CN113046327A - 穿山甲冠状病毒xCoV及其应用和药物抗冠状病毒感染的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从穿山甲中分离的冠状病毒，命名为穿山甲冠状病毒xCoV，其与SARS‑COV‑2的S蛋白同源性达92.5％，xCoV感染细胞的受体与SARS‑COV‑2一致，均为血管紧张素转化酶2(ACE2)。但xCoV不感染人，因此对人而言是非常安全的，可用于抗SARS‑COV‑2病毒的活性药物、疫苗的筛选，还可用于制备抗SARS‑COV‑2病毒的减毒疫苗或灭活疫苗。基于该穿山甲冠状病毒xCoV，筛选获得了多个具有抗冠状病毒活性的活性化合物，并对其中的千金藤素(千金藤碱)、西拉菌素、盐酸甲氟喹(甲氟喹)进行了EC50、CC50及SI的评价，并通过转录组测序分析研究了千金藤素抑制xCoV的机制。

Description

穿山甲冠状病毒xCoV及其应用和药物抗冠状病毒感染的应用
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及一种穿山甲冠状病毒xCoV及其用于抗SARS-COV-2病毒药物的筛选的用途，包含该穿山甲冠状病毒xCoV的药物筛选模型、药物筛选方法，还涉及基于该xCoV筛选出的活性化合物用于制备治疗SARS-COV-2病毒感染性疾病的药物的用途。
背景技术
新型冠状病毒(被世界卫生组织命名为“SARS-COV-2”，先前命名为2019新型冠状病毒或2019nCoV)属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别。目前研究显示其与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85％以上。SARS-CoV-2的防治迫切需要有效的疫苗和特异性治疗，如何快速筛选能够抑制该病毒复制的药物成为迫在眉睫的问题。同时，由于该病毒的传染性极强，如何安全地进行药物筛选等相关研究、保护研究人员不受感染也成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明人从海关查获的死亡的穿山甲中分离并培养的一株新型冠状病毒xCoV，称为穿山甲冠状病毒xCoV(在本发明的上下文中也称为“穿山甲xCoV”或者“xCoV”)，其全基因组序列分析结果显示与SARS-COV-2的S蛋白同源性达92.5％，是迄今为止成功分离培养的与SARS-COV-2的S蛋白同源性最高的病毒。进一步实验显示穿山甲xCoV感染细胞的受体与SARS-COV-2一致，均为血管紧张素转化酶2(ACE2)。但是该病毒不感染人，因此，对人而言是非常安全的。
本发明提供一种冠状病毒(也称为“穿山甲冠状病毒xCoV”、“穿山甲xCoV”或者“xCoV”)，该冠状病毒毒株xCoV于2020年2月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.19295。
根据本发明的穿山甲冠状病毒毒株xCoV，其全基因组核苷酸序列如序列表中SEQID NO:1所示。
根据本发明的穿山甲冠状病毒毒株xCoV，其S基因的核酸序列如序列表中SEQ IDNO:2所示。
根据本发明的穿山甲冠状病毒毒株xCoV，其S蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQID NO:3所示。
根据本发明的穿山甲冠状病毒毒株xCoV，其与SARS-COV-2的S蛋白同源性达92.5％。其中，所述SARS-COV-2的S基因的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，其S蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。
其中，xCoV与SARS-COV-2的序列一致性结果在图1中示出。
本发明还提供所述穿山甲冠状病毒毒株xCoV的应用，其用于抗SARS-COV-2病毒的活性药物的筛选与评价，抗SARS-COV-2病毒的疫苗的筛选与评价，以及用于制备抗SARS-COV-2病毒的减毒疫苗或灭活疫苗，以及用于SARS-COV-2病毒感染的诊断和治疗性抗体的制备。其中所述疫苗中还包括药学上可接受的佐剂。
本发明还提供一种用于筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的药物筛选模型，其包括所述保藏编号为CGMCC No.19295的冠状病毒(也称为“穿山甲冠状病毒xCoV”、“冠状病毒xCoV”、“穿山甲xCoV”或者“xCoV”)。
根据本发明的药物筛选模型，其为采用所述穿山甲冠状病毒xCoV感染的哺乳动物细胞，优选Vero E6细胞(非洲绿猴肾细胞)。
根据本发明的药物筛选模型，其中所述模型优选用于筛选和/或评价有抗SARS-CoV-2病毒活性的药物。
本发明还提供一种筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的方法，其采用上述药物筛选模型进行；优选地，该方法用于筛选和/或评价有抗SARS-CoV-2活性的药物。
根据本发明的筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的方法，其包括步骤(1)：向所述药物筛选模型中加入待测试的药物并进行培养。
根据本发明的筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的方法，其在步骤(1)之后还任选地包括以下步骤(2a)或步骤(2b)，或同时包含步骤(2a)和步骤(2b)：
步骤(2a)：在显微镜下观察细胞病变；
步骤(2b)：测定细胞和上清中的病毒核酸。
根据本发明的筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的方法，步骤(1)中的培养时间可以为12-90小时，如24-72小时，48-72小时，24小时，48小时或72小时等。
在步骤(2a)中，当观察到存在完整的细胞单层或细胞病变不明显时，表明待测试的药物具有抑制病毒复制的活性。
此外，本发明还提供以下化合物中的任一种、两种或三种用于制备治疗冠状病毒感染性疾病的药物的用途：千金藤素(千金藤碱)、西拉菌素、盐酸甲氟喹和甲氟喹。
根据本发明的用途，所述冠状病毒为SARS-COV-2病毒。
此外，本发明还通过Time-of-Addition试验发现了千金藤素、西拉菌素和盐酸甲氟喹对xCoV病毒生命周期的影响，并通过转录组学分析解释了千金藤素抑制xCoV病毒复制的机理。
有益效果
本发明的穿山甲冠状病毒xCoV与SARS-COV-2的S蛋白同源性高，xCoV感染细胞的受体与SARS-COV-2一致，均为血管紧张素转化酶2(ACE2)。并且该xCoV病毒不感染人，因此对人而言是非常安全，可用于抗SARS-COV-2病毒的药物筛选与评价、疫苗筛选与评价、减毒及灭活疫苗的制备。基于该xCoV病毒筛选抗SARS-COV-2病毒的药物对研发人员非常安全，不必担心被感染。基于该筛选模型筛选出了抗SARS-CoV-2的活性药物千金藤素(千金藤碱)、西拉菌素、盐酸甲氟喹(甲氟喹)，并证明了千金藤素、西拉菌素和盐酸甲氟喹在xCoV入胞后发挥抑制作用，还解释了千金藤素抗xCoV机制。千金藤素主要通过干扰细胞应激反应，包括内质网应激/未折叠蛋白反应和热休克因子1(HSF1)介导的热休克反应来逆转受感染细胞中大多数失调的基因和通路，从而发挥抗冠状病毒效果。
附图说明
图1示出了xCoV与其他冠状病毒的序列一致性结果。
图2示出了xCoV全基因组与SARS-CoV-2全基因组的进化树分析。
图3示出了xCoV的S基因与SARS-CoV-2的S基因的进化树分析。
图4示出了siRNA敲降ACE2后ACE2 mRNA的表达情况。
图5示出了siRNA敲降ACE2表达后对xCoV病毒感染的影响。
图6示出了本发明的药物筛选的流程。
图7示出了感染复数为0.01的xCoV感染72小时后，不加药时的Vero E6细胞形态图。
图8示出了不加病毒培养72小时后，不加药时的Vero E6细胞形态图。
图9示出了加入终浓度10μM(微摩尔每升)的千金藤素和感染复数为0.01的xCoV感染72小时后的Vero E6细胞形态图。
图10示出了加入终浓度10μM(微摩尔每升)的西拉菌素和感染复数为0.01的xCoV感染72小时后的Vero E6细胞形态图。
图11示出了加入终浓度10μM(微摩尔每升)的盐酸甲氟喹和感染复数为0.01的xCoV感染72小时后的Vero E6细胞形态图。
图12示出了三种化合物对xCoV的抑制作用，10μM的千金藤素抑制xCoV病毒复制的倍数为15393倍，10μM的西拉菌素抑制xCoV病毒复制的倍数为5053倍，10μM的盐酸甲氟喹抑制xCoV病毒复制的倍数为31倍。
图13示出了千金藤素对xCoV的半数有效浓度(EC50)为0.9851μM、对Vero E6细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)为39.32μM，以及选择指数(SI)为39.91。
图14示出了西拉菌素对xCoV的半数有效浓度(EC50)为1.908μM、对Vero E6细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)为6.227μM，以及选择指数(SI)为3.290。
图15示出了盐酸甲氟喹对xCoV的半数有效浓度(EC50)为2.728μM、对Vero E6细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)为10.08μM，以及选择指数(SI)为3.695。
图16示出了千金藤素对xCoV的Time-of-Addition试验结果。
图17示出了西拉菌素对xCoV的Time-of-Addition试验结果。
图18示出了盐酸甲氟喹对xCoV的Time-of-Addition试验结果。
图19示出了千金藤素抗xCoV复制的转录组分析结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。需要说明的是，下述实施例不能作为对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上作出的改进都不违背本发明的精神。本发明所用原料和设备，如无特殊说明，均可商业购买。
一、实验方法
1.细胞培养和病毒培养
非洲绿猴肾细胞系Vero E6是从美国模式培养物集存库(ATCC，1586号)中获得的，在37℃、5％CO2的条件下，在含有10％胎牛血清(FBS；Gibco Invitrogen)的DMEM培养基(Gibco)中培养。
将穿山甲分离株xCoV在Vero E6细胞中繁殖，用噬斑实验测定病毒滴度。所有感染实验均在生物安全2级(BLS2)实验室进行。
上市药物库(产品号L1000，含2080种已经上市的药物)和抗病毒化合物库(产品号L1700，含326抗病毒药物)从上海陶素生化科技有限公司购买。所有药物的初始浓度均为10mM(毫摩尔每升)。
千金藤素(T0131)、西拉菌素(T0124)、盐酸甲氟喹(T0860)从上海陶素生化科技有限公司购买。所有药物的初始浓度均为10mM(毫摩尔每升)。
2.探究ACE2是否为xCoV感染细胞受体
转染前一天，在12孔细胞培养板中每孔接种2×105个Vero E6细胞。第二天，当细胞贴壁好时利用ACE2 siRNA smartpool(苏州吉玛基因)通过RNAiMax转染试剂反式转染的方式沉默ACE2基因表达。将细胞分别与2、10和50nM的siRNAs转染液在37℃条件下孵育48小时。48小时后，将细胞与xCoV在37℃共孵育2小时。用PBS洗去未结合的病毒，加入新鲜培养基继续培养24小时。用PBS洗去未结合的病毒，提取总RNA，采用两步法qRT-PCR测定ACE2mRNA和病毒感染情况。
3.利用SARS-CoV-2高度同源的穿山甲冠状病毒xCoV从上市药物库中筛选潜在的抗新型肺炎病毒药物
96孔细胞板中种上2.5×104个Vero E6细胞，24小时后用MOI＝0.01的xCoV感染Vero E6细胞，同时向其中加入终浓度为10μM的各种已知药物(2406种上市药物和III期临床试验药物)，在第3天时通过显微镜镜下观察细胞病变，对没有明显细胞病变的培养孔提取细胞和上清中的RNA，用qRT-PCR测定细胞和上清中的病毒复制情况。
4.病毒RNA提取及实时定量RT-PCR(qRT-PCR)
