同时进行加药处理。每种化合物设剂量1、10、30、100μM与LPS共同作用。同时设空白对照。各给药组中LPS终浓度为100ng/ml。细胞加药后继续培养24h后，收集上清液，Griess比色法检测上清液中NO2-含量。
④MTT法检测化合物对小胶质细胞细胞成活率的影响
取对数生长期培养的BV2小胶质细胞，用含5％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至3×105cells/ml，接种于96孔板内，100μl/well，于37℃，5％CO2的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成新鲜培养液，同时进行加药处理。每种化合物设剂量1、10、30、100μM与LPS共同作用。同时设空白对照。各给药组中LPS终浓度为100ng/ml。细胞加药后继续培养24h，然后向细胞液中加入MTT溶液，10μl/well，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育3h，吸除培养液，然后加入100μl的DMSO溶液，测定其光密度OD值。数据处理，利用酶标仪相应软件进行数据处理，计算每一种样品6个孔OD值的平均值，利用平均值按如下公式计算细胞成活率(cell viability，CV％)。
细胞成活率％＝样品组OD值的平均值/空白对照组OD值的平均值×100％
⑤统计方法
全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’s test分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当p>0.05，方差是齐的，采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，当p<0.05，方差不齐，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。
⑥IC50的计算方法
将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50。
(3)实验结果：见表3
表3三萜类化合物1-5抑制小胶质细胞活化作用实验结果
Figure BDA0002354453790000121
显著性:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001与LPS诱导组相比；###P<0.001与对照组相比。
结果可知，实施例1-6中制备得到的新三萜类化合物1-5(100μM)能够显著的抑制LPS诱导的过度活化的BV2小胶质细胞NO的释放。

Claims (10)

1.三萜类化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于，具有如下结构通式：
Figure FDA0002354453780000011
其中，
R1代表氢、β-D-吡喃葡萄糖基、2-当归酰基-β-D-吡喃葡萄糖基、3-当归酰基-β-D-吡喃葡萄糖基、β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-2-当归酰基-β-D-吡喃葡萄糖基；
R2代表氢、β-D-吡喃葡萄糖基、α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基；
R3代表氢或乙酰基。
2.如下的三萜类化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于，其为以下结构中的一种或几种：
Figure FDA0002354453780000012
3.按照权利要求2所述三萜类化合物的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)文冠果(Xanthoceras sorbifolia)的种皮用乙醇溶剂提取，回收提取液得粗提物；
(2)步骤(1)所得粗提物经水溶解，采用大孔吸附树脂，用30％～95％乙醇洗脱得到不同极性的洗脱部位；
(3)上述步骤(3)中所得乙醇洗脱物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂、石油醚和丙酮混合溶剂、氯仿和丙酮混合溶剂、二氯甲烷和丙酮混合溶剂、氯仿和甲醇混合溶剂、二氯甲烷和甲醇混合溶剂梯度洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得100:1～100:25流分经ODS柱色谱分离，以甲醇和水混合溶剂，或以乙腈和水混合溶剂为流动相梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水1:1～9:1或乙腈-水2:8～7:3的流分经HPLC-UV色谱分离，以甲醇和水混合溶剂或乙腈和水混合溶剂为流动相梯度洗脱，制备得化合物1-5。
4.按照权利要求3所述的三萜类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的提取方法为加热回流提取或加热超声提取1～3次，乙醇的体积浓度为60％～95％的乙醇，药材：溶剂重量体积比为1:5～1:20g/mL。
5.按照权利要求3所述的三萜类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的所得粗提物经水溶解后，采用大孔吸附树脂法进行分离，依次采用60％～95％乙醇洗脱，得到不同极性洗脱物。
6.按照权利要求3所述的三萜类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂100：1～1：1、石油醚和丙酮混合溶剂100：1～1：1、氯仿和丙酮混合溶剂100：1～100：10、二氯甲烷和丙酮混合溶剂100：1～100：10、氯仿和甲醇混合溶剂100：1～100：10、二氯甲烷和甲醇混合溶剂100：1～100：10梯度洗脱。
7.按照权利要求3所述的三萜类化合物的制备方法，其特征在于步骤(4)中甲醇和水混合溶剂的体积比例为1:1～9:1，优选6:4～8:2；乙腈和水混合溶剂的体积比例为2:8～7:3，优选4:6～6:4。
8.按照权利要求3所述的三萜类化合物的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述的所得甲醇和水1:1～9:1、乙腈和水2:8～7:3洗脱物经制备型HPLC-UV进一步分离，以甲醇和水混合溶剂4:6～8:2，或以乙腈和水3:7～7:3混合溶剂为流动相梯度洗脱，得到化合物1-5。
9.一种药物组合物，包含权利要求1或2所述的三萜类化合物及其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
10.权利要求1或2所述的三萜类化合物及其药学上可接受的盐或权利要求9所述的药物组合物在制备预防和治疗神经退行性疾病药物中的应用。
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