CN113046289A - 一种在枯草芽孢杆菌中高效表达脂肪酶的方法 - Google Patents

一种在枯草芽孢杆菌中高效表达脂肪酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种在枯草芽孢杆菌中高效表达脂肪酶的方法，所使用的菌株为可分泌性表达脂肪酶的枯草芽孢杆菌工程菌，所述的枯草芽孢杆菌重组菌携带有表达载体，所述的表达载体中插入有用于编码脂肪酶的核苷酸片段，其中编码脂肪酶的核苷酸片段的序列为SEQID NO：2。本发明对脂肪酶发酵过程进行优化后，酶活最高达到801U/mL；优化后发酵结果是传统LB培养基培养所得枯草芽孢杆菌脂肪酶酶活的5.62倍，有效地提高了枯草芽孢杆菌脂肪酶的酶活。

Description

一种在枯草芽孢杆菌中高效表达脂肪酶的方法
技术领域
本发明属于基因工程和发酵工程技术领域，具体涉及一种在枯草芽孢杆菌中高效表达脂肪酶的方法。
背景技术
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)，又称三酰甘油酰基水解酶，Sarda和Desnnelv于1958年首次发现了脂肪酶作用于油水界面处底物展现其特有的催化特性而开始对其展开进一步研究。脂肪酶可以在水相中将甘油三脂水解成甘油和脂肪酸或者甘油一酯和二酯；在非水相体系中，脂肪酶也有着良好的酯化、转脂、醇解和胺解的性质，这些性质可以使脂肪酶在食品、制药、纺织、造纸等行业有广泛应用。
脂肪酶最先在动植物体内被发现，微生物学家Eijkmann第一次在微生物中发现了脂肪酶，随后开启了脂肪酶在微生物体中的研究，目前已发现的脂肪酶中微生物来源的脂肪酶最多。为了满足不同的工业化需求，需要发现不同种类和不同催化特性的新菌种。
1958年，Spizizen首次发现了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168菌株可以作为转化质粒的宿主菌株并建立了其化学感受态的制备方法，促进了枯草芽孢杆菌B.subtilis 168在基因工程方面的研究。在此之外，枯草芽孢杆菌B.subtilis168的全基因组在1997年完成了测序，为对其进行更深入的研究奠定了基础。目前来看，枯草芽孢杆菌B.subtilis作为一种革兰氏阳性菌已经被广泛的应用在了工业生产酶制剂以及杀虫剂等领域。
发酵过程控制是枯草芽孢杆菌B.subtilis规模化培养的关键技术，推动了相关产业的发展。现阶段，虽然枯草芽孢杆菌B.subtilis的发酵技术日趋成熟，但对于不同外源蛋白的生产要求，培养条件还是存在着差异。申请人发现构建的可产脂肪酶的枯草芽孢杆菌重组菌株表达脂肪酶的酶活就非常低；酶活仅为142.5U/mL。因此，如何提高枯草芽孢杆菌中表达脂肪酶的效率一直是研究热点之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种在枯草芽孢杆菌中高效表达脂肪酶的方法，构建了可以分泌脂肪酶的枯草芽孢杆菌重组菌，以及利用发酵工程来提高脂肪酶的表达效率，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种可分泌性表达脂肪酶的枯草芽孢杆菌工程菌，所述的枯草芽孢杆菌重组菌携带有表达载体，所述的表达载体中插入有用于编码脂肪酶的核苷酸片段，其中编码脂肪酶的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO：1：
ATGAAGATGTCCAGACTTGTGGCGTTCTCGTCCTCGCTCCTGCTCGGTGCCGCCCTCGCCCTGACCGGTGCGGGGATCGCGAACGCCGACTCGTCGGTCAAGGCCGTCGACTACGTCGCCCTCGGTGACTCGTACTCCTCCGGCGTCGGCGCCGGCAGCTACGAGAGCGCCAGCGGCGACTGCAAGCGCAGCACCCGCGCCTTCCCCCGGCTCTGGGCCAACGCCAACTCCCCGTCCAGCTTCGCCTTCACCGCCTGCTCCGGCGCCCGCACCAACGACGTCACGAGCAGTCAGCTCGGGCCGCTCAACGCCTCCACCGACCTGGTCTCCATCTCCATCGGCGGCAACGACGCCGGCTTCGCGGACGTCATGACGACCTGTGTCCTGCAGTCCGAGGCCACCTGCCTCAACCGCATCGCCACCGCCCGCGCCTACGTCGACTCCACCCTGCCCGGCCGCCTCGACTCCGTGTACAACGCCATCAAGGCCAAGGCCCCCAACGCCCGGGTCGTCGTCCTCGGCTACCCCCGCTTCTACCAGCTGAACGGCACCTGCGTGGCCGGTCTCAGCGAGCGGGAGCGCGCCGCCATCAACGGCGCCTCCGACCACCTGAACACCGCCACCGCCAAGCGCGCCGCCGACCACGGCTTCGCCTTCGGTGACGTCAGGACGACCTTCACCGGCCACGAGATCTGCTCCAGCAACTCCTGGTTGCACAGCGTGAACTGGCTCAACATCGGTGAGTCCTACCACCCCACCGCCGCCGGACAGTCGGGCGGCTATCTGCCGGTCTTCAACTCGGCTGCCTGA；
在本发明的一种实施方式中，对上述脂肪酶序列进行了优化，优化后的核苷酸序列如下(SEQ ID NO：2)：
ATGAAAATGTCACGCCTGGTGGCATTTTCATCATCACTGCTGCTGGGCGCAGCACTGGCACTTACAGGCGCAGGAATTGCAAATGCAGATTCATCAGTTAAAGCGGTGGATTACGTTGCGCTGGGCGATTCATATTCATCAGGCGTTGGCGCAGGCTCATATGAATCAGCATCAGGCGATTGCAAAAGATCAACAAGAGCATTTCCGAGACTGTGGGCAAATGCAAATTCACCGTCATCATTTGCATTTACGGCATGCTCAGGCGCAAGAACAAATGATGTTACATCATCACAACTGGGCCCGCTGAATGCATCAACAGATCTGGTTTCAATTAGCATCGGCGGCAATGATGCAGGCTTTGCAGATGTTATGACAACATGCGTTCTGCAATCAGAAGCAACATGCCTGAATAGAATTGCGACAGCAAGAGCATATGTGGACAGCACACTGCCGGGCAGACTGGATTCAGTTTATAATGCAATTAAGGCGAAGGCGCCGAACGCGAGAGTTGTTGTTCTGGGCTATCCGAGATTTTATCAACTGAATGGCACATGCGTTGCGGGCCTGTCAGAAAGAGAAAGAGCAGCAATTAATGGCGCATCAGATCATCTGAATACAGCGACAGCAAAACGCGCGGCAGATCATGGCTTTGCATTTGGCGATGTTAGAACAACATTTACGGGCCATGAAATTTGCTCATCAAATAGCTGGCTGCACTCAGTTAATTGGCTGAATATTGGCGAATCATACCACCCGACAGCAGCAGGCCAATCAGGCGGATATCTTCCGGTTTTTAATTCAGCAGCATGA。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的宿主菌是枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的表达载体是pP43NMK。
本发明还提供一种制备脂肪酶的方法，是使用上述的可分泌性表达脂肪酶的枯草芽孢杆菌重组菌来发酵制备脂肪酶；
本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌重组菌的大规模发酵方法，其中使用的培养基配方如下：31.4g/L的葡萄糖、1.3g/L的ZnCl2、25.0g/L的酵母粉、17mmol/L KH2PO4、72mmol/L K2HPO4；
发酵培养条件如下：发酵温度30℃、发酵罐转速200r/min、发酵初始pH为7.0。
本发明对脂肪酶发酵过程进行优化后，酶活最高达到801U/mL；优化后发酵结果是传统LB培养基培养所得枯草芽孢杆菌脂肪酶酶活的5.62倍，有效地提高了枯草芽孢杆菌脂肪酶的酶活。
附图说明
图1：本发明实施例1提供的构建完成的pP43NMK-lip15质粒图。
图2：本发明实施例2提供的密码子优化后与原序列的碱基对比图。
图3：本发明实施例2提供的脂肪酶密码子优化前后的凝胶电泳对比图。