根据制造商的说明，使用AxyPrepTM体液病毒DNA/RNA微型制备试剂盒(Axygen，产品编号AP-MN-BF-VNA-250)和AxyPrepTM多用途总RNA微型制备试剂盒(Axygene，产品编号AP-MN-MS-RNA-250G)采集细胞培养上清液和Vero E6细胞进行RNA提取。用带有gDNA酶的HifairⅡ1链cDNA合成试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，产品编号11121ES60)进行反转录，用Hieff-qPCR-SYBR-Green-Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司，货号：11202ES08)或两步Taqman探针检测qRT-PCR系统(Applied-Biosystem)进行qPCR，所用引物的序列信息在表1中示出。经测序确认后，由北京瑞博兴科生物科技有限公司将PCR产物插入T载体，产生标准质粒。标准曲线是通过测定质粒连续稀释(103-109)的拷贝数而产生的。SYBR-Green法的qPCR扩增：95℃5min，40个循环，95℃10s，55℃20s，72℃31s。
Taqman法：50℃2min，95℃10min，40次循环，95℃10s，60℃1min，用GraphPad-Prism 8软件分析图12的数据。
本发明的药物筛选流程如图6所示。
5.EC50与CC50检测及Time-of-Addition试验
使用实验方法3筛选出的3种化合物-千金藤素、西拉菌素、盐酸甲氟喹进行试验，在使用MOI＝0.01的xCoV感染Vero E6细胞。
EC50检测：Vero E6细胞接种至24孔细胞培养板，细胞密度达到60％-80％时进行试验；药物稀释至200μM，后按两倍比梯度稀释至0.39μM。Vero E6细胞换液后，药物溶液与病毒悬液1:1稀释后加至细胞。试验药物终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM、0.78μM、0.39μM、0.195μM、0μM。37℃5％CO2培养60-72h，观察CPE，提取细胞核酸进行qPCR检测，用GraphPad-Prism 8软件进行数据分析计算EC50。
CC50检测：使用Cell-Titer-Blue法进行CC50的检测。Vero E6细胞接种至96孔细胞培养板，细胞密度达到60％-80％时进行试验。药物两倍比梯度稀释，Vero E6细胞换液后加入稀释后的药物。试验药物终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM、0.78μM、0.39μM、0.195μM、0μM。37℃5％CO2培养48h，每孔加20μl Cell-Titer-Blue，分别在0min、30min、60min、120min检测593nm发光强度，用GraphPad-Prism 8软件进行数据分析计算CC50。
SI为CC50除以EC50计算得出。
Time-of-Addition检测：Vero E6细胞接种至24孔细胞培养板，细胞密度达到60％-80％时进行试验。选择试验药物浓度为6.25μM。“全时程”实验方法:加入药物-病毒混合液，37℃5％CO2培养2h后换液，加入药物-病毒混合液；“入胞前”实验方法：加入药物-病毒混合液，37℃5％CO2培养2h后换液，加入纯培养基；“入胞后”实验方法：加入纯培养基，37℃5％CO2培养2h后换液，加入药物-病毒混合液。37℃5％CO2继续培养60-72h，观察CPE，提取细胞核酸进行qPCR检测，用GraphPad-Prism 8软件进行数据分析。
6.千金藤素抗xCoV感染的转录组学分析
千金藤素(CEP)试验浓度为6.25μM，使用MOI＝0.01的xCoV感染Vero E6细胞。实验设置四个分组：Vero、Vero+Virus、Vero+CEP、Vero+Virus+CEP。培养72h后，收集细胞样品后使用TRIzol进行RNA提取，使用QIAseq FastSelect-rRNA HMR Kit(Qiagen，产品编号334387)去除rRNA，使用NEBNext UltraTMRNA Library Prep Kit for Illumina(NEB，产品编号E7770L)建立mRNA测序文库，使用Illumina Hiseq 2500sequencing system(安诺优达生物科技有限公司)进行RNA测序(RNA-seq)。
FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)工具和FASTX工具包中的fastx_trimmer用于去除低质量数据和接头序列；使用HISAT2(v2.1.0)将修剪后的RNA-seq序列映射到参比绿猴基因组ChlSab1.1(GCA_000409795.2)；使用SAMtools(v1.5)删除双末端数据重复序列；使用HTseq对每个不同基因进行计数；使用DESeq2鉴定不同实验组之间的差异表达基因；使用Benjamini-Hochberg法调整P值来计算错误发现率(FDR)；FDR q值<0.05和|Log2(倍数变化)|>1的基因被认为是差异表达基因；使用R语言的ggplot2软件包绘制火山图。
Gct格式文件(包括Vero对Vero+Virus，Vero+Virus对Vero+Virus+CEP)用作处理文件。基因集包括(1)热休克因子1(HSF1)介导的热休克反应调节、细胞致热性调节、HSF1依赖性反式激活、HYPOXIA、对病毒的防御反应、对病毒的反应、HIF1靶标、脂肪细胞分化和自噬，可从MSigDB、KEGG和Reactome数据库下载，(2)病毒的上/下调基因，是上述RNA-seq数据中差异表达的基因，其FDR q值<0.05和|Log2(倍数变化)|>1。使用Signal2Noise模式运行GSEA4.0.3(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)进行1000个排列计算得出的基因组富集P值，得出归一化富集得分(NES)值和FDR值。可视化热图由GENE-E的R软件包绘制。并从MSigDB、KEGG和Reactome数据库绘制热图，以通过途径模式显示所选基因集。
使用Metascape工具(https://metascape.org)对上所述获得差异表达的基因进行基因本体(GO)分析。P值<0.05的途径作为显着富集的途径，最显著富集的途径使用R包ggplot2创建的气泡图展示，使用Metascape网站中Cytoscape绘制每个重要的富集途径的相互作用网络和蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。并使用BioGrid和OmniPath对每个给定的基因列表进行详细地PPI富集分析。
表1研究中使用的引物序列
Figure BDA0002939283190000091
Figure BDA0002939283190000101
二、实验结果
通过全基因组和各个病毒编码基因(核苷酸水平和氨基酸水平)比较分析发现：xCoV与SARS-CoV-2高度同源，与SARS-COV-2的S蛋白同源性达92.5％，是迄今为止成功分离培养的与SARS-COV-2的S蛋白同源性最高的病毒(图1)。不论是全基因组水平(图2)还是病毒吸附进入细胞的关键基因S基因(图3)，xCoV与SARS-CoV-2的同源性均远高于SARS病毒。
通过加入不同浓度的siRNA特异性敲降ACE2的表达，发现随着ACE2mRNA表达水平逐渐降低(图4)，xCoV感染细胞的能力显著逐渐下降，强烈提示ACE2是xCoV进入细胞的受体(图5)。
96孔细胞培养孔中，每个孔中分别加入终浓度为10μM的各种已知药物(2080多种上市药物和326种抗病毒化合物)中的一种化合物和MOI＝0.01的xCoV，处理后的Vero E6细胞在37℃、5％的CO2细胞培养箱中培养72小时。此时加入病毒不加化合物的细胞培养孔和绝大多数加入各种化合物的细胞培养孔中，细胞发生明显的细胞病变效应(图7)，同时，没有加入病毒和药物的细胞培养中细胞未见任何细胞病变(图8)。然后，在加入终浓度为10μM的千金藤素(图9)、西拉菌素(图10)和盐酸甲氟喹(图11)的病毒感染细胞培养孔中，未见明显细胞病变。强烈提示千金藤素、西拉菌素、盐酸甲氟喹是潜在的强力抗xCoV感染细胞抑制剂。
进一步通过实时定量PCR技术检测发现，与只加0.1％DMSO的对照组相比(所有化合物均溶于DMSO中，因此加入药物后每个细胞培养孔中的DMSO浓度为0.1％)，10微摩尔每升的千金藤素、西拉菌素、盐酸甲氟喹在感染复数0.01的xCoV感染细胞72小时后，分别能抑制病毒复制15393倍、5053倍、31倍(图12)。此实验结果已经重复5次，均可重复。
EC50、CC50与SI的结果显示，千金藤素(图13)、西拉菌素(图14)、盐酸甲氟喹(图15)对xCoV的抑制呈现浓度依赖现象。此外，千金藤素(图16)、西拉菌素(图17)、盐酸甲氟喹(图18)均在xCoV进入细胞后发挥抑制病毒作用。
具体地，图16示出了千金藤素对xCoV的Time-of-Addition试验结果，表明千金藤素是在xCoV进入细胞后发挥抑制作用，而不能抑制xCoV的入胞。图17示出了西拉菌素对xCoV的Time-of-Addition试验结果，表明西拉菌素是在xCoV进入细胞后发挥抑制作用，而不能抑制xCoV的入胞。图18示出了盐酸甲氟喹对xCoV的Time-of-Addition试验结果，表明盐酸甲氟喹是在xCoV进入细胞后发挥抑制作用，而不能抑制xCoV的入胞。
进一步的转录组测序分析提示，千金藤素主要通过干扰细胞应激反应，包括内质网应激/未折叠蛋白反应和HSF1介导的热休克反应来逆转受感染细胞中大多数失调的基因和通路，从而发挥抗冠状病毒效果(图19)。
三、讨论
对SARS-CoV-2病毒进行研究需要高水平的生物防护设施，这与研究的迫切需要相冲突。发明人分离的穿山甲冠状病毒xCoV对人体的致病性较低或无致病性，为研究与其密切相关的SARS-CoV-2提供了一种可供选择的模式，供没有生物安全3级设施的研究人员使用。发明人之所以认为这种分离物对人体的致病性低或无致病性，是因为早在2017年，与穿山甲有密切接触的人群中未发现疑似感染；发明人的穿山甲冠状病毒xCoV分离物是在生物安全二级设施中常规培养的。
在2013年从云南的一只亲鼻蝠采集的样本中发现的一种冠状病毒与SARS-CoV-2密切相关，因此，推测蝙蝠可能也是SARS-CoV-2的宿主。近日，华南农业大学的研究人员宣布发现穿山甲(Manisjavanica)是SARS-CoV-2的中间宿主。同样，在2019年10月，一项针对穿山甲的病毒全基因组研究发现了SARS-CoV相关序列，在出现SARS-CoV-2后，该序列被重新鉴定为SARS-CoV-2相关序列。此外，发明人还从已死亡的走私穿山甲中分离培养了一株SARS-CoV-2相关冠状病毒xCoV。通过全基因组和各个病毒编码基因(核苷酸和氨基酸)比较分析发现xCoV与SARS-CoV-2高度同源，与SARS-COV-2的S蛋白同源性达92.5％，是迄今为止成功分离培养的与SARS-COV-2的S蛋白同源性最高的病毒(图1)。不论是全基因组水平(图2)还是病毒吸附进入细胞的关键基因S基因(图3)，xCoV与SARS-CoV-2的同源性均远高于SARS病毒。
在本研究中，发明人在SARS-CoV-2相关冠状病毒即穿山甲冠状病毒xCoV模型中进行了抗冠状病毒活性药物的筛选。基于实验室前期研究结果发现，xCoV感染哺乳动物细胞Vero E6(非洲绿猴肾细胞)以后能使细胞产生非常明显的细胞病变。基于这一特点，发明人在前期使用xCoV感染96孔细胞培养板中的Vero细胞，同时向每个细胞培养孔中加入单个的上市药物(2080多种上市药物和326种抗病毒化合物)，进行潜在的抑制病毒复制的活性药物筛选。在第3天时通过显微镜下观察细胞病变，结果发现有3种潜在药物对病毒感染细胞抑制明显(3种药物分别是千金藤素、西拉菌素和盐酸甲氟喹)。由于xCoV与目前的SARS-COV-2高度同源，且xCoV感染细胞的受体与SARS-COV-2一致，如果药物对xCoV感染细胞有抑制作用，则其对SARS-COV-2的感染也有抑制作用。
值得注意的是，王一飞等人2003的专利“千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用”中提到千金藤素对2003年引起非典的SARS-CoV病毒的半数抑制剂量为8μg/ml(13.186μM)，即13.186μM的千金藤素终浓度能抑制50％的病毒感染。而发明人的实验结果显示，使用更低浓度的千金藤素(10μM)，抑制xCoV病毒复制的能力达到15393倍。因此，千金藤素对xCoV病毒复制的抑制能力至少比对SARS-CoV病毒复制的抑制能力强30786倍。此外，千金藤素对SARS-CoV的抑制(实际上是低效抑制)并不能说明其能强力有效地抑制xCoV和SARS-CoV-2。事实上，发明人已测试了的上市药物库中包含了很多可以有效抑制SARS-CoV病毒复制的药物(如磷酸奥司他韦)，但它们(如磷酸奥司他韦)对xCoV和SARS-CoV-2的复制却几乎没有抑制作用。这其中的主要原因之一是由于SARS-CoV病毒与SARS-CoV-2病毒同源性较远，SARS-CoV病毒和SARS-CoV-2病毒在基因组和氨基酸水平差异较大，造成对SARS-CoV病毒有抑制作用的药物很可能对xCoV和SARS-CoV-2没有任何影响(如磷酸奥司他韦)。而xCoV分离自从海关查获的死亡的穿山甲中，与SARS-CoV-2高度同源，是目前可分离培养的冠状病毒中与SARS-CoV-2同源性最高的病毒。因此，本发明中的对xCoV有强烈抑制作用的千金藤素、西拉菌素和盐酸甲氟喹也能够抑制SARS-CoV-2的病毒复制，极有可能成为新型冠状病毒肺炎的特效药，并建议这些药物可用于SARS-CoV-2患者的临床试验。
