CN113069553A - 一种硫酸软骨素化es2肽联合紫杉醇的结合物及其制备方法与应用 - Google Patents
一种硫酸软骨素化es2肽联合紫杉醇的结合物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种硫酸软骨素化ES2肽结合物及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明通过控制CYS、ES2肽和PTX的供给量，反应体系的pH，反应时间等条件，制备得到具有不同结合度的硫酸软骨素～胱胺‑ES2肽结合物和/或紫杉醇‑硫酸软骨素～胱胺‑ES2肽结合物。本发明的硫酸软骨素化ES2肽联合胱胺和紫杉醇的结合物与ES2肽相比，保留了ES2肽的抗血管生成和抗肿瘤活性，并整合了PTX的抗肿瘤作用，使得合成的结合物具有更高的稳定性、靶向性和生物活性，从而具有更好的使用效果和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种硫酸软骨素化ES2肽联合紫杉醇的结合物及其制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
内皮抑素(Endostatin，ES)是目前最有效的内源性血管生成抑制剂之一，它是XVIII型胶束的C端蛋白水解片段，能够有效抑制肿瘤周围的血管新生，从而抑制肿瘤的形成和转移，已被SFDA批准用于临床治疗。目前认为ES能够通过多种途径来影响血管生成的多个过程来达到抑制肿瘤血管形成的目的，以阻断肿瘤的营养供给。ES2(IVRRADRAAVP，SEQID NO.1)是ES中的一段由11个氨基酸组成的多肽序列，包含ES中的氨基酸60-70序列和三个表面暴露的精氨酸残基Arg62，Arg63和Arg66。ES2肽具有抑制内皮细胞增殖和迁移的生物活性，其对血管生成的抑制能力要明显优于ES，因此，ES2在肿瘤、类风湿性关节炎、糖尿病眼部疾病等与新血管生成有密切联系的疾病的治疗中具有重要作用。但ES2肽也具有一些多肽类药物普遍具有的缺点，如半衰期短、稳定性差等，这严重阻碍了其在临床中的应用。
综上，现有的多肽类新生血管抑制剂多存在体内半衰期短、稳定性差、靶向性低等问题，限制了多肽类药物在制备血管生成抑制剂中的应用。因此，本领域迫切需要开发一种新型的多肽类血管生成抑制剂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种硫酸软骨素化ES2肽联合紫杉醇的结合物及其制备方法与应用。本发明成功制备得到具有不同结合度的硫酸软骨素～胱胺-ES2肽结合物和/或紫杉醇-硫酸软骨素～胱胺-ES2肽结合物，其同时具有良好的稳定性和生物活性。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种硫酸软骨素化ES2肽结合物，，其由胱胺中的氨基通过酰胺化反应与硫酸软骨素中的羧基相连后，ES2肽的羧基再次通过酰胺化反应与胱胺中游离的氨基结合而成，其结构式如下：
CS-CYS-(ES2)n；
式中，n＝30～60；ES2的分子量为1223Da，CS的分子量为30kDa。
本发明中的硫酸软骨素化ES2肽联合胱胺结合物与ES2肽相比，增强了ES2肽的抗血管生成和抗肿瘤活性，整合了大分子硫酸软骨素在肿瘤组织中的靶向性，使得获得的结合物生物活性更强，靶向性更高，稳定性更强，因而表现出了较好的应用潜力。
进一步的，所述硫酸软骨素化ES2肽结合物还修饰有紫杉醇，具体的，其由胱胺上的氨基通过酰胺键与硫酸软骨素上的羧基连接，紫杉醇的羟基通过酯键与硫酸软骨素上的羧基相连以及ES2肽的羧基通过酰胺键与胱胺上的游离氨基连接形成，结构式如下：
(PTX)n1-CS-CYS-(ES2)n2；
式中，n1＝1～13，n2＝30～50，ES2的分子量为1223Da，等电点为10.42，硫酸软骨素的分子量为30kDa。
胱胺(CYS)的供给量会影响胱胺与硫酸软骨素(CS)的结合度，本发明对CYS的供给量进行了优化考察，综合考虑了对CS空间构象的影响，紫杉醇与硫酸软骨素的结合度以及ES2与硫酸软骨素的结合度，优选胱胺供给量占据硫酸软骨素二糖单元的80％。
ES2肽的供给量(即上述结构式中的n2)会影响与CYS的结合度，本发明对ES2的供给量进行了优化考察，综合考虑了对CS空间构象的影响，紫杉醇与硫酸软骨素的结合度以及ES2与硫酸软骨素的结合度，优选n2＝48。
紫杉醇(PTX)的供给量(即上述结构式中的n1)会影响与CS的结合度，本发明对PTX的供给量进行了优化考察，综合考虑了对CS空间构象的影响，紫杉醇与硫酸软骨素的结合度以及ES2与硫酸软骨素的结合度，优选n1＝3。
