CN113057159A - 一种细胞冻存液 - Google Patents

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CN113057159A CN202010001886.7A CN202010001886A CN113057159A CN 113057159 A CN113057159 A CN 113057159A CN 202010001886 A CN202010001886 A CN 202010001886A CN 113057159 A CN113057159 A CN 113057159A
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聂玉
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李涛
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Abstract

本发明涉及一种细胞冻存液。具体地，本发明提供一种细胞冻存液，所述的细胞冻存液包括DMSO、胎牛血清和DMEM MD210原倍液；所述的DMEM MD210原倍液包括DMEM MD210粉末和水。本发明所述的细胞冻存液能够提高冻存的细胞密度，降低细胞冻存所需要贮存容器的体积，且能够在液氮或超低温条件下长时间储存，冻存细胞复苏和传代后具有良好的细胞活力和产毒效果，有利于工业化转产。

Description

一种细胞冻存液
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种细胞冻存液。
背景技术
细胞是疫苗生产不可或缺的原料，这是由病毒的基本特性决定的：离开了细胞，病毒不能进行完整的新陈代谢，因此，良好畅通的细胞供应以及细胞状态是保证疫苗生产顺利进行的基石。为了保持细胞的生物活性，又能控制在合适的代次内用于生产，疫苗生产企业常常用超低温保存的方法来冻存细胞，在液氮的超低温(-196℃)下，细胞处于休眠状态，这时候的细胞新陈代谢基本停止，当迅速恢复到合适的温度以及生长条件时又能进行传代扩大培养，是目前最理想的、可行的细胞保存方法。目前细胞保种常用方法有：
1.常规冻存管冻存：装量5ml，存放于液氮中；
2.常规冻存袋冻存：装量150ml，存放于-80℃冰箱中；
常规冻存管冻存常常采用5ml的冻存管冻存，然而，由于现有的常规冻存管中冻存的细胞密度较低，复苏一支冻存管至一个T75克瓶中，且扩大到2个静止的1.5万毫升血清瓶中常常需要高达10天的时间，较长的放大时间限制了细胞的应用，因此，为了加快所需放大的细胞生产，往往需要多个冻存管进行复苏生产，然而，多个冻存管的使用导致操作繁琐复杂，增大冻存空间且细胞批间差异性增大等缺点。虽然现有技术尝试提高冻存管中冻存的细胞密度，但难以保证冻存细胞复苏及其传代后仍然具有良好的细胞活力。
与冻存管相比，冻存袋虽然能够提高细胞的数量，克服常规冻存管冻存量小、操作复杂等缺点，缩短细胞复苏后生长时间，但由于冻存袋体积(每袋150ml，相当于30个5ml的冻存管)过大，不适合液氮罐存放且冻存袋放于液氮中容易炸裂，只能冻存于-80℃冰箱，然而，在-80℃存储条件下，细胞保存时间显著低于液氮保存，因此，与液氮保存的冻存管相比，冻存袋的保存期显著缩短。
因此，本领域需要开发一种冻存方法，提高冻存的细胞密度，缩小冻存容器的体积，便于保存至液氮或超低温环境中，且保证细胞复苏后具有良好的细胞活力和产毒效果，便于细胞放大生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够提高冻存的细胞密度，降低细胞冻存所需要贮存容器的体积，且能够在液氮或超低温条件下长时间储存，冻存细胞复苏和传代后具有良好的细胞活力和产毒效果的细胞冻存液。
本发明的第一方面，提供一种细胞冻存液，所述的细胞冻存液包括DMSO、胎牛血清和DMEM MD210原倍液；
所述的DMEM MD210原倍液包括DMEM MD210粉末和水。
在另一优选例中，所述的DMEM MD210粉末来源于北京清大天一科技有限公司。
在另一优选例中，在所述的DMEM MD210原倍液中，所述DMEM MD210粉末的含量为2-50g/L，较佳地4-30g/L，更佳地5-25g/L，更佳地5-20g/L，更佳地8-20g/L，最佳地佳地10-16g/L。