发明人认为，作为一种潜在的治疗SARS-CoV-2的药物，千金藤素具有特别重大的的药用价值。该药是从防己科植物头花千金藤、地不容中分离提取的双节基异哇琳生物碱，被批准用于白细胞减少症。它具有多种功能，如抑制抗肿瘤药物的外排转运体ABCC10，通过降低质膜流动性抑制HIV-1的进入，与Hsp90的中心部分结合。重要的是，大剂量的这种药物在动物身上具有低毒性，在人类中没有明显的副作用。此外，有研究表明SARS-CoV-2可以引起外周血单个核细胞的细胞应激反应和自噬途径相关基因的富集，而千金藤素可以有效逆转受感染细胞中大多数失调的基因和途径，尤其是内质网应激/未折叠蛋白应答和HSF1介导的热休克应答，由此发挥抗冠状病毒感染效果。鉴于所观察到的对病毒复制的强烈抑制作用和该药物已确立的抗炎作用，发明人认为，千金藤素是治疗SARS-CoV-2感染的一个有前途的候选药物。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 穿山甲冠状病毒xCoV及其应用和药物抗冠状病毒感染的应用
<130> CPCN21110144
<150> 2020100968681
<151> 2020-02-16
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29837
<212> DNA
<213> xCoV
<400> 1
gctttaactt tttacaaatc ccaggtagca aaaccaacca actctcgatc tcttgtagat 60
ctgttctcta aacgaacttt aaaatctgtg tggctgtcac ttggctgcat gcctagtgca 120
ctcacgcagt ataataataa ttaattactg tcgttgacag gaaacgagta actcgtccgt 180
cttctgcaga ctgcttacgg tttcgtccgt gttgcagtcg atcatcagca tacctaggtt 240
ttgtccgggt gtgaccgaaa ggtaagatgg agagccttgt ccctggtttc aacgagaaaa 300
cacacgtcca actcagtttg cctgttcttc aggttcgcga cgtgctagta cgtggctttg 360
gagactccgt ggaggaggct ctatcagagg cacgtcaaca tcttcttgac ggcacttgtg 420
gcataatcga tgttgaaaag ggagtactcc cccaactcga acagccctat gtgtttgtca 480
aacgttctga tgcccgaact gctcctcacg gccatgtaat ggttgaattg gtggcagaac 540
tcgatggtgt tcagtacggt cgtagcggtg agactcttgg tgttcttgta ccacatgttg 600
gtgaaacacc tgttgcttat cgcaaaattc ttctccgtaa gaatggtaat aagggagccg 660
gtggtcatag tttcggcatc gatctaaagt cttatgactt aggtgacgag cttggcactg 720
atcccattga tgactttcaa gtcaactgga acactaaaca tggcagtggt gtaactcgtg 780
agctcatgcg tgagcttaat gggggcgcat acactcgcta tgtagacaat aacttctgtg 840
gccctgacgg ctaccctctt gagtgcatca aagacttatt agctcgtgct ggaaagtctt 900
cttgctcttt gtccgaacaa ctggacttta ttgacactaa aagaggtgtg tactgctgcc 960
gtgaacatga acatgaaatt gtttggtaca cggaacgctc cgacaagagc tacgaattac 1020
agacaccttt tgaaatcaaa ttggcaaaga aatttgacaa tttcacaggg gaatgtccaa 1080
actttgtctt cccactaaat tctacaatca agaccattca accacgtgtt gaaaagaaaa 1140
agcttgaggg ttttatgggt agaattcgat ctgtctatcc tgttgcatca ccaaatgaat 1200
gcaacccaat gcacctttcg acgcttatga agtgtgaaca ttgtagtgaa acttcatggc 1260
aaactggtga cttccttaaa gccacttgtg aattttgtgg tactgaaaat caagtcaaag 1320
aaggacctac cacttgtggt taccttcctc aaaatgctgt agtaaaaatt ttttgtccag 1380
catgtcataa tccagaaatg ggacctgagc acagtctcgc agaataccat aatgaatctg 1440
gtattaaaac cactcttcgt aaaggtggtc gtaccaaagc atttggagga tgtgtgttct 1500
cttatgtggg ctgtcacaac aagtgtgcct attgggtgcc tcgtgctgct gctaacgtag 1560
gatgtaacca cacaggagtt gtgggagaag gttctgaaag tctcaatgat aaccttcttg 1620
aaatacttac taaggagaaa gtcaacatta acattgttgg tgactttaaa ctgactgaag 1680
agatcgccat aatcttggca tctttttctg catccacgag tgctttcgtg gaaactgtga 1740
agggcttgga ttacaagtct ttcaaacaaa ttgttgaatc ctgtggtaac tttaaagtaa 1800
ccaagggaaa attcaagaag aatgcttgga atattggtga accaaagtcc atactgagcc 1860
ctctgtatgc atttccctca gaagctgctc gtgtggtacg ttccattttt tcacgcactc 1920
ttgaaactgc tcaacactct gtgcgtgtct tgcaaaaggc cgctattaca attctggacg 1980
gaatttcaca gtactcactc agattgattg atgctatgtt gttcacgtct gaacttacaa 2040
cagacagtat cgtagtgatg gcatacgtca caggtggtgt tgtacaaatg actacacaat 2100
ggcttaccaa tatttttggt actgtgtatg aaaaattgaa acctattctt gactggcttg 2160
aagagaagtt caaggaaggg atagagtttc ttaaggacgg ttgggagatt gtaaaattca 2220
tcacaacctg ttcttgtgaa atcattggtg gacagcttgt agcattcacc actgaactta 2280
aagacagtgt gaagaaattt ttcaaactgg ttaacaaatt tcttgctctt tgtgctgatt 2340
ccatcgtcat tggtggtgca aaacttaaag ctttgaattt gggagaaacc tttgtcgcac 2400
actccagagg actctacaaa aagtgtgtga aatccagagg agactctggt ttactcatgc 2460
ctctaaaagc accaaaagaa gttatcttcc ttgatggaga aactttgcct acagaggtac 2520
tttcagaaga agtaatacta aaaactggtg aattacaacc acttgaggaa ccaactgcac 2580
aggcagttga agtaccactc gtaggtacac cagtttgcat taatggatta atgctgcttg 2640
aaattaaaga tactgaaaag tattgtgctc ttgcacctaa catgatggtc actaataata 2700
ccttcactct aaaaggtggt gcaccaacca aagtcacatt tggtgatgac acagtcattg 2760
aagtccaagg ctacaagaat gtgaatatca catttgaatt ggatgaacga gtagataaag 2820
tactcaacga aaagtgctct aactacactg tagaacttgg aaccaacata gatgaattgg 2880
cttgtgttgt agctgaggca gtaataaaga ctttgcaacc tgtttcagaa ttacttacac 2940
cgctaggcat tgacttagac gagtggggtg ttgcaaccta ttacttgttt gacgagtctg 3000
gtgagtatac tttgtcttca cgtatgtatt gttcattcta tcctccagat gaggattatg 3060
aagaagaata cagcgaagag gaacaacctg aacaaccaac tcaatatgag tatggtactg 3120
aatctgatta caaaggtttg cctttggaat ttggtgcatc ttctgtacaa caacaggaag 3180
aacaagaaga agattggtta gaaactgaag ctgaagtggt ggaacaagaa gttacaccaa 3240
ctgagcaaga ggaagagcta ccaatcactg aaattgttcc tgcagtggaa caaactacaa 3300
ttgtagagct agaatgtgat aatttcactg gttatttaaa actcactgat aatgtttcca 3360
ttaaaaatgt ggatattgta agtgaggcta aaaatgtaaa acctacaata gtggttaatg 3420
ctgctaatgt acacctaaaa catggtggtg gtgttgctgg tgctcttaac aaagctacta 3480
acaacgctat gcaaattgag tctgatgact acattgccag aaatggacca ctaaacgtgg 3540
gtggtagttg tcttctaaat ggacacaatt tggctaaaaa ctgccttcat gttgttggtc 3600
ctaatctcaa caagggtgaa gacattcaat tacttaaagt tgcctatgaa aatttcaatc 3660
atcatgaaaa attacttgca ccacttctct cagcaggcat ctttggtgca caaccaatac 3720
agtctttgaa ggtgtgtatt gaaacagtac gcacacaagt ctttttagct gtctttgaca 3780
aggacctcta tgaagaactt gtagctagct ttttagaaat gaaaagtgag actaaagtac 3840
aagatcactt tgacgtcgtt gagactaagg ttgaaattac acctgaagaa tctgcttcaa 3900
gtgagaaacc taccaaggaa gagcctaaaa aggtgaaacc ttgtattgaa gaagttacaa 3960