本发明的第二个方面，提供上述硫酸软骨素化ES2肽结合物的制备方法，包括：
1)当所述硫酸软骨素化ES2肽结合物为CS～CYS-ES2时，其制备方法为：
S1、制备CS～CYS结合物：将CS溶于水中，加入EDCI和NHS作为催化剂活化CS中的羧基，活化完成后加碱液调节pH至弱碱性，然后缓慢加入CYS溶液进行反应，反应完成后，反应产物经纯化即得CS～CYS结合物；
S2、制备CS～CYS-ES2结合物：将ES2溶于水中，加入EDCI和NHS作为催化剂，活化羧基后，缓慢加入CS～CYS溶液继续反应，反应结束后，反应产物经纯化后即得CS～CYS-ES2结合物。
2)当所述硫酸软骨素化ES2肽结合物为PTX-CS～CYS-ES2时，其制备方法为：
S1、制备CS～CYS结合物：将CS溶于水中，加入EDCI和NHS作为催化剂活化CS中的羧基，活化完成后加碱液调节pH至弱碱性，然后缓慢加入CYS溶液进行反应，反应完成后，反应产物经纯化即得CS～CYS结合物；
S2、制备CS～CYS-TBA结合物：将CS～CYS溶于水中，加入Dowex离子交换树脂，搅拌后过滤除去树脂，使用TBA溶液调整CS～CYS溶液pH至中性或弱碱性，冻干即得到CS～CYS-TBA结合物。
S3、制备PTX-CS～CYS结合物：将CS～CYS-TBA溶于有机溶剂中，添加DCC和DMAP作为催化剂进行催化反应，然后缓慢加入PTX溶液，继续反应，反应结束后，反应产物经纯化后即得PTX-CS～CYS结合物。
S4、制备PTX-CS～CYS-ES2结合物：将ES2溶于水中，加入EDCI和NHS作为催化剂，以活化羧基，活化后，缓慢加入上述PTX-CS～CYS溶液继续反应，反应结束后，反应产物经纯化后即得PTX-CS～CYS-ES2结合物。
本发明的第三个方面，提供上述硫酸软骨素化ES2肽结合物在制备抗新生血管生成相关疾病的药物和/或抗肿瘤药物中的用途。
其中，所述新生血管生成相关疾病包括但不限于糖尿病视网膜病变、老年性黄斑病变和关节炎等；
所述肿瘤包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌等实体瘤。
本发明的第四个方面，提供一种抗新生血管生成相关疾病的药物和/或抗肿瘤药物，所述药物其包含上述硫酸软骨素化ES2肽结合物，还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。
与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：
(1)上述技术方案通过控制CYS、ES2肽和PTX的供给量，反应体系的pH，反应时间等条件，可以制备得到不同结合度的PTX-无抗凝活性肝素～CYS-ES2肽结合物。
(2)上述技术方案制备的CS～CYS-ES2/PTX-CS～CYS-ES2结合物与ES2肽相比，其具有更高的稳定性和生物活性，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：CS～CYS-ES2结合物的核磁共振氢谱图；
图2：PTX-CS～CYS-ES2结合物的核磁共振氢谱图；
图3：ES2、CS～CYS-ES2和PTX-CS～CYS-ES2结合物对内皮细胞增殖的抑制作用；
图4：ES2、CS～CYS-ES2和PTX-CS～CYS-ES2结合物对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用；
图5：ES2、CS～CYS-ES2和PTX-CS～CYS-ES2结合物对内皮细胞迁移的抑制作用；
图6：ES2、CS～CYS-ES2和PTX-CS～CYS-ES2结合物对内皮细胞管腔形成的抑制作用；
图7：ES2、CS～CYS-ES2和PTX-CS～CYS-ES2结合物对黑色素瘤细胞侵袭的抑制作用；
图8：CS～CYS-ES2和PTX-CS～CYS-ES2结合物环境响应性释放行为评价。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
在生物体正常组织内，前血管生成因子(如血管内皮生长因子VEGF)和抗血管生长因子(如血小板反应蛋白-1)共同调控血管生成过程，维持体内血管平衡。但在肿瘤组织内，血管平衡被打破，朝着促进血管生成的方向发展。肿瘤细胞可以释放大量的促血管生成因子，吸引内皮细胞，并促进其增殖和迁移以形成新的血管来为肿瘤组织提供营养物质。基于此，通过阻断肿瘤组织内新生血管的形成来阻断肿瘤组织中的营养供给就可以抑制肿瘤的生长。