在另一优选例中，所述的DMSO、胎牛血清和DMEM MD210原倍液的体积比(v/v/v)为(0.5-1.5):(1-15):(1-15)，较佳地(0.5-1.5):(1-10):(1-10)，更佳地(0.5-1.5):(1-8):(1-8)，更佳地(0.5-1.5):(2.5-6.5):(2.5-6.5)，更佳地(0.8-1.2):(2.5-6.5):(2.5-6.5)，更佳地(0.5-1.5):(3-6):(3-6)，更佳地(0.8-1.2):(3-6):(3-6)，最佳地(0.8-1.2):(4-5):(4-5)。
在另一优选例中，所述的DMSO与胎牛血清的体积比(v/v)为1:1-16，较佳地1:1-10，更佳地1:2-8，更佳地1:2.5-8，最佳地1:3-6。
在另一优选例中，所述的DMSO与DMEM MD210原倍液的体积比(v/v)为1:1-16，较佳地1:1-10，更佳地1:2-8，更佳地1:2.5-8，最佳地1:3-6。
在另一优选例中，所述的胎牛血清与DMEM MD210原倍液的体积比(v/v)为0.5-1.5:0.5-1.5，较佳地0.8-1.2:0.8-1.2，最佳地1：1。
在另一优选例中，所述的DMEM MD210原倍液的pH为6.5-7.7，较佳地6.8-7.5，更佳地7.0-7.2。
在另一优选例中，用碳酸氢钠调节DMEM MD210原倍液的pH。
本发明的第二方面，提供一种制备如本发明的第一方面所述的细胞冻存液的方法，所述的方法包括步骤：
将如本发明的第一方面所述细胞冻存液的组分进行混合，得到所述细胞冻存液。
本发明的第三方面，提供一种如本发明的第一方面所述细胞冻存液的用途，用于制备细胞悬液。
在另一优选例，所述细胞选自下组：marc-145(疾)细胞、ST细胞，或其组合。
本发明的第四方面，提供一种细胞悬液，所述的细胞悬液包括如本发明的第一方面所述的细胞冻存液和细胞。
在另一优选例中，所述的细胞选自下组：marc-145(疾)细胞、ST细胞，或其组合。
在另一优选例中，在所述的细胞悬液中，所述的细胞的密度为0.01*107-1.5*107cells/ml。
在另一优选例中，所述的细胞的密度为0.05*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.1*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.5*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.1*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.1*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.1*107cells/ml。
本发明的第五方面，提供一种细胞冻存物，所述的细胞冻存物包括冷冻的细胞悬液，所述的细胞悬液如本发明的第四方面所述。
在另一优选例中，所述的冷冻为液氮冷冻。
在另一优选例中，所述的冷冻的冷冻温度为-220℃至-60℃，较佳地-220℃至-80℃，更佳地-220℃至-120℃，更佳地-220℃至-150℃，更佳地-220℃至-160℃，更佳地-200℃至-180℃。
在另一优选例中，所述的细胞冻存物为经1-480天，较佳地180-360天冷冻的细胞冻存物。
本发明的第六方面，提供一种冻存制品，所述的冻存制品包括冷冻的细胞悬液，所述的细胞悬液如本发明的第四方面所述。
在另一优选例中，所述的冷冻为液氮冷冻。
在另一优选例中，所述的冷冻的冷冻温度为-220℃至-60℃，较佳地-220℃至-80℃，更佳地-220℃至-120℃，更佳地-220℃至-150℃，更佳地-220℃至-160℃，更佳地-200℃至-180℃。
在另一优选例中，所述的冻存制品为冻存管或冻存袋。
在另一优选例中，所述的冻存制品为经1-480天，较佳地180-360天冷冻的细胞冻存物。
本发明的第七方面，提供一种细胞的冻存方法，所述的方法包括步骤：
(i)将待冻存细胞与如本发明的第一方面所述的细胞冻存液进行混合，得到细胞悬液；和
(ii)将步骤(i)得到的细胞悬液降温后，低温保存。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
(i-1)将待冻存的细胞用生长液吹打后，离心，得到沉淀细胞，用如本发明第一方面所述的的细胞冻存液重悬沉淀细胞，得到细胞悬液；和
(ii-1)将步骤(i-1)得到的细胞悬液降温后，置于低温保存。