ctactctaga agaaactaag tttcttacag aaaacttgtt actgtatgca gacattaatg 4020
gtaatctgta tccagattca accagtcttg tggaaaatgt tgatgtcacc ttccttaaaa 4080
aggatgctcc ttatatagta ggtgacataa ttactagtgg taatttaaca accgttgtca 4140
taccaacaaa gaaagcaggt ggtactacag aaatgcttgc aaaggcattg cgtaaagtac 4200
ctactgacca ttatataacc acctaccccg gacagggttg cgttggttat acaattgagg 4260
aagcaaaaac agctcttaag aagagtaaga gtgcttatta tgtattaccc tctataattc 4320
caaataagaa agaagaaatt cttggtactg tttcttggaa cttgcgtgaa atgcttacgc 4380
atgctgaaga aacacgtaaa ttaatgccta tttgcatgga tacaaaggct ataatgtcta 4440
ctgtgcaaag gaagtataag ggtattaaga tacaggaggg agtcgtggac tacggtgtaa 4500
ggttttactt ctatactagt aaaacacctg tagctacact tattgcaact cttaattcat 4560
taggagaaac cttggtcaca atgcctttgg gttatgtgac acatggttta aatttagaag 4620
aggctgctag gtatatgaga tcactcaaag tacccgcaac cgtttctgtt tcttcaccag 4680
atgctgttac agcatataat ggttacctta cttcctcttc aaagactcct gaagagcatt 4740
tcatagaaac catctcacta gctggttcat ataaagactg gtcctattca ggacaggcta 4800
ctgaattagg tattgaattt cttaaaagag gtgacaaagt tgtctaccac acaactagta 4860
aaccaatcac tttccacatg gatggtgagg ttatcaacat tgacagtctt aagacactcc 4920
tagctcttag ggaagttaag accattaagg tgtttaccac agttgacaac attaatcttc 4980
acactcaagt tgtggacatg tctatgactt atggacaaca gtttggtcca acctacttgg 5040
acggagctga cgttacaaag attaaacctc atgcatctca tgacagcaag acattttatg 5100
tgttgcctaa tgatgataca ctacgcagtg aggcttttga gtactatcac acaactgatg 5160
aaagttttct aggtagatac atgtcagcat taaatcatac taagaaatgg aaatttccac 5220
aggttaatgg tttaacatcc attaaatggg cagataacaa ttgttaccta gccacagcct 5280
tattaactct tcaacagata gaattgaagt ttaatccacc agcattgcaa gacgcctact 5340
acagggctag agttggtgat gctgcaaatt tctgtgcact tatacttgct tactgtaata 5400
aaacagtggg tgagctaggt gatgtaagag aaacaatgag tcatttgttt caacatgcca 5460
acttggattc ttgtaaaaga gtcctaaatg tggtgtgtaa aacttgtgga cagcaacaaa 5520
ctaccttaaa gggtgtagag gctgtaatgt atatgggtac actttcttat gaacaactta 5580
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ttgtttataa actagacggt gttgtgtgta cagaaattga tcctaaattg gatggttact 5940
ataaaaagga taatgcctat tttactgaac agccaattga tttagtgcca actcaacctt 6000
acccaaactc aaactttgac aatttcaagt ttgtttgtga caacaccaaa tttgctgatg 6060
acttaaacca gatgtctggt tataagaagc ctgcttctcg tgagcttaag attacttttt 6120
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agaaaggtgc taagttgttg cacaagccta ttgtatggca tgtgaataac acaattaaca 6240
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cctgtgagga cactaaactt gtcactgaag aagtagtgga aactcctacc atacagaaag 6420
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taggttcttt aatctattca agtgctgctt taggtgtttt gatgtctaat ctaggtatgc 7020
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gaggtaaagg attttgtaaa ctacataact ggaattgtgt caattgtgat actttctgtg 7620
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attacagtca gcttatgtgt caacctatat tgttacttga ccaggcgtta gtgtctgatg 7980
ttggtgacag tgcagaagta gctgttaaaa tgtttgatgc ttatgttaat acattctcat 8040
caacttttaa cgtgcctatg gataagttaa aaactctcat tgcaacagct gagactgaac 8100
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aatcagacat tgaagttaca ggtgacagtt gtaataacta tatgctcacc tataacaaag 8280
tggaaaacat gacgcctaga gatctaggtg cttgtattga ttgcagtgca cgtcatatta 8340
atgcacaagt agcaaaaagt cacaacattt ctttgatttg gaacattaaa gatttcatgt 8400
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gtgatgtagg atttgtagtt cctggtttac caggaacaat tttccgtaca ttaagtggtg 8880
actttttaca tttcttacct agagtgttta gtgctgttgg caatatttgc tacacaccat 8940
ccaaacttat agagtacact gacttcgcaa catcagcctg tgttttagca gctgaatgta 9000
ccatattcaa agatgcagct ggaaagcctg tgccatattg ttatgacact aatgtgctcg 9060
aaggttctgt accttatgaa tcactccgtc cagacacacg ttatgtcttg atggatggtt 9120
ctattataca attccctaac acgtaccttg aaggttctgt tagagttgtt acaacttttg 9180
actctgagta ctgtagacat ggtacttgtg aaaaatctga agctggcatc tgtgtttcca 9240
ctagtggtag atgggtgctt aataatgatt attatagatc attacctggt gtgttttgtg 9300
gtgttgattc tgtaaatctc ttaacaaata tgtttacacc tttgattcaa cctattggtg 9360
ctttagacat atcagcttca attgttgcag gtggtttagt tgctatattt gtaacttgtc 9420
ttgcatacta ttttatgagg ttcaggagag cttttggcga atacagtcat gtagttgcct 9480
ttaatactct cttgtttttg atgtccttta ctgtactctg tcttacgcct gtgtatagtt 9540
tcttaccagg tgtttattca gttttttatt tgtacttgac attttatctt actaatgatg 9600
tttcattttt agctcatgtt caatggatgg tcatgttcac tcctttagta cctttctgga 9660
ttacaattgt ttatgtcatt tgtatatcta ctaagcattg ttactggttc tttagtaatt 9720
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ccatggacac aactagctac agagaagcag catgctgtca tcttgctaag gctctaaatg 9960
atttcagtaa ctcaggttct gatgtgctct accaaccacc acagacatcc attacatcgg 10020
ctgtccttca aagtggattt agaaaaatgg cttttccatc tggtaaggta gaaggttgta 10080
tggtgcaagt tacttgtgga acaactacac ttaatggtct ttggcttgat gatgtggtct 10140
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tgcttattcg taaatctaac cataattttc tggtacaagc tggtaatgtt catttgagag 10260
ttatcggaca ttctatgcaa aattgtgttc ttaagttgaa agttgacgct gccaacccta 10320
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ctgaagtgca aattgatagg ttaatcacag gaagactaca gagtcttcaa acttatgtga 24540
cacaacaatt aatcagagca gcagaaatca gagcttctgc taatcttgct gcaacaaaaa 24600
tgtctgagtg cgtactcgga caatctaaaa gagttgattt ttgtggaaaa ggctaccatt 24660
taatgtcttt ccctcaatca gcaccgcatg gtgttgtttt cttgcatgtt acttatgtac 24720
ctgcacaaga aaagaacttt actactgctc ctgctatttg tcatgaagga aaagcacact 24780
tccctcgtga aggtgtcttc gtttcaaatg gcactcattg gtttattaca caaaggaatt 24840
tttatgaacc tcaaattatt accactgaca acacattcgt ctctggtagc tgtgatgttg 24900
taattggaat agtcaacaac acagtttatg atcctttgca acccgagctt gactcattta 24960