因此，本发明提供硫酸软骨素化ES2肽联合胱胺和紫杉醇的结合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种硫酸软骨素化ES2肽结合物，其由胱胺中的氨基通过酰胺化反应与硫酸软骨素中的羧基相连后ES2肽的羧基再次通过酰胺化反应与胱胺中游离的氨基结合而成，结构式如下：
CS-CYS-(ES2)n；
式中，n＝30～60；ES2的分子量为1223Da，CS的分子量为30kDa。
本发明中的硫酸软骨素化ES2肽联合胱胺结合物与ES2肽相比，增强了ES2肽的抗血管生成和抗肿瘤活性，整合了大分子硫酸软骨素在肿瘤组织中的靶向性，使得获得的结合物生物活性更强，靶向性更高，稳定性更强，因而表现出了较好的应用潜力。
本发明的又一具体实施方式中，所述硫酸软骨素化ES2肽结合物还修饰有紫杉醇，具体的，其由胱胺上的氨基通过酰胺键与硫酸软骨素上的羧基连接，紫杉醇的羟基通过酯键与硫酸软骨素上的羧基相连以及ES2肽的羧基通过酰胺键与胱胺上的游离氨基连接形成，结构式如下：
(PTX)n1-CS-CYS-(ES2)n2；
式中，n1＝1～13，n2＝30～50，ES2的分子量为1223Da，等电点为10.42，硫酸软骨素的分子量为30kDa。
本发明中的硫酸软骨素化ES2肽联合胱胺和紫杉醇的结合物与CS-CYS-ES2和ES2肽相比，具有更强的抗血管生成活性和抗肿瘤活性，整合了大分子硫酸软骨素在肿瘤组织中的靶向性和紫杉醇的抗肿瘤活性，使得获得的结合物具有更强的抗肿瘤作用，更为稳定的结构，亲水性更强，因而在抗肿瘤领域表现出了更好的使用效果和应用价值。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述硫酸软骨素化ES2肽结合物的制备方法，包括：
当所述硫酸软骨素化ES2肽结合物为CS～CYS-ES2时，其制备方法为：
S1、制备CS～CYS结合物：采用CYS作为中间连接体连接ES2和CS，使ES2在肿瘤微环境中可以从CS～CYS-ES2结合物中释放出来，成为游离状态，快速到达肿瘤周围内皮细胞发挥抗血管生成作用。具体制备方法为：将CS溶于水中，加入EDCI和NHS作为催化剂活化CS中的羧基，活化完成后加碱液调节pH至弱碱性，然后缓慢加入CYS溶液进行反应，反应完成后，反应产物经纯化即得CS～CYS结合物；
S2、制备CS～CYS-ES2结合物：将ES2溶于水中，加入EDCI和NHS作为催化剂，活化羧基后，缓慢加入上述CS～CYS溶液继续反应，反应结束后，反应产物经纯化后即得CS～CYS-ES2结合物。
所述步骤S1中，调节pH至弱碱性具体为加入碱液(如NaOH)调节pH至7.40左右；加入CYS溶液后反应时间控制为8～15h，优选为10h；反应产物纯化包括透析和干燥步骤。
所述步骤S2中，活化时间控制为10-60min，优选为45min；缓慢加入上述CS～CYS溶液继续反应，反应时间控制为12～48h，优选为24h；反应产物纯化步骤包括透析、干燥。
当所述硫酸软骨素化ES2肽结合物为PTX-CS～CYS-ES2时，其制备方法为：
S1、制备CS～CYS结合物：采用CYS作为中间连接体连接ES2和CS，使ES2在肿瘤微环境中可以从PTX-CS～CYS-ES2结合物中释放出来，成为游离状态，快速到达肿瘤周围内皮细胞发挥抗血管生成作用；具体制备方法包括：将CS溶于水中，加入EDCI和NHS作为催化剂活化CS中的羧基，活化完成后调节pH至弱碱性，然后缓慢加入CYS溶液进行反应，反应完成后，反应产物经纯化即得CS～CYS结合物；
S2、制备CS～CYS-TBA结合物：将上述CS～CYS溶于水中，加入Dowex离子交换树脂，搅拌后过滤除去树脂，使用TBA溶液调整CS～CYS溶液pH至弱碱性，冻干即得到CS～CYS-TBA结合物。其中，TBA的添加可以改善CS～CYS在有机溶剂中的溶解性，使CS～CYS溶于有机溶剂。
S3、制备PTX-CS～CYS结合物：将上述CS～CYS-TBA溶于有机溶剂中，添加DCC和DMAP作为催化剂进行催化反应，然后缓慢加入PTX溶液，继续反应，反应结束后，反应产物经纯化后即得PTX-CS～CYS结合物。
S4、制备PTX-CS～CYS-ES2结合物：将ES2溶于水中，加入EDCI和NHS作为催化剂，以活化羧基，活化后，缓慢加入上述PTX-CS～CYS溶液继续反应，反应结束后，反应产物经纯化后即得PTX-CS～CYS-ES2结合物。
所述步骤S1中，调节pH至弱碱性具体为加入碱液(如NaOH)调节pH至7.40左右；加入CYS溶液后反应时间控制为8～15h，优选为10h；反应产物纯化包括透析和干燥步骤。