在另一优选例中，所述的生长液包括胎牛血清和DMEM MD210原倍液；
所述的DMEM MD210原倍液包括DMEM MD210粉末和水。
在另一优选例中，所述的DMEM MD210粉末来源于北京清大天一科技有限公司。
在另一优选例中，在所述的DMEM MD210原倍液中，所述DMEM MD210粉末的含量为2-50g/L，较佳地4-30g/L，更佳地5-25g/L，更佳地5-20g/L，更佳地8-20g/L，最佳地佳地10-16g/L。
在另一优选例中，在所述的生长液中，所述的胎牛血清为所述DMEM MD210原倍液的2-20wt.％，较佳地2-15wt.％，更佳地5-15wt.％，更佳地5-13wt.％，最佳地6-10wt.％。
在另一优选例中，所述的DMEM MD210原倍液的pH为6.5-7.7，较佳地6.8-7.5，更佳地7.0-7.2。
在另一优选例中，用碳酸氢钠调节DMEM MD210原倍液的pH。
在另一优选例中，所述的离心的转速为500-4000rpm，较佳地500-3000rpm，更佳地500-2000rpm，更佳地500-1500rpm，最佳地800-1200rpm。
在另一优选例中，所述的离心的时间为5-30min，较佳地5-20min，更佳地5-15min，最佳地8-12min。
在另一优选例中，所述细胞选自下组：marc-145细胞、ST细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述的细胞悬液中，所述的细胞的密度为0.01*107-1.5*107cells/ml，较佳地0.05*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.1*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.5*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.1*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.1*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.1*107cells/ml。
在另一优选例中，所述低温的温度为-220℃至-60℃，较佳地-220℃至-80℃，更佳地-220℃至-120℃，更佳地-220℃至-150℃，更佳地-220℃至-160℃，更佳地-200℃至-180℃。
在另一优选例中，所述降温包括以下步骤：按照0.2-4℃/min，较佳地0.5-3℃/min，更佳地0.5-2℃/min，更佳地0.5-1.5℃/min，最佳地0.8-1.2℃/min的降温速率降低到-50℃至-90℃，较佳地-60℃至-80℃，更佳地-65℃至-75℃。
本发明的第八方面，提供一种细胞冻存物，所述的细胞冻存物通过如本发明的第七方面所述的方法制备。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为实施例1中，冻存前，F24代的marc-145细胞用胰蛋白酶消化前后的细胞形态图。
图2为实施例1中，冻存180天时，三组细胞复苏后(F25代)和传两代(F27代)后，细胞分别生长72h的细胞形态图。
图3为为实施例1中，冻存360天时，三组细胞复苏后(F25代)和传两代(F27代)后，细胞分别生长72h的细胞形态图。
图4为为实施例3中，冻存前，F24代的ST细胞用胰蛋白酶消化前后的细胞形态图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次开发了一种细胞冻存液，所述的细胞冻存液能够提高冻存的细胞密度，大大降低了细胞冻存所需要贮存容器的体积，能够在液氮或超低温条件下长时间储存，且冻存细胞复苏和传代后具有良好的细胞活力和产毒效果，有利于工业化转产。在此基础上，完成了本发明。
术语
除非另有定义,否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本发明所用，“细胞复苏”一词是指休眠的细胞重新活化的过程。一般采用本领域技术人员所熟知的程序即快速复苏法，将冷冻管迅速由液氮转入到温水浴中，较佳地37℃-40℃，不定时搅拌加速解冻；细胞完全解冻后，对冷冻管进行消毒；将解冻后清洗细胞并重悬，转移到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养；检查细胞存活率及活力。