aggaggagtt agacaaatac ttcaaaaatc acacatcacc agatgttgat cttggcgaca 25020
tatctggcat aaatgcttcg gtcgtcaaca tacaaaaaga aattgaccgc ctcaatgagg 25080
ttgccaaaaa tttgaatgaa tcactcattg acctacaaga gcttggaaaa tatgagcaat 25140
acatcaaatg gccttggtac atttggcttg gttttatagc tgggctaatt gctatcatta 25200
tggtcacaat catgctatgt tgtatgacta gttgctgtag ttgcctcaag ggttgttgct 25260
cttgcggttc ctgctgcaaa tttgatgaag acgattcaga acctgttctg aaaggagtca 25320
aattacatta cacataaacg aacttaatgg atttgtttat gagaattttt aatcttggat 25380
ctgtaacatt caaaccagga aaaattgaag atgctactcc ttcagattct attcgcgcta 25440
ctgcaacgat accgatacaa gcctcactcc ctttcggatg gcttattgtt ggcgttgcac 25500
ttcttgctgt ttttcagagc gcttccaaaa taattacact caaaaagagg tggcaatttg 25560
ctctctccaa gggtgttcat tttgcttgca acttgcttct actatttgtt acagtctact 25620
ctcacctttt gcttgttgct gctggccttg aagcccaatt tctctatctt tacgctttag 25680
tttattttct gcaaagtgtt aatgcttgca gaattattat gaggctttgg ctgtgctgga 25740
agtgcagatc caaaaatcca ttactttatg atgccaatta ctttctttgc tggcatacta 25800
attgctatga ctattgtata ccatataata gcataacttc ttcaattgtc attacatcag 25860
gtgatggcac tccaagtcct attacagacc atgactacca aattggtggt tatacggaaa 25920
agtgggaatc tggtgttaaa gactgtgtta cattacatgg ttactttaca tcagaatgct 25980
accagctgta ctctacacaa cttagtacag atactggtgt tgaacatact accttcttca 26040
tttacagtag aattgtggat gaaccagaag accatgttca aattcacaca atcgacggct 26100
catcaggagt tgtaaatcca gcaatggatc ctatctatga tgagccgacg acgactacta 26160
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tagtcacact agccatcctt actgcgcttc gattgtgtgc gtactgctgc aatattgtta 26340
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ctagagttcc tgatcttctg gtctaaacga actaaatatt ttagtttttc tgtttggaac 26460
tttaatttta gccatgtcag ctaacaacgg tactattacc gttgaagagc ttaaaaagct 26520
cttagaacaa tggaacctag taataggttt cctatttcta acatggattt gtcttttaca 26580
gttcgcctat gctaacagga ataggtttct gtacataatt aagttaattt tcctctggct 26640
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taccggtgga atcgcgattg caatgacttg tcttgtgggc ttgatgtggc ttagctactt 26760
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tgaacttgtc atcggtgctg tgatcctcag aggacacctt cgcattgctg gacatcatct 26940
aggacgctgt gacatcaagg acctgccaaa agaaatcact gtagctacat cacgaacgct 27000
ttcttattac aaattgggag cttcgcagcg tgtagccggt gactcaggtt ttgctgcata 27060
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tattgctttg cttgtacagt aagtgacaac agatgtttca tctcgttgac tttcaggtta 27180
ctatagcaga gatacttatt attattatga gaactttcaa gatttccatt tggaaccttg 27240
attacatcat taatctcata attaaaaatt tatctaagcc tttaactgaa aataaatatt 27300
ctcagttaga cgaagagcaa ccaatggaga ttgattaaac gaacatgaaa attattcttc 27360
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gtacaactgt actaataaag gaaccttgct cttctggaac ttacgagggc aattcaccat 27480
ttcatcctct tgctgataat aaatttgcac ttgcttgcac aagccaacaa tttgcttttg 27540
cttgccctga cggtactaaa catacctttc agttacgtgc gagatcagtt tcaccaaaac 27600
ttttcatcag acaagaggaa gttcaagaac tttactcacc acttttcctc ataattgctg 27660
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catgatattt tggttttgct ttgacactcc aagatgatga tgagtgttgc caagtctaaa 27840
cgaacatgaa atttcttgtt ttacttggaa tactaacaac agtacacaca ttccatcagg 27900
aatgtagttt acagtcatgt caattcaatt caccttatgt agttgatgat ccatgcccta 27960
tacatttcta ctcgaaatgg tatattaggg tcggtgctag aaaatctgca ccattgattg 28020
aactctgtgt tgatgaagta ggttcaaaaa cacctattaa atacatcgac attggcaact 28080
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atttcatcta aacgaacaaa caaaatgtct gataatggac cccaaaatcg tgcaccccgc 28260
attacatttg gtggaccctc agattcgact gacaataacc agaatggaga ccgcagtgga 28320
gcaaggccaa aacaacgaag gccccaggga ttacccaata atactgcgtc ttggttcacc 28380
gctctcactc aacatggtaa ggaagacctt agattccctc gaggacaagg tgttccgatt 28440
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cgtggtggtg acggtaaaat gaaagatctc agtccacgat ggtacttcta ttaccttgga 28560
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tccaagaaac ctcgccaaaa acgtactgcc actaaacaat acaatgtcac tcaggcattt 29040
ggcagacgtg gtcctgaaca aacccaagga aattttgggg accaagaatt aatcagacaa 29100
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ggtgccatca agcttgatga caaagatcca agcttcaaag acaacgtcat actgctgaac 29280
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aagactgacg aaagccagcc tttaccgcag agacagaaga aacaacaaac tgtgactctt 29400
cttcctgctg cagatttgga tgatttctcc aaacaattgc aacaatccat gagcagtgct 29460
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agggtacagt gaataatgct agggagagct gcctatatgg aagagcccta atgtgtaaat 29760
taattttagt agtgctatcc ccatgtgatt ttaatagctt cttaggagaa tgacaaaaaa 29820
aaaaaaaaaa aaaaaaa 29837
<210> 2
<211> 3723
<212> DNA
<213> xCoV
<400> 2
ccaggttata ccaattcatc tactagaggt gtctattatc cagacaaagt ttttaggtct 60
tcaattttac atcttacaca agaccttttc ttacctttct tttctaatgt tacttggttt 120
aacaccataa attatcaagg aggctttaag aagtttgaca atcctgtttt accatttaat 180
gatggtgttt actttgcctc cacggaaaag tccaatatta tacgcggttg gatttttgga 240
acaacacttg atgccagaac tcaatctctt ctaatagtta acaacgcaac caatgttgtt 300
atcaaagtat gtgagtttca gttttgcact gatccatttt taggtgttta ctatcataac 360
aacaataaaa catgggttga aaatgagttt agagtttatt caagtgccaa caattgcact 420
ttcgaataca tttctcaacc ttttcttatg gaccttgaag gaaagcaagg taattttaag 480
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acacctattg atttagtgcg cgacctcccc agaggttttg ctgcattgga accactggtg 600
gacctcccta taggtattaa tattaccaga ttccaaacat tgcttgcttt acatagaagt 660
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ggttacctac aacagaggac ttttctctta agttacaatc aaaatggaac cattacagat 780
gctgttgatt gttcactaga ccctctttca gagacaaagt gcacattaaa atccctaaca 840