所述步骤S2中，所述有机溶剂可以为二氯甲烷或二甲基亚砜(DMSO)；加入等量Dowex离子交换树脂后进行搅拌，搅拌时间控制为8～10h，优选为10h；所述TBA溶液浓度控制为15-25％(优选为20％)；使用TBA溶液调整CS～CYS溶液pH至中性或弱碱性具体为使用20％的TBA溶液调整CS～CYS溶液pH至7.07。
所述步骤S3中，催化反应控制时间为20-60min，优选为45min；加入PTX溶液后，反应时间控制为24～72h，优选为48h；反应产物纯化步骤包括透析、干燥；
本发明的又一具体实施方式中，反应产物的透析方法为：将反应产物倒入预处理的透析袋中，先用DMSO透析一天，再用水进行透析。
所述步骤S4中，活化时间控制为10-60min，优选为45min；缓慢加入上述PTX-CS～CYS溶液继续反应，反应时间控制为12～48h，优选为24h；反应产物纯化步骤包括透析、干燥。
本发明通过制备CS～CYS结合物，使得CYS成为CS与ES2的中间连接物。CYS中具有一个二硫键，此二硫键可以在肿瘤周围发生断裂，使得ES2从CS糖链中脱离出来。同时，通过制备CS～CYS-TBA结合物，改变CS的溶解性，使得原本不溶于有机溶剂的CS可以溶于诸如二氯甲烷等有机溶剂。
本发明通过制备PTX-CS～CYS结合物，能够改变紫杉醇的溶解性，使其溶于双蒸水中。
本发明通过优化反应催化剂的供给量，反应体系的pH，反应时间等条件，从而成功制备出半衰期延长、活性更强的硫酸软骨素化ES2肽联合胱胺和紫杉醇的结合物PTX-CS-CYS-ES2。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述硫酸软骨素化ES2肽结合物在制备抗新生血管生成相关疾病的药物和/或抗肿瘤药物中的用途。
其中，所述新生血管生成相关疾病包括但不限于糖尿病视网膜病变、老年性黄斑病变和关节炎等；
所述肿瘤包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌等实体瘤。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种抗新生血管生成相关疾病的药物和/或抗肿瘤药物，所述药物其包含上述硫酸软骨素化ES2肽结合物，还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物剂型为可注射埋植剂、乳剂、脂质体、微囊剂、微球剂、纳米粒等。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：硫酸软骨素化ES2肽联合胱胺结合物(CS-CYS-ES2)的制备
制备步骤如下：
(1)取适量CS溶于双蒸水中，获得CS溶液，然后向其中加入EDCI和NHS催化剂，比例为3：2，混匀，于室温条件下缓慢搅拌，搅拌完成后调pH值至7.41。用双蒸水溶解胱胺，获得胱胺溶液，然后将此溶液逐滴加入到CS溶液中，缓慢搅拌反应10h。反应完成后，将反应液转移到MWCO为1000Da的透析袋中用双蒸水透析两天，每4h换次水，以除去未反应的胱胺。透析完成后，收集反应液放入冷冻干燥机中冻干，获得CS-CYS结合物。
(2)将ES2短肽(采用固相合成法合成)溶于双蒸水中，获得ES2溶液，分别向其中加入EDCI和NHS，缓慢搅拌活化45min。取CS-CYS样品溶于10mL双蒸水中，获得CS-CYS溶液，并将此溶液逐滴加入到ES2溶液中，混匀，于室温条件下反应24h。反应完成后，将反应液转移至MWCO为5000Da的透析袋内用双蒸水透析两天，每4h换次水，以除去未反应的ES2。透析完成后，收集反应液置于冷冻干燥机内冻干，获得CS-CYS-ES2结合物。
实施例2：硫酸软骨素化ES2肽联合胱胺和紫杉醇的结合物(PTX-CS-CYS-ES2)的制备
制备步骤如下：
(1)取适量CS溶于双蒸水中，获得CS溶液，然后向其中加入EDCI和NHS催化剂，比例为3：2，混匀，于室温条件下缓慢搅拌，搅拌完成后调pH值至7.41。用双蒸水溶解胱胺，获得胱胺溶液，然后将此溶液逐滴加入到CS溶液中，缓慢搅拌反应10h。反应完成后，将反应液转移到MWCO为1000Da的透析袋中用双蒸水透析两天，每4h换次水，以除去未反应的胱胺。透析完成后，收集反应液放入冷冻干燥机中冻干，获得CS-CYS结合物。
(2)取适量CS-CYS样品溶于双蒸水中，然后向其中加入等量的
50WX8-400离子交换树脂，在室温条件下缓慢搅拌9h左右。反应结束后，利用0.45μm滤膜过滤反应液，以除去树脂，然后用20％TBA溶液调pH至7.07左右，置于冷冻干燥机中冻干，得到CS-CYS-TBA结合物。