在本发明中，marc-145细胞来源于猴肾细胞，从母细胞(MA 104细胞)克隆而得到。
在本发明中，ST细胞为猪睾丸细胞(swine testis)。
如本文所用，术语“DMEM”为Dulbecco's modified Eagle's medium的缩写，“DMEMMD210”为Dulbecco's modified Eagle's medium MD210的缩写。
如本文所用，术语“DMEM MD210粉末”与“DMEM MD210干粉”可互换使用。
细胞冻存液及其制备方法
本发明提供一种细胞冻存液，所述的细胞冻存液包括DMSO、胎牛血清和DMEMMD210原倍液；
所述的DMEM MD210原倍液包括DMEM MD210粉末和水。
在本发明的一个优选例中，在所述的DMEM MD210原倍液中，所述DMEM MD210粉末的含量为2-50g/L，较佳地4-30g/L，更佳地5-25g/L，更佳地5-20g/L，更佳地8-20g/L，最佳地佳地10-16g/L。
在另一优选例中，所述的DMSO、胎牛血清和DMEM MD210原倍液的体积比(v/v/v)为(0.5-1.5):(1-15):(1-15)，较佳地(0.5-1.5):(1-10):(1-10)，更佳地(0.5-1.5):(1-8):(1-8)，更佳地(0.5-1.5):(2.5-6.5):(2.5-6.5)，更佳地(0.8-1.2):(2.5-6.5):(2.5-6.5)，更佳地(0.5-1.5):(3-6):(3-6)，更佳地(0.8-1.2):(3-6):(3-6)，最佳地(0.8-1.2):(4-5):(4-5)。
在另一优选例中，所述的DMSO与胎牛血清的体积比(v/v)为1:1-16，较佳地1:1-10，更佳地1:2-8，更佳地1:2.5-8，最佳地1:3-6。
在另一优选例中，所述的DMSO与DMEM MD210原倍液的体积比(v/v)为1:1-16，较佳地1:1-10，更佳地1:2-8，更佳地1:2.5-8，最佳地1:3-6。
在另一优选例中，所述的胎牛血清与DMEM MD210原倍液的体积比(v/v)为0.5-1.5:0.5-1.5，较佳地0.8-1.2:0.8-1.2，最佳地1：1。
在另一优选例中，所述的DMEM MD210原倍液的pH为6.5-7.7，较佳地6.8-7.5，更佳地7.0-7.2。
本发明所述的细胞冻存液可以使用本领域熟知的方法进行制备，代表性地，所述的方法包括步骤：将本发明所述的细胞冻存液的各组分进行混合，得到所述的细胞冻存液。
用途
本发明提供一种本发明所述的细胞冻存液的用途，用于制备细胞悬液。
在一个优选例，所述细胞选自下组：marc-145(疾)细胞、ST细胞，或其组合。
在一个优选例，在所述的细胞悬液中，所述的细胞的密度为0.01*107-1.5*107cells/ml。优选地，在所述的细胞悬液中，所述的细胞的密度为0.05*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.1*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.5*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.1*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.1*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.1*107cells/ml。
细胞悬液
本发明提供一种细胞悬液，所述的细胞悬液包括如本发明所述的细胞冻存液和细胞。
在另一优选例中，所述的细胞选自下组：marc-145(疾)细胞、ST细胞，或其组合。
在一个优选例，在所述的细胞悬液中，所述的细胞的密度为0.01*107-1.5*107cells/ml。优选地，在所述的细胞悬液中，所述的细胞的密度为0.05*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.1*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.5*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.1*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.1*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.1*107cells/ml。