gttgaaaaag gaatttacca gacttctaac ttcagagttc aaccaacaat cagtatagtt 900
agatttccta atattacaaa cttatgtcca tttggagaag tgtttaacgc atccaaattt 960
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aatgaccttt gcttcaccaa tgtgtatgca gactcatttg ttgttaaagg tgacgaggtt 1140
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gattttactg gttgtgttat tgcttggaac tcagttaagc aagatgcttt gactggtggt 1260
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actgaaatat accaagccgg cagcacaccc tgtaacggtc aagttggtct aaattgttat 1380
tatcctcttg aaaggtatgg ttttcaccca actacaggtg ttaactacca accttttaga 1440
gtggttgttt tatcatttga gttacttaat ggaccagcta ctgtttgtgg acccaaattg 1500
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tctgacacta ctgatgctgt ccgtgaccca cagacacttg aaatacttga cattacccct 1680
tgctcttttg gaggagttag tgtgataaca ccaggtacaa acacttctaa tcaagtggct 1740
gtactttacc aagatgttaa ctgtactgaa gtgcctatgg ccattcatgc agaacaactt 1800
acacctgcct ggcgtgttta ctctgcagga gcaaatgtgt ttcaaacaag agcaggctgt 1860
ttagtaggtg ctgagcatgt caacaattct tatgaatgtg acattccagt cggtgctggc 1920
atatgtgcaa gttaccattc catgtcatca ttgcgtagtg tcaaccagcg ttcaatcatt 1980
gcttacacta tgtctttagg tgcagaaaat tcagttgctt attctaataa ttcaattgcc 2040
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taa 3723
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<211> 1240
<212> PRT
<213> xCoV
<400> 3
Pro Gly Tyr Thr Asn Ser Ser Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys
1 5 10 15
Val Phe Arg Ser Ser Ile Leu His Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro
20 25 30
Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe Asn Thr Ile Asn Tyr Gln Gly Gly
35 40 45
Phe Lys Lys Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr
50 55 60
Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly
65 70 75 80
Thr Thr Leu Asp Ala Arg Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala
85 90 95
Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Thr Asp Pro
100 105 110
Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Asn Asn Asn Lys Thr Trp Val Glu Asn
115 120 125
Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Ile
130 135 140
Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys
145 150 155 160
Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Val Asp Gly Tyr Phe Lys Ile
165 170 175
Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asp Leu Val Arg Asp Leu Pro Arg Gly
180 185 190
Phe Ala Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile
195 200 205
Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro
210 215 220
Gly Lys Leu Glu Ser Gly Trp Thr Thr Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val
225 230 235 240
Gly Tyr Leu Gln Gln Arg Thr Phe Leu Leu Ser Tyr Asn Gln Asn Gly
245 250 255
Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr
260 265 270
Lys Cys Thr Leu Lys Ser Leu Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr
275 280 285
Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Ile Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn
290 295 300
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Ser Lys Phe
305 310 315 320
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
325 330 335
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
340 345 350
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
355 360 365
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
370 375 380
Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
385 390 395 400
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Val Lys Gln Asp Ala
405 410 415
Leu Thr Gly Gly Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Lys Leu
420 425 430
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
435 440 445
Thr Pro Cys Asn Gly Gln Val Gly Leu Asn Cys Tyr Tyr Pro Leu Glu
450 455 460
Arg Tyr Gly Phe His Pro Thr Thr Gly Val Asn Tyr Gln Pro Phe Arg
465 470 475 480
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Gly Pro Ala Thr Val Cys
485 490 495
Gly Pro Lys Leu Ser Thr Thr Leu Val Lys Asp Lys Cys Val Asn Phe
500 505 510
Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Thr Ser Lys Lys
515 520 525
Gln Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ser Asp Thr Thr
530 535 540
Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro
545 550 555 560
Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser
565 570 575
Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro
580 585 590
Met Ala Ile His Ala Glu Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Val Tyr Ser
595 600 605
Ala Gly Ala Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Val Gly Ala
610 615 620
Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Val Gly Ala Gly
625 630 635 640
Ile Cys Ala Ser Tyr His Ser Met Ser Ser Leu Arg Ser Val Asn Gln
645 650 655
Arg Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val
660 665 670
Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser
675 680 685
Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp
690 695 700
Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Ile Glu Cys Ser Asn Leu Leu
705 710 715 720
Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly
725 730 735
Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val
740 745 750
Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn
755 760 765
Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe
770 775 780
Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe
785 790 795 800
Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu
805 810 815
Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu
820 825 830
Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr
835 840 845
Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro
850 855 860
Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln
865 870 875 880
Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser
885 890 895
Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu
900 905 910
Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr
915 920 925
Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu
930 935 940
Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile
945 950 955 960
Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr
965 970 975
Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala
980 985 990
Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp
995 1000 1005
Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro
1010 1015 1020
His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys
1025 1030 1035 1040
Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala His Phe
1045 1050 1055
Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Ile Thr
1060 1065 1070
Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe
1075 1080 1085
Val Ser Gly Ser Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val
1090 1095 1100
Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp
1105 1110 1115 1120
Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile
1125 1130 1135
Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg
1140 1145 1150
Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln
1155 1160 1165
Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp
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Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Ile Met Val Thr Ile Met
1185 1190 1195 1200
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser
1205 1210 1215
Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu
1220 1225 1230
Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1235 1240
<210> 4
<211> 3822
<212> RNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 4
auguuuguuu uucuuguuuu auugccacua gucucuaguc aguguguuaa ucuuacaacc 60
agaacucaau uacccccugc auacacuaau ucuuucacac gugguguuua uuacccugac 120
aaaguuuuca gauccucagu uuuacauuca acucaggacu uguucuuacc uuucuuuucc 180
aauguuacuu gguuccaugc uauacauguc ucugggacca augguacuaa gagguuugau 240
aacccugucc uaccauuuaa ugaugguguu uauuuugcuu ccacugagaa gucuaacaua 300
auaagaggcu ggauuuuugg uacuacuuua gauucgaaga cccagucccu acuuauuguu 360
aauaacgcua cuaauguugu uauuaaaguc ugugaauuuc aauuuuguaa ugauccauuu 420
uuggguguuu auuaccacaa aaacaacaaa aguuggaugg aaagugaguu cagaguuuau 480
ucuagugcga auaauugcac uuuugaauau gucucucagc cuuuucuuau ggaccuugaa 540
ggaaaacagg guaauuucaa aaaucuuagg gaauuugugu uuaagaauau ugaugguuau 600
uuuaaaauau auucuaagca cacgccuauu aauuuagugc gugaucuccc ucaggguuuu 660
ucggcuuuag aaccauuggu agauuugcca auagguauua acaucacuag guuucaaacu 720
uuacuugcuu uacauagaag uuauuugacu ccuggugauu cuucuucagg uuggacagcu 780
ggugcugcag cuuauuaugu ggguuaucuu caaccuagga cuuuucuauu aaaauauaau 840
gaaaauggaa ccauuacaga ugcuguagac ugugcacuug acccucucuc agaaacaaag 900
uguacguuga aauccuucac uguagaaaaa ggaaucuauc aaacuucuaa cuuuagaguc 960
caaccaacag aaucuauugu uagauuuccu aauauuacaa acuugugccc uuuuggugaa 1020
guuuuuaacg ccaccagauu ugcaucuguu uaugcuugga acaggaagag aaucagcaac 1080
uguguugcug auuauucugu ccuauauaau uccgcaucau uuuccacuuu uaaguguuau 1140
ggagugucuc cuacuaaauu aaaugaucuc ugcuuuacua augucuaugc agauucauuu 1200
guaauuagag gugaugaagu cagacaaauc gcuccagggc aaacuggaaa gauugcugau 1260
uauaauuaua aauuaccaga ugauuuuaca ggcugcguua uagcuuggaa uucuaacaau 1320
cuugauucua agguuggugg uaauuauaau uaccuguaua gauuguuuag gaagucuaau 1380
cucaaaccuu uugagagaga uauuucaacu gaaaucuauc aggccgguag cacaccuugu 1440
aaugguguug aagguuuuaa uuguuacuuu ccuuuacaau cauaugguuu ccaacccacu 1500
aaugguguug guuaccaacc auacagagua guaguacuuu cuuuugaacu ucuacaugca 1560
ccagcaacug uuuguggacc uaaaaagucu acuaauuugg uuaaaaacaa augugucaau 1620
uucaacuuca augguuuaac aggcacaggu guucuuacug agucuaacaa aaaguuucug 1680
ccuuuccaac aauuuggcag agacauugcu gacacuacug augcuguccg ugauccacag 1740
acacuugaga uucuugacau uacaccaugu ucuuuuggug gugucagugu uauaacacca 1800
ggaacaaaua cuucuaacca gguugcuguu cuuuaucagg auguuaacug cacagaaguc 1860
ccuguugcua uucaugcaga ucaacuuacu ccuacuuggc guguuuauuc uacagguucu 1920
aauguuuuuc aaacacgugc aggcuguuua auaggggcug aacaugucaa caacucauau 1980
gagugugaca uacccauugg ugcagguaua ugcgcuaguu aucagacuca gacuaauucu 2040
ccucggcggg cacguagugu agcuagucaa uccaucauug ccuacacuau gucacuuggu 2100
gcagaaaauu caguugcuua cucuaauaac ucuauugcca uacccacaaa uuuuacuauu 2160
aguguuacca cagaaauucu accagugucu augaccaaga caucaguaga uuguacaaug 2220
uacauuugug gugauucaac ugaaugcagc aaucuuuugu ugcaauaugg caguuuuugu 2280
acacaauuaa accgugcuuu aacuggaaua gcuguugaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
guuuuugcac aagucaaaca aauuuacaaa acaccaccaa uuaaagauuu uggugguuuu 2400
aauuuuucac aaauauuacc agauccauca aaaccaagca agaggucauu uauugaagau 2460
cuacuuuuca acaaagugac acuugcagau gcuggcuuca ucaaacaaua uggugauugc 2520
cuuggugaua uugcugcuag agaccucauu ugugcacaaa aguuuaacgg ccuuacuguu 2580
uugccaccuu ugcucacaga ugaaaugauu gcucaauaca cuucugcacu guuagcgggu 2640
acaaucacuu cugguuggac cuuuggugca ggugcugcau uacaaauacc auuugcuaug 2700
caaauggcuu auagguuuaa ugguauugga guuacacaga auguucucua ugagaaccaa 2760
aaauugauug ccaaccaauu uaauagugcu auuggcaaaa uucaagacuc acuuucuucc 2820
acagcaagug cacuuggaaa acuucaagau guggucaacc aaaaugcaca agcuuuaaac 2880
acgcuuguua aacaacuuag cuccaauuuu ggugcaauuu caaguguuuu aaaugauauc 2940
cuuucacguc uugacaaagu ugaggcugaa gugcaaauug auagguugau cacaggcaga 3000
cuucaaaguu ugcagacaua ugugacucaa caauuaauua gagcugcaga aaucagagcu 3060