(3)将适量CS-CYS-TBA用二氯甲烷溶解，然后向此溶液中分别加入DCC以及DMAP作为催化剂，振荡混匀后，在室温条件下活化45min。待活化完成后，向反应液中加入PTX，继续反应48h。反应结束后，将反应液放入MWCO为1000Da的透析袋中先用DMSO透析24h，然后换水透析三天，除去杂质。透析完成后，收集反应液置于冷冻干燥机内冻干，获得PTX-CS-CYS结合物。
(4)取适量ES2溶于双蒸水中，获得ES2溶液，然后向其中加入EDCI和NHS用作羧基催化剂，活化45min。然后，取PTX-CS-CYS溶于双蒸水中，并将其逐滴加入到反应液中，在室温条件下缓慢搅拌24h。反应完成后，将反应液转移至MWCO为5000Da的透析袋内用双蒸水透析两天，每4h换次水，以除去未反应的ES2。透析完成后，收集反应液置于冷冻干燥机内冻干，获得PTX-CS-CYS-ES2结合物。
采用1H NMR鉴定CS-CYS-ES2/PTX-CS-CYS-ES2结构，结果如图1和图2所示，已成功制备出CS-CYS-ES2/PTX-CS-CYS-ES2结合物。
实验例1：ES2肽、CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2结合物对内皮细胞增殖的抑制作用比较。
实验过程如下：
(1)实验药物：ES2肽、实施例1制备的CS-CYS-ES2结合物与实施例2制备的PTX-CS-CYS-ES2结合物，三组药物中ES2肽浓度一致。
(2)实验方法：将处在对数生长期的EAhy 926细胞收集起来，然后调整到合适的细胞浓度，按照每孔1×104个的数目接种到96孔板上，放入37℃CO2恒温培养箱内过夜培养。待细胞贴壁后，弃去原培养基，加入ES2，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2结合物，浓度为5μg/mL，25μg/mL,，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，300μg/mL，400μg/mL，500μg/mL，600μg/mL，800μg/mL(以ES2浓度为标准)，每种浓度设置8个复孔。设置只含有DMEM培养基的复孔为空白对照组，含有细胞但无药物孵育的复孔为阴性对照组。将含有药物的96孔板放入37℃CO2恒温培养箱内孵育48h。孵育完成后，在避光的环境中向96孔板中加入CCK-8溶液，每孔10μL，放入培养箱内孵育20min左右，待培养基颜色变为橙色后取出，然后用酶标仪检测450nm处的OD值，并计算细胞抑制率计算公式如下：抑制率＝[1-[(实验组-空白对照组)/(阴性对照组-空白对照组)]]×100％。
抑制内皮细胞增殖实验结果见图3。由图可以看出，ES2，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2均具有抑制内皮细胞增殖的作用，且随着肽浓度的升高，抑制作用也明显增强，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2的抑制作用要明显优于ES2，且PTX-CS-CYS-ES2对内皮细胞的抑制作用要略强于CS-CYS-ES2。
实验例2：ES2肽、CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2结合物对B16F10高转移黑色素瘤细胞增殖的抑制作用比较。
实验过程如下：
(1)实验药物：ES2肽、实施例1制备的CS-CYS-ES2结合物与实施例2制备的PTX-CS-CYS-ES2结合物，三组药物中ES2肽浓度一致。
(2)实验方法：将处在对数生长期的B16F10细胞收集起来，然后调整到合适的细胞浓度，按照每孔1×104个的数目接种到96孔板上，放入37℃CO2恒温培养箱内过夜培养。待细胞贴壁后，弃去原培养基，加入ES2，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2结合物，浓度为5μg/mL，25μg/mL,，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，300μg/mL，400μg/mL，500μg/mL，600μg/mL，800μg/mL(以ES2浓度为标准)，每种浓度设置8个复孔。设置只含有DMEM培养基的复孔为空白对照组，含有细胞但无药物孵育的复孔为阴性对照组。将含有药物的96孔板放入37℃CO2恒温培养箱内孵育48h。孵育完成后，在避光的环境中向96孔板中加入CCK-8溶液，每孔10μL，放入培养箱内孵育20min左右，待培养基颜色变为橙色后取出，然后用酶标仪检测450nm处的OD值，并计算细胞抑制率计算公式如下：抑制率＝[1-[(实验组-空白对照组)/(阴性对照组-空白对照组)]]×100％