细胞冻存物
本发明提供一种细胞冻存物，所述的细胞冻存物包括冷冻的细胞悬液，所述的细胞悬液如上本发明所述。
在另一优选例中，所述的冷冻为液氮冷冻。
在另一优选例中，所述的冷冻的冷冻温度为-220℃至-60℃，较佳地-220℃至-80℃，更佳地-220℃至-120℃，更佳地-220℃至-150℃，更佳地-220℃至-160℃，更佳地-200℃至-180℃。
在另一优选例中，所述的细胞冻存物为经1-480天，较佳地180-360天冷冻的细胞冻存物。
冻存制品
本发明提供一种冻存制品，所述的冻存制品包括冷冻的细胞悬液，所述的细胞悬液如上本发明所述。
在另一优选例中，所述的冷冻为液氮冷冻。
在另一优选例中，所述的冷冻的冷冻温度为-220℃至-60℃，较佳地-220℃至-80℃，更佳地-220℃至-120℃，更佳地-220℃至-150℃，更佳地-220℃至-160℃，更佳地-200℃至-180℃。
在另一优选例中，所述的冻存制品为冻存管或冻存袋。
在另一优选例中，所述的冻存制品为经1-480天，较佳地180-360天冷冻的细胞冻存物。
细胞的冻存方法
本发明还提供一种细胞的冻存方法，所述的方法包括步骤：
(i)将待冻存细胞与如本发明所述的细胞冻存液进行混合，得到细胞悬液；
(ii)将步骤(i)得到的细胞悬液降温后，低温保存。
在本发明的一个优选例中，所述的细胞的冻存方法包括步骤：
(i-1)将待冻存的细胞用生长液吹打后，离心，得到沉淀细胞，用如本发明所述的细胞冻存液重悬沉淀细胞，得到细胞悬液；
(ii-1)将步骤(i-1)得到的细胞悬液降温后，置于低温保存。
在另一优选例中，所述的生长液包括胎牛血清和DMEM MD210原倍液；
所述的DMEM MD210原倍液包括DMEM MD210粉末和水。
在另一优选例中，所述的DMEM MD210粉末来源于北京清大天一科技有限公司。
在另一优选例中，在所述的DMEM MD210原倍液中，所述DMEM MD210粉末的含量为2-50g/L，较佳地4-30g/L，更佳地5-25g/L，更佳地5-20g/L，更佳地8-20g/L，最佳地佳地10-16g/L。
在另一优选例中，在所述的生长液中，所述的胎牛血清为所述DMEM MD210原倍液的2-20wt.％，较佳地2-15wt.％，更佳地5-15wt.％，更佳地5-13wt.％，最佳地6-10wt.％。
在另一优选例中，所述的DMEM MD210原倍液的pH为6.5-7.7，较佳地6.8-7.5，更佳地7.0-7.2。
在另一优选例中，用碳酸氢钠调节DMEM MD210原倍液的pH。
在另一优选例中，所述的离心的转速为500-4000rpm，较佳地500-3000rpm，更佳地500-2000rpm，更佳地500-1500rpm，最佳地800-1200rpm。
在另一优选例中，所述的离心的时间为5-30min，较佳地5-20min，更佳地5-15min，最佳地8-12min。
在另一优选例中，所述细胞选自下组：marc-145细胞、ST细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述的细胞悬液中，所述的细胞的密度为0.01*107-1.5*107cells/ml，较佳地0.05*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.1*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.5*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.7*107-1.1*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.8*107-1.1*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.5*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.4*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.3*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.2*107cells/ml，更佳地0.9*107-1.1*107cells/ml。