图4：本发明实施例3提供的单因素实验时对五种不同基本培养基的筛选图。
图5：本发明实施例3提供的单因素实验时对四种不同碳源的筛选图。
图6：本发明实施例3提供的单因素实验时对碳源添加量的筛选图。
图7：本发明实施例3提供的单因素实验时对五种不同氮源的筛选图。
图8：本发明实施例3提供的单因素实验时对氮源添加量的筛选图。
图9：本发明实施例3提供的单因素实验时对五种不同无机盐的筛选图。
图10：本发明实施例3提供的单因素实验时对五种不同无机盐的筛选图。
图11：本发明实施例3提供的单因素实验时对不同初始pH的筛选图。
图12：本发明实施例3提供的单因素实验时对不同培养温度的筛选图。
图13：本发明实施例4提供的酶活与葡萄糖浓度和ZnCl2浓度的曲面图。
图14：本发明实施例4提供的酶活与葡萄糖浓度和ZnCl2浓度的等值线图。
图15：本发明实施例4提供的预测结果验证图。
图16：本发明实施例5提供的发酵罐培养条件实验中不同初始pH的筛选图。
图17：本发明实施例5提供的发酵罐培养条件实验中不同转速的筛选图。
图18：本发明实施例5提供的发酵罐培养条件实验中不同初始温度筛选图。
具体实施方式
申请人针对枯草芽孢杆菌中表达脂肪酶的效率不高的问题，首先对编码序列进行密码子优化，在不改变蛋白质序列的情况下提高蛋白质表达水平。同时建立了发酵方法，有效的提高了在枯草芽孢杆菌中表达脂肪酶的效率。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：重组载体的构建和表达
1)设计含有同源臂的引物lip15-F：
GTAACACATGCCTCAGCTGCAATGAAGATGTCCAGACTTGT和lip15-R：CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGCAGCCGAGTTGAAG，
以Streptomyces bacillaris ATCC 15855T的基因组为模板进行PCR而得到脂肪酶的序列(SEQ ID NO：1)：
ATGAAGATGTCCAGACTTGTGGCGTTCTCGTCCTCGCTCCTGCTCGGTGCCGCCCTCGCCCTGACCGGTGCGGGGATCGCGAACGCCGACTCGTCGGTCAAGGCCGTCGACTACGTCGCCCTCGGTGACTCGTACTCCTCCGGCGTCGGCGCCGGCAGCTACGAGAGCGCCAGCGGCGACTGCAAGCGCAGCACCCGCGCCTTCCCCCGGCTCTGGGCCAACGCCAACTCCCCGTCCAGCTTCGCCTTCACCGCCTGCTCCGGCGCCCGCACCAACGACGTCACGAGCAGTCAGCTCGGGCCGCTCAACGCCTCCACCGACCTGGTCTCCATCTCCATCGGCGGCAACGACGCCGGCTTCGCGGACGTCATGACGACCTGTGTCCTGCAGTCCGAGGCCACCTGCCTCAACCGCATCGCCACCGCCCGCGCCTACGTCGACTCCACCCTGCCCGGCCGCCTCGACTCCGTGTACAACGCCATCAAGGCCAAGGCCCCCAACGCCCGGGTCGTCGTCCTCGGCTACCCCCGCTTCTACCAGCTGAACGGCACCTGCGTGGCCGGTCTCAGCGAGCGGGAGCGCGCCGCCATCAACGGCGCCTCCGACCACCTGAACACCGCCACCGCCAAGCGCGCCGCCGACCACGGCTTCGCCTTCGGTGACGTCAGGACGACCTTCACCGGCCACGAGATCTGCTCCAGCAACTCCTGGTTGCACAGCGTGAACTGGCTCAACATCGGTGAGTCCTACCACCCCACCGCCGCCGGACAGTCGGGCGGCTATCTGCCGGTCTTCAACTCGGCTGCCTGA
2)设计引物Bone-F：
CACCACCACCACCACCACTGATGAAAGCTTGGCGTAATC和Bone-R：TGCAGCTGAGGCATGTGTTAC；以质粒pP43NMK为模板PCR得到载体骨架。
3)将步骤1)和步骤2)所得序列和骨架通过无缝拼接试剂盒进行连接，将连接好的质粒转入Escherichia coli TreliefTM感受态细胞中。