抑制黑色素瘤细胞增殖实验结果见图4。由图可以看出，ES2，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2均具有抑制B16F10细胞增殖的作用，且随着肽浓度的升高，抑制作用液明显增强，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2药物浓度大于200μg/mL时，其抑制作用与ES2相比具有显著性差异，且PTX-CS-CYS-ES2对内皮细胞的抑制作用显著优于CS-CYS-ES2。
实验例3：ES2肽、CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2结合物对内皮细胞迁移的抑制作用比较。
实验过程如下：
(1)实验药物：ES2肽、实施例1制备的CS-CYS-ES2结合物与实施例2制备的PTX-CS-CYS-ES2结合物，三组药物中ES2肽浓度一致。
(2)实验方法：预先将200μL黄枪头放入4℃冰箱中过夜冷藏，并将直尺放到超净工作台中，用紫外灯照射30min。将处在对数生长期的EAhy 926细胞收集起来，然后调整到合适的细胞浓度，按照每孔20×104个的数目接种到12孔板上，放入37℃CO2恒温培养箱内过夜培养。待细胞贴壁长满后，从CO2恒温培养箱中取出12孔板放入超净工作台中，弃去培养基，PBS清洗两遍，然后用无菌直尺作为对照用预冷的黄枪头在孔内轻轻划过，形成一条无细胞的直线，每孔划3条线。划线后，加入PBS以洗去漂浮的细胞，加入ES2，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2结合物，浓度为200μg/mL，400μg/mL，600μg/mL(以ES2浓度为标准)，每组设置三个复孔。加完药后，再次将12孔板放入37℃CO2恒温培养箱中培养24h，时间到后，取出12孔板，置于倒置显微镜下拍照，以观察细胞迁移情况。实验重复5次，取平均值。
抑制内皮细胞迁移实验结果见图5。由图中可以看出，在培养24h后，对照组的划痕几乎完全愈合，而由ES2，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2处理后的内皮细胞迁移数目明显减少，与对照组相比具有显著性差异。因此，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2均可以显著抑制内皮细胞的迁移，且PTX-CS-CYS-ES2的抑制效果更好。
实验例4：ES2肽、CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2结合物对内皮细胞管腔形成的抑制作用比较。
实验过程如下：
(1)实验药物：ES2肽、实施例1制备的CS-CYS-ES2结合物与实施例2制备的PTX-CS-CYS-ES2结合物，三组药物中ES2肽浓度一致。
(2)实验方法：预先将200μL黄枪头和48孔板放入4℃冰箱中过夜冷藏，并将Matrigel基质胶放入4℃冰箱内融化。预先将融化好的基质胶均匀的铺在预冷的48孔板内，100μL/孔，然后将48孔板放入4℃冰箱中孵育30min以除去气泡，胶均匀铺开以后将48孔板放入37℃CO2恒温培养箱内孵育45min至胶凝固。将处在对数生长期的EAhy926内皮细胞收集起来，然后调整到合适的细胞浓度，按照每孔8×104个的数目接种到48孔板上，加入ES2，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2结合物，浓度为200μg/mL，400μg/mL，600μg/mL(以ES2浓度为标准)，每孔再加入终浓度为5ng/mL的bFGF，每组设置三个复孔。将48孔板放入37℃CO2恒温培养箱内孵育4-8h，取出48孔板置于倒置显微镜下观察内皮细胞管腔形成情况，实验重复5次。
抑制内皮细胞管腔形成实验结果见图6。由图可知，ES2，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2结合物均能够显著抑制管腔的形成，细胞在基质胶上层成单层贴壁状态，只有少量的管状结构。对各组管腔的分支或节点数进行统计，发现CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2结合物均具有显著性抑制管腔形成能力，抑制能力强于ES2肽，且在同等浓度下，PTX-CS-CYS-ES2表现出更好的抑制效果。