在另一优选例中，所述低温的温度为-220℃至-60℃，较佳地-220℃至-80℃，更佳地-220℃至-120℃，更佳地-220℃至-150℃，更佳地-220℃至-160℃，更佳地-200℃至-180℃。
在另一优选例中，所述降温包括以下步骤：按照0.2-4℃/min，较佳地0.5-3℃/min，更佳地0.5-2℃/min，更佳地0.5-1.5℃/min，最佳地0.8-1.2℃/min的降温速率降低到-50℃至-90℃，较佳地-60℃至-80℃，更佳地-65℃至-75℃。
本发明的主要优点包括：
本发明所述的细胞冻存液能够提高冻存的细胞密度，降低细胞冻存所需要贮存容器的体积，且能够在液氮或超低温条件下长时间储存，冻存细胞复苏和传代后具有良好的细胞活力和产毒效果，有利于工业化转产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
1.材料和试剂
DMEM MD210粉末为北京清大天一科技有限公司(默克密理博，Merck Millipore所属)，生产的用于marc-145细胞培养的个性化培养基。
生长液的配制：
将DMEM MD210粉末按每12.48g加入1L注射用水(30℃以下)完全溶解，得到DMEMMD210培养液，用碳酸氢钠调节DMEM MD210培养液的pH至7.0-7.2后，得到DMEM MD210原倍液，向DMEM MD210原倍液中加入8wt.％胎牛血清，以DMEM MD210原倍液重量计，无菌过滤，分装，得到生长液。
低密度冻存液的配制
将DMEM MD210粉末按每12.48g加入1L注射用水(30℃以下)完全溶解，得到DMEMMD210培养液，用碳酸氢钠调节DMEM MD210培养液的pH至7.0-7.2后，得到DMEM MD210原倍液，按照DMSO：胎牛血清：DMEM MD210原倍液＝1:2:7(v/v/v)混合后，无菌过滤，得到低密度冻存液。
高密度冻存液的配制：
将DMEM MD210粉末按每12.48g加入1L注射用水(30℃以下)完全溶解，得到DMEMMD210培养液，用碳酸氢钠调节DMEM MD210培养液的pH至7.0-7.2后，得到DMEM MD210原倍液，按照DMSO：胎牛血清：DMEM MD210原倍液＝1:4.5:4.5(v/v/v)混合后，无菌过滤，得到高密度冻存液。
2.实验方法
低密度冻存组：是将F24代(24次传代)的marc-145细胞用胰蛋白酶消化后，加入低密度冻存液将细胞摇洗吹打，控制细胞密度1.0-2.0*106/ml，分装至5ml/支冻存管中，再通过程序降温盒按1℃/min的降温速度降温，降至-70℃后，转入液氮(-196℃)中长期保存。
10倍浓缩组：是将F24代的marc-145细胞用胰蛋白酶消化后，用生长液摇洗吹打，再通过1000rpm转速离心10min，使细胞完全沉淀后，弃去上清，再加入高密度冻存液重悬细胞，控制细胞密度1.0-2.0*107/ml，分装至5ml/支冻存管中，再通过程序降温盒按1℃/min的降温速度降温，降至-70℃后，转入液氮(-196℃)中长期保存。
20倍浓缩组：是将F24代的marc-145细胞用胰蛋白酶消化后，用生长液摇洗吹打，再通过1000rpm转速离心10min，使细胞完全沉淀后，弃去上清，再加入高密度冻存液重悬细胞，控制细胞密度2.0-4.0*107/ml，分装至5ml/支冻存管中，再通过程序降温盒按1℃/min的降温速度降温，降至-70℃后，转入液氮(-196℃)中长期保存。
以上三组在冻存一段时间后进行阶段性复苏验证，对冻存时间内的细胞活力、产毒效果进行对比。
3.实验结果
将低密度冻存组、10倍浓缩组、20倍浓缩组在冻存于液氮后的180天、360天分别进行复苏验证、蓝耳病毒产毒验证(蓝耳病毒株为一种marc-145细胞敏感毒株，能在marc-145细胞上繁殖，本实验使用毒株为：高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株))，其中：
细胞复苏条件为：溶解水温40℃，溶解时间3分钟以内。
细胞形态用光学显微镜放大400倍观察。
细胞密度用细胞计数法进行测定，细胞计数方法采血球计数板2-5倍稀释计数。
细胞活力为测定的活细胞与总细胞的比例，细胞活力是通过在细胞计数时加入终浓度0.04％的台盼蓝溶液来计数死细胞与活细胞数量。若细胞死亡，细胞会被染成蓝色，细胞若存活，则细胞不会染色。