ucugcuaauc uugcugcuac uaaaauguca gaguguguac uuggacaauc aaaaagaguu 3120
gauuuuugug gaaagggcua ucaucuuaug uccuucccuc agucagcacc ucauggugua 3180
gucuucuugc augugacuua ugucccugca caagaaaaga acuucacaac ugcuccugcc 3240
auuugucaug auggaaaagc acacuuuccu cgugaaggug ucuuuguuuc aaauggcaca 3300
cacugguuug uaacacaaag gaauuuuuau gaaccacaaa ucauuacuac agacaacaca 3360
uuugugucug guaacuguga uguuguaaua ggaauuguca acaacacagu uuaugauccu 3420
uugcaaccug aauuagacuc auucaaggag gaguuagaua aauauuuuaa gaaucauaca 3480
ucaccagaug uugauuuagg ugacaucucu ggcauuaaug cuucaguugu aaacauucaa 3540
aaagaaauug accgccucaa ugagguugcc aagaauuuaa augaaucucu caucgaucuc 3600
caagaacuug gaaaguauga gcaguauaua aaauggccau gguacauuug gcuagguuuu 3660
auagcuggcu ugauugccau aguaauggug acaauuaugc uuugcuguau gaccaguugc 3720
uguaguuguc ucaagggcug uuguucuugu ggauccugcu gcaaauuuga ugaagacgac 3780
ucugagccag ugcucaaagg agucaaauua cauuacacau aa 3822
<210> 5
<211> 1273
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (151)..(151)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> UNSURE
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<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
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<223> The 'Xaa' at location 151 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> UNSURE
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<220>
<221> UNSURE
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<220>
<221> UNSURE
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<220>
<221> UNSURE
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<223> The 'Xaa' at location 758 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
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<223> The 'Xaa' at location 929 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
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<223> The 'Xaa' at location 943 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
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<220>
<221> UNSURE
<222> (1003)..(1003)
<223> The 'Xaa' at location 1003 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
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<223> The 'Xaa' at location 1239 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (1242)..(1242)
<223> The 'Xaa' at location 1242 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 5
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Xaa Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Xaa Trp Met Glu Xaa Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Xaa Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Xaa Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Xaa Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Xaa Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Xaa Val Ala
675 680 685
Xaa Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Xaa Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Xaa Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Xaa Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Xaa Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Xaa Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Xaa Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Xaa Cys Cys Xaa Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
ggtgattgcc ttggtgatat tg 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
gcaagtagtg cagaagtgta ttg 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
tctgtgagca aaggcggtag aacc 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
agtgtgacgt ggacatccgc aaag 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
atccacatct gctggaaggt ggac 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
cgaagccgaa gacctgttct a 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 12
gggcaagtgt ggactgttcc 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 13
gaggagacua ugaaguaaat t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 14
uuuacuucau agucuccuct t 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 15
cugggaugca cagagaauat t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 16
uauucucugu gcaucccagt t 21
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 17
ccacaccuca acuacauggu utt 23
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 18
uuuaaaugcu uagguguggt t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 19
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 20
acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (10)

1.一种穿山甲冠状病毒xCoV，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19295。
2.根据权利要求1的穿山甲冠状病毒xCoV，其全基因组核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:1所示。
3.根据权利要求1的穿山甲冠状病毒xCoV，其S基因的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1的穿山甲冠状病毒xCoV，其S蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:3所示。
5.根据权利要求1的穿山甲冠状病毒xCoV，其与SARS-COV-2的S蛋白同源性达92.5％。
6.权利要求1-5中任一项的穿山甲冠状病毒xCoV的应用，其用于抗SARS-COV-2病毒的活性药物的筛选与评价，抗SARS-COV-2病毒的疫苗的筛选与评价，以及用于制备抗SARS-COV-2病毒的减毒疫苗或灭活疫苗。
7.以下化合物中的任一种、两种或三种用于制备治疗冠状病毒感染性疾病的药物的用途：千金藤素(千金藤碱)、西拉菌素、盐酸甲氟喹和甲氟喹；优选地，所述冠状病毒为SARS-COV-2病毒。
8.一种用于筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的药物筛选模型，其包括权利要求1-5中任一项所述的穿山甲冠状病毒xCoV；
优选地，所述药物筛选模型为采用所述穿山甲冠状病毒xCoV感染的哺乳动物细胞，优选Vero细胞E6(非洲绿猴肾细胞)；
优选地，所述药物筛选模型用于筛选和/或评价有抗SARS-CoV-2病毒活性的药物。
9.一种筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的方法，其采用权利要求8中所述的药物筛选模型进行；
优选地，该方法用于筛选和/或评价有抗SARS-CoV-2活性的药物。
10.根据权利要求9所述的筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的方法，其包括步骤(1)：向所述药物筛选模型中加入待测试的药物并进行培养；
任选地，在步骤(1)之后还包括以下步骤(2a)或步骤(2b)，或同时包含步骤(2a)和步骤(2b)：
步骤(2a)：在显微镜下观察细胞病变；
步骤(2b)：测定细胞和上清中的病毒核酸。
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