4)设计验证引物Verify-F：ACGAACGTGTCAAAGAAATT和Verify-R：GATTACGCCAAGCTTTCATC进行阳性克隆验证，测序正确后通过质粒提取试剂盒提取质粒(图1)。
5)制备枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800感受态细胞，将4)所得质粒转入，发酵后测酶活。
6)采用化学法制备感受态，具体操作如下：(a)取保存在10％甘油管中的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800在无抗性的LB固体培养基上划线，37℃过夜培养；(b)挑菌接一单菌落在5mL GMI溶液中30℃，125r/min振荡过夜培养；(c)隔日取2mL上一步所得菌液转接到18mL GMI中37℃，250r/min继续培养5h；(d)从上一步的培养液中取10mL转接到90mL GMII中37℃，125r/min培养90min后，4℃，5000×g，离心10min收集菌体；(e)用10mL GMII将菌体重新悬浮，加入20mL已灭菌的30％甘油，使其终浓度为10％，将其混匀后，分装到1.5mL的离心管中(每管0.5mL)，置于-80℃保存。
7)脂肪酶酶活测定方法：以20mM对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物，异丙醇和二甲基亚砜以3:1作溶剂。反应时首先加入400μL pH为8的100mM Tris-HCl作为反应的缓冲剂，然后加入200μL发酵上清液，在37℃水浴锅孵育2min后加入20μL反应底物，反应5min后，加入650μL 1％SDS终止反应，在405nm下测定其吸光度。
8)在5)中所得该枯草芽孢杆菌所产脂肪酶酶活表现较低，用LB培养基发酵后所测酶活仅为142.5U/mL(图4)。
实施例2：密码子优化
为了提高在枯草芽孢杆菌中产脂肪酶的效率，对脂肪酶序列进行针对枯草芽孢杆菌的密码子优化筛选，通过表达量确定最终优化后的序列如下：
ATGAAAATGTCACGCCTGGTGGCATTTTCATCATCACTGCTGCTGGGCGCAGCACTGGCACTTACAGGCGCAGGAATTGCAAATGCAGATTCATCAGTTAAAGCGGTGGATTACGTTGCGCTGGGCGATTCATATTCATCAGGCGTTGGCGCAGGCTCATATGAATCAGCATCAGGCGATTGCAAAAGATCAACAAGAGCATTTCCGAGACTGTGGGCAAATGCAAATTCACCGTCATCATTTGCATTTACGGCATGCTCAGGCGCAAGAACAAATGATGTTACATCATCACAACTGGGCCCGCTGAATGCATCAACAGATCTGGTTTCAATTAGCATCGGCGGCAATGATGCAGGCTTTGCAGATGTTATGACAACATGCGTTCTGCAATCAGAAGCAACATGCCTGAATAGAATTGCGACAGCAAGAGCATATGTGGACAGCACACTGCCGGGCAGACTGGATTCAGTTTATAATGCAATTAAGGCGAAGGCGCCGAACGCGAGAGTTGTTGTTCTGGGCTATCCGAGATTTTATCAACTGAATGGCACATGCGTTGCGGGCCTGTCAGAAAGAGAAAGAGCAGCAATTAATGGCGCATCAGATCATCTGAATACAGCGACAGCAAAACGCGCGGCAGATCATGGCTTTGCATTTGGCGATGTTAGAACAACATTTACGGGCCATGAAATTTGCTCATCAAATAGCTGGCTGCACTCAGTTAATTGGCTGAATATTGGCGAATCATACCACCCGACAGCAGCAGGCCAATCAGGCGGATATCTTCCGGTTTTTAATTCAGCAGCATGA(SEQ ID NO：2)
图2为本发明实施例2提供的密码子优化后与原序列的碱基对比图。
将发酵好的菌液超滤浓缩100倍后进行SDS-PAGE，并与未进行密码子优化的菌株进行对比，肉眼可见优化后的脂肪酶条带颜色更深一些，代表其表达量得到了有效提高(图3)。
实施例3：单因素优化