病毒含量测定是按照reed-muench方法进行检测。
3.1冻存前三组细胞数据
冻存前，F24代的marc-145细胞用胰蛋白酶消化前后的细胞形态如图1所示，从图1中可以看出，消化前细胞形态呈典型的不规则多边形，细胞折光性好，消化后细胞饱满，无拖，细胞状态较好。
冻存前，F24代的marc-145细胞的数量及活力如表1所示：
表1冻存前，F24代的marc-145细胞的数量及活力
Figure BDA0002353792060000141
3.2冻存180天后三组细胞数据
3.2.1冻存180天后细胞复苏及传代情况：
在三组细胞冻存180天，复苏每组细胞，复苏时代次均为F25代，然后将F25代细胞传两代为F27代，每组F25代和F27代细胞生长72h的细胞形态如图2所示。从图2中看出：低密度冻存组marc-145细胞复苏后生长良好，传至F27代，细胞状态均正常。10倍浓缩组marc-145细胞复苏后生长良好，传至F27代，细胞状态均正常。20倍浓缩组marc-145细胞复苏后生长较差，细胞不呈多边型，而是圆形，经过传至F27代，细胞状态更差，圆细胞明显增多，细胞传代比例降至1：1.5传代才能免强维持生长成单层。
3.2.2三组细胞冻存180天细胞活力及产毒效果
三组细胞冻存180天复苏后细胞(marc-145细胞)活力和传2代后(F27)细胞产毒效果如表2所示：
表2冻存180天复苏后细胞(marc-145细胞)活力及传2代后(F27)细胞产毒效果
Figure BDA0002353792060000142
Figure BDA0002353792060000151
从表2中可以看出，低密度冻存组和10倍浓缩组的细胞冻存180天复苏后具有良好的细胞活力，且传2代后(F27)具有优异的细胞产毒效果，然而，20倍浓缩组的细胞复苏后的细胞活力较差且传2代后(F27)具有较差的细胞产毒效果。
3.3冻存360天后三组细胞数据分析：
3.3.1冻存360天后细胞复苏及传代情况：
在三组细胞冻存360天，复苏每组细胞，复苏时代次均为F25代，然后将F25代细胞传两代为F27代，每组F25代和F27代细胞生长72h的细胞形态如图3所示，从图3中看出：低密度冻存组marc-145细胞冻存360天后复苏后生长良好，传至F27代，细胞状态均正常。10倍浓缩组marc-145细胞冻存360天后复苏后生长良好，传至F27代，细胞状态均正常。20倍浓缩组(实验组)marc-145细胞冻存360天后复苏后生长较差，细胞不呈多边型，而是圆形，相对于180天复苏时的圆细胞更多，经过传至F27代，细胞状态更差，细胞成拉丝状，细胞只能通过换液来维持单层。
3.3.2三组细胞冻存360天细胞活力及产毒效果
三组细胞冻存360天复苏后细胞(marc-145细胞)活力和传2代后(F27)细胞产毒效果如表3所示：
表3冻存360天复苏后细胞(marc-145细胞)活力及传2代后(F27)细胞产毒效果
Figure BDA0002353792060000152
从表3中可以看出，低密度冻存组和10倍浓缩组的细胞冻存360天复苏后具有良好的细胞活力，且传2代后(F27)具有优异的细胞产毒效果，然而，20倍浓缩组的细胞复苏后的细胞活力较差且传2代后(F27)具有较差的细胞产毒效果。
实施例2
实施例2重复实施例1实验，验证重复性效果。
冻存前，F24代的marc-145细胞的数量及活力如表4所示：
表4冻存前，F24代的marc-145细胞的数量及活力(重复性实验1)
Figure BDA0002353792060000161
冻存180天复苏后细胞(marc-145细胞)活力及传2代后(F27)细胞产毒效果如表5所示：
表5冻存180天复苏后细胞(marc-145细胞)活力及传2代后(F27)细胞产毒效果(重复性实验1)
Figure BDA0002353792060000162
冻存360天复苏后细胞(marc-145细胞)活力及传2代后(F27)细胞产毒效果如表6所示：
表6冻存360天复苏后细胞(marc-145细胞)活力及传2代后(F27)细胞产毒效果
Figure BDA0002353792060000163
从表5-6中可以看出，低密度冻存组和10倍浓缩组的细胞冻存180天或360天复苏后具有良好的细胞活力，且传2代后(F27)具有优异的细胞产毒效果，然而，20倍浓缩组的细胞复苏后的细胞活力较差且传2代后(F27)具有较差的细胞产毒效果。
实施例3