实验例5：ES2肽、CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2结合物对黑色素瘤细胞侵袭抑制作用比较。
实验过程如下：
(1)实验药物：ES2肽、实施例1制备的CS-CYS-ES2结合物与实施例2制备的PTX-CS-CYS-ES2结合物，三种药物中ES2肽浓度一致。
(2)实验方法：预先将200μL黄枪头放入4℃冰箱中过夜冷藏，并将Matrigel基质胶放入4℃冰箱内融化。取适量的融化后的基质胶与无血清的RPMI-1640培养基按照1:7的比例稀释。将稀释后的基质胶添加到24孔板Transwell小室的上层，然后将24孔板放入37℃CO2恒温培养箱内孵育至胶凝固。胶凝固以后，从培养箱中取出24孔板，用无血清的RPMI-1640培养基冲洗上层小室。冲洗完成后，将小室倒置，在其下方涂抹10μL纤粘蛋白FN，晾干。将处在对数生长期的B16F10黑色素瘤细胞收集起来，调整细胞浓度为8×104/孔，然后将ES2，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2三种药物按照200μg/mL，400μg/mL，600μg/mL(以ES2浓度为标准)与细胞悬液混匀后加到铺有Matrigel基质胶的Transwell上室内，100μL/室，每种药物设置三个复孔，并向Transwell下室加入600μL RPMI-1640培养基，然后将24孔板放入37℃二氧化碳培养箱内孵育30h。孵育完成后，取出小室，弃去上层的培养基，然后用棉棒轻轻拭去基质胶和未过膜的细胞，加入PBS清洗2min，然后将小室置于4％多聚甲醛内固定35min。固定结束后，将小室用PBS漂洗一遍，后置于0.1％的结晶紫染液中染色45min。染色结束后，用PBS漂洗小室两遍，晾干后置于倒置荧光显微镜下拍照，重复实验5次。
抑制黑色素瘤细胞侵袭实验结果见图7。由图可以看出，ES2，CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2均可以显著抑制B16F10黑色素瘤细胞的侵袭，且PTX-CS-CYS-ES2的抑制能力要明显强于ES2和CS-CYS-ES2，这是由于PTX的存在增加了其抗肿瘤的能力，此外，CS-CYS-ES2对B16F10细胞侵袭的抑制能力也强于ES2，并表现为显著性差异。
实验例6：CS-CYS-ES2和PTX-CS-CYS-ES2结合物环境响应性释放行为评价。
实验过程如下：
(1)实验药物：ES2肽、实施例1制备的CS-CYS-ES2结合物与实施例2制备的PTX-CS-CYS-ES2结合物，三种药物中ES2肽浓度一致。
(2)实验方法：将预先配置好的0mM，10μM和10mM GSH溶液各取30mL分别放入3个50mL离心管内，然后取3个透析管，每个管内分别装入2mL浓度为2mg/mL的CS-CYS-ES2或PTX-CS-CYS-ES2溶液，接着将透析管装入含有GSH溶液的离心管中，并将离心管放入37℃恒温振荡摇床中，在0.5h，1h，2h，3h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，36h时从离心管中取1mL释放液，接着再放入1mL补液。用紫外分光光度计检测释放液中ES2的浓度，并计算ES2的累积释放率，其公式如下：
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种硫酸软骨素化ES2肽联合紫杉醇的结合物及其制备方法与应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> ES2多肽序列
<400> 1
Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro
1 5 10
Claims (10)
1.一种硫酸软骨素化ES2肽结合物，其特征在于，其由胱胺中的氨基通过酰胺化反应与硫酸软骨素中的羧基相连后，ES2肽的羧基再次通过酰胺化反应与胱胺中游离的氨基结合而成，其结构式如下：
CS-CYS-(ES2)n；
式中，n＝30～60。
2.如权利要求1所述的硫酸软骨素化ES2肽结合物，其特征在于，所述硫酸软骨素化ES2肽结合物还修饰有紫杉醇，具体的，其由胱胺上的氨基通过酰胺键与硫酸软骨素上的羧基连接，紫杉醇的羟基通过酯键与硫酸软骨素上的羧基相连以及ES2肽的羧基通过酰胺键与胱胺上的游离氨基连接形成，结构式如下：
(PTX)n1-CS-CYS-(ES2)n2；
式中，n1＝1～13，n2＝30～50。
3.权利要求1所述的硫酸软骨素化ES2肽结合物的制备方法，其特征在于，包括：