为了进一步提高表达效率，对构建的菌株的发酵方法进行优化。
1)首先在LB、TB、SR、SOC、ZTY五种基础培养基中，以同样的发酵条件进行筛选，实验结果显示使用TB培养基所得脂肪酶酶活是最高的(图4)。
2)在TB培养基的基础上，选择葡萄糖、马铃薯淀粉、可溶性淀粉代替TB培养基中的甘油作为唯一碳源进行碳源优化，实验结果显示当葡萄糖为唯一碳源时酶活最高(图5)。
3)在2)的基础上，设置葡萄糖浓度梯度进行最适碳源浓度优化，实验结果显示当葡萄糖为20g/L的时候，枯草芽孢杆菌脂肪酶的酶活达到最高(图6)。
4)在3)的基础上，选择酵母粉、玉米浆干粉、NH4Cl、NaNO3代替TB培养基中的酵母粉和蛋白胨进行氮源优化，实验结果显示当酵母粉为单一氮源的时候，枯草芽孢杆菌脂肪酶酶活达到最高(图7)。
5)在4)基础上，对酵母粉浓度设置梯度进行最适氮源浓度优化，实验结果显示当酵母粉浓度为25g/L的时候，枯草芽孢杆菌脂肪酶的酶活达到最高(图8)。
6)在5)的基础上，选择NaCl、KCl、LiCl、MgSO4、H2SO4、CuSO4、ZnCl2、CaCl2、FeCl3、MnSO4分别加入到培养基中进行最适无机盐筛选，实验结果显示当加入ZnCl2时，枯草芽孢杆菌脂肪酶的酶活达到最高(图9，图10)。
7)在6)的基础上进行一些发酵条件的优化，利用盐酸和NaOH将培养基的初始pH值调为3、5、7、9、11从而筛选出最适发酵pH，实验结果显示当初始pH为7的时候，枯草芽孢杆菌脂肪酶的酶活达到最高(图11)。
8)在7)的基础上对发酵温度又进行了优化，将培养基分别放置在25℃、30℃、35℃、37℃、40℃分别进行培养，实验结果显示当温度为30℃时，枯草芽孢杆菌脂肪酶的酶活达到最高(图12)。
实施例4：响应面分析
1)首先在实施例2能够达到的最优的单因素中挑选5个因素(葡萄糖、酵母粉、ZnCl2、MgSO4、温度)，用Plackett-Buman法对以上5个因素进行筛选，筛选出葡萄糖和ZnSO4两个显著影响因素。
2)然后进行最陡爬坡实验，逐步改变两个显著因素的浓度(葡萄糖30g/L，ZnSO41.24g/L)，逼近最佳响应面区域。
3)最后通过Box-Behnken，利用Minilab 17软件进行回归分析，得到回归方程：酶活U/mL＝555.76+30.19A+9.37B-31.20A*A-27.22B*B+14.36A*B。再通过拟合的响应曲面的形状，响应面立体分析图，结合回归方程和岭嵴分析预计在A＝0.5571(对应葡萄糖浓度为31.4g/L)B＝0.3286(对应ZnCl2浓度为1.24g/L)得到达到最佳培养条件得到最高酶活为565U/ml。
4)图13为本发明实施例4提供的酶活与葡萄糖和ZnCl2之间响应曲面示意图
5)图14为本发明实施例4提供的酶活与葡萄糖和ZnCl2之间的等高线示意图
6)图15为上述实施例预测结果的验证实验结果图，当葡萄糖浓度为31.4g/L，ZnCl2浓度为1.24g/L时酶活最高达到571U/mL，与预测结果接近，表明该响应面分析预测结果可信。
实施例5：5L发酵罐发酵培养条件优化
1)在实施例4的基础上，以实施例4所得最优培养基配方在5L发酵罐中对发酵罐发酵条件进行优化。
2)在培养基条件一定的情况下，分别设置发酵罐初始培养pH分别为5、6、7、8、9进行优化，结果显示当pH为7时，脂肪酶酶活最高(711U/mL)(图16)。3)在2)的基础上，分别设置发酵罐转速为100、150、200、250、300r/min进行优化，结果显示当发酵罐转速为200r/min时，脂肪酶酶活最高(756U/mL)(图17)。
4)在3)的基础上，分别设置发酵罐发酵温度为20、30、37、40、50℃进行优化，结果显示当发酵罐温度保持在30℃时，脂肪酶酶活最高(801U/mL)(图18)。
5)在5L发酵罐放大培养中，确定在了发酵条件在初始培养pH 7、转速200r/min、发酵温度为30℃时，可获得最大酶活801U/mL。
本发明对脂肪酶发酵过程进行优化后，酶活最高达到801U/mL；优化后发酵结果是传统LB培养基培养所得枯草芽孢杆菌脂肪酶酶活的5.62倍，有效地提高了枯草芽孢杆菌脂肪酶的酶活。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种在枯草芽孢杆菌中高效表达脂肪酶的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagatgt ccagacttgt ggcgttctcg tcctcgctcc tgctcggtgc cgccctcgcc 60