实施例3的同实施例1，区别在于，实施例3以ST细胞代替marc-145细胞进行冻存实验。
针对ST细胞验证实验重复性效果
冻存前，F24代的ST细胞用胰蛋白酶消化前后的细胞形态如图4所示，ST细胞消化前细胞致密，成芝麻粒形态，排列整齐，折光性好，消化后，细胞呈轮廓清晰，光滑圆形，无拖尾毛刺。
冻存前，F24代的ST细胞的数量及活力如表7所示：
表7冻存前，F24代的ST细胞的数量及活力
Figure BDA0002353792060000171
冻存180天复苏后细胞(ST细胞)活力及传2代后(F27)细胞产毒效果如表8所示：
表8冻存180天复苏后细胞(ST细胞)活力及传2代后(F27)细胞产毒效果
Figure BDA0002353792060000172
注：伪狂犬毒株为一种ST细胞敏感毒株，能在ST细胞上繁殖，本实验使用毒株为：伪狂犬病活疫苗(Bartha-k61株)
冻存360天复苏后细胞(ST细胞)活力及传2代后(F27)细胞产毒效果如表9所示：
表9冻存360天复苏后细胞(ST细胞)活力及传2代后(F27)细胞产毒效果
Figure BDA0002353792060000173
Figure BDA0002353792060000181
从表8-9中可以看出，低密度冻存组和10倍浓缩组的细胞冻存180天或360天复苏后具有良好的细胞活力，且传2代后(F27)具有优异的细胞产毒效果，然而，20倍浓缩组的细胞复苏后的细胞死亡严重，无法正常传第2代。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液包括DMSO、胎牛血清和DMEM MD210原倍液；
所述的DMEM MD210原倍液包括DMEM MD210粉末和水。
2.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，在所述的DMEM MD210原倍液中，所述DMEM MD210粉末的含量为2-50g/L，较佳地4-30g/L，更佳地5-25g/L，更佳地5-20g/L，更佳地8-20g/L，最佳地佳地10-16g/L。
3.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的DMSO、胎牛血清和DMEM MD210原倍液的体积比(v/v/v)为(0.5-1.5):(1-15):(1-15)，较佳地(0.5-1.5):(1-10):(1-10)，更佳地(0.5-1.5):(1-8):(1-8)，更佳地(0.5-1.5):(2.5-6.5):(2.5-6.5)，更佳地(0.8-1.2):(2.5-6.5):(2.5-6.5)，更佳地(0.5-1.5):(3-6):(3-6)，更佳地(0.8-1.2):(3-6):(3-6)，最佳地(0.8-1.2):(4-5):(4-5)。
4.一种如权利要求1所述细胞冻存液的用途，其特征在于，用于制备细胞悬液。
5.一种细胞悬液，其特征在于，所述的细胞悬液包括如权利要求1所述的细胞冻存液和细胞。
6.如权利要求5所述的细胞悬液，在所述的细胞悬液中，所述的细胞的密度为0.01*107-1.5*107cells/ml。
7.一种细胞冻存物，其特征在于，所述的细胞冻存物包括冷冻的细胞悬液，所述的细胞悬液如权利要求5所述。
8.一种冻存制品，其特征在于，所述的冻存制品包括冷冻的细胞悬液，所述的细胞悬液如权利要求5所述。
9.一种细胞的冻存方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(i)将待冻存细胞与如权利要求1所述的细胞冻存液进行混合，得到细胞悬液；和
(ii)将步骤(i)得到的细胞悬液降温后，低温保存。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(i-1)将待冻存的细胞用生长液吹打后，离心，得到沉淀细胞，用如权利要求1所述的细胞冻存液重悬沉淀细胞，得到细胞悬液；和
(ii-1)将步骤(i-1)得到的细胞悬液降温后，置于低温保存。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114159473A (zh) * 2022-02-11 2022-03-11 美亚宜彬生物科技(北京)有限公司 一种用于改善男性生殖系统干细胞复合制剂及制备方法
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