S1、制备CS～CYS结合物：将CS溶于水中，加入EDCI和NHS作为催化剂活化CS中的羧基，活化完成后加碱液调节pH至弱碱性，然后缓慢加入CYS溶液进行反应，反应完成后，反应产物经纯化即得CS～CYS结合物；
S2、制备CS～CYS-ES2结合物：将ES2溶于水中，加入EDCI和NHS作为催化剂，活化羧基后，缓慢加入CS～CYS溶液继续反应，反应结束后，反应产物经纯化后即得CS～CYS-ES2结合物。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，调节pH至弱碱性具体为加入碱液调节pH至7.40左右；加入CYS溶液后反应时间控制为8～15h，优选为10h；反应产物纯化包括透析和干燥步骤；或，
所述步骤S2中，活化时间控制为10-60min，优选为45min；缓慢加入CS～CYS溶液继续反应，反应时间控制为12～48h，优选为24h；反应产物纯化步骤包括透析、干燥。
5.权利要求2所述的硫酸软骨素化ES2肽结合物的制备方法，其特征在于，包括：
S1、制备CS～CYS结合物：将CS溶于水中，加入EDCI和NHS作为催化剂活化CS中的羧基，活化完成后调节pH至弱碱性，然后缓慢加入CYS溶液进行反应，反应完成后，反应产物经纯化即得CS～CYS结合物；
S2、制备CS～CYS-TBA结合物：将CS～CYS溶于水中，加入Dowex离子交换树脂，搅拌后过滤除去树脂，使用TBA溶液调整CS～CYS溶液pH至弱碱性，冻干即得到CS～CYS-TBA结合物；
S3、制备PTX-CS～CYS结合物：将CS～CYS-TBA溶于有机溶剂中，添加DCC和DMAP进行催化反应，然后缓慢加入PTX溶液，继续反应，反应结束后，反应产物经纯化后即得PTX-CS～CYS结合物；
S4、制备PTX-CS～CYS-ES2结合物：将ES2溶于水中，加入EDCI和NHS作为催化剂，缓慢加入PTX-CS～CYS溶液继续反应，反应结束后，反应产物经纯化后即得PTX-CS～CYS-ES2结合物。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，调节pH至弱碱性具体为加入碱液调节pH至7.40左右；加入CYS溶液后反应时间控制为8～15h，优选为10h；反应产物纯化包括透析和干燥步骤；
所述步骤S2中，所述有机溶剂为二氯甲烷或二甲基亚砜；加入等量Dowex离子交换树脂后进行搅拌，搅拌时间控制为8～10h，优选为10h；所述TBA溶液浓度控制为15-25％(优选为20％)；使用TBA溶液调整CS～CYS溶液pH至中性或弱碱性具体为使用20％的TBA溶液调整CS～CYS溶液pH至7.07。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，催化反应控制时间为10-60min；加入PTX溶液后，反应时间控制为24～72h，优选为48h；反应产物纯化步骤包括透析、干燥。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，活化时间控制为10-60min；缓慢加入PTX-CS～CYS溶液继续反应，反应时间控制为12～48h，优选为24h；反应产物纯化步骤包括透析、干燥。
9.权利要求1或2所述硫酸软骨素化ES2肽结合物在制备抗新生血管生成相关疾病的药物和/或抗肿瘤药物中的用途；
优选的，所述新生血管生成相关疾病包括糖尿病视网膜病变、老年性黄斑病变和关节炎；
所述肿瘤包括黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌和肾癌。
10.一种抗新生血管生成相关疾病的药物和/或抗肿瘤药物，其特征在于，所述药物其包含权利要求1或2所述硫酸软骨素化ES2肽结合物，还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。
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|---|
| 孙凤: ""抗新生血管新生肽ES2的体外非抗凝肝素化修饰及抗肿瘤作用研究"", 《优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 工程科技I辑》 * |
| 李研: ""抗血管新生肽ES2-AF的硫酸软骨素化修饰及其肿瘤微环境敏感性多靶点抗肿瘤作用研究"", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 医药卫生科技辑 E079-77》 * |
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