ctgaccggtg cggggatcgc gaacgccgac tcgtcggtca aggccgtcga ctacgtcgcc 120
ctcggtgact cgtactcctc cggcgtcggc gccggcagct acgagagcgc cagcggcgac 180
tgcaagcgca gcacccgcgc cttcccccgg ctctgggcca acgccaactc cccgtccagc 240
ttcgccttca ccgcctgctc cggcgcccgc accaacgacg tcacgagcag tcagctcggg 300
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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attaaggcga aggcgccgaa cgcgagagtt gttgttctgg gctatccgag attttatcaa 540
ctgaatggca catgcgttgc gggcctgtca gaaagagaaa gagcagcaat taatggcgca 600
tcagatcatc tgaatacagc gacagcaaaa cgcgcggcag atcatggctt tgcatttggc 660
gatgttagaa caacatttac gggccatgaa atttgctcat caaatagctg gctgcactca 720
gttaattggc tgaatattgg cgaatcatac cacccgacag cagcaggcca atcaggcgga 780
tatcttccgg tttttaattc agcagcatga 810

Claims (8)

1.一种可分泌性表达脂肪酶的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌工程菌携带有表达载体，所述的表达载体中插入有用于编码脂肪酶的核苷酸片段，其中编码脂肪酶的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO：1。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的编码脂肪酶的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO：2。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌工程菌宿主为枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800。
4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的表达载体是pP43NMK。
5.一种制备脂肪酶的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌工程菌来发酵制备脂肪酶。
6.一种大规模发酵制备脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法是使用权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌工程菌来发酵制备脂肪酶。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法中使用的培养基配方如下：31.4g/L的葡萄糖、1.3g/L的ZnCl2、25.0g/L的酵母粉、17mmol/L KH2PO4、72mmol/L K2HPO4。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法的发酵培养条件如下：发酵温度30℃、发酵罐转速200r/min、发酵初始pH为7.0。
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