CN110982804A

CN110982804A - 一种脂肪酶及其在获得富集dha甘油酯中的应用

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Publication number: CN110982804A
Application number: CN201911387271.6A
Authority: CN
Inventors: 孙建安; 毛相朝; 王雪斐; 王玉明; 薛长湖
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-12-26
Also published as: CN110982804B

Abstract

本发明公开了属于功能酶筛选及应用技术领域的一种脂肪酶及其在获得富集DHA甘油酯中的应用。本发明的脂肪酶氨基酸序列为SEQ ID NO:1，本发明还提供了所述脂肪酶Lip11的基因载体和基因载体的工程菌。本发明的脂肪酶用于催化鱼油水解反应获得富集DHA的甘油酯。本发明的脂肪酶Lip11具有一定的碳链长度选择性和底物选择性，在催化水解反应48h后，可催化DHA含量较低甘油三酯水解为DHA含量较高的甘油单酯，体现了该脂肪酶富集DHA单甘酯的应用潜力。

Description

一种脂肪酶及其在获得富集DHA甘油酯中的应用

技术领域

本发明属于功能酶筛选及应用技术领域，具体涉及一种脂肪酶及其在获得富集DHA甘油酯中的应用。

背景技术

脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)是α/β水解酶家族的一员，脂肪酶亦称酰基甘油水解酶，在自然界中主要催化三酰甘油酯的水解，还可在非水相条件下催化酯化、酯交换、醇解和酸解等反应。与其他水解酶类相比，脂肪酶催化的反应类型和条件更加多样化，而不同类型脂肪酶的应用严格受限于其活性、专一性、最适温度和pH值、温度和酸碱稳定性、溶剂耐受性等酶学性质，所以筛选到合适的脂肪酶及其编码基因是脂肪酶研发的重要基础。脂肪酶偏好水解或者催化合成长链甘油酯(碳链链长>8)，并广泛存在于动物、植物和微生物中。

DHA(4、7、10、13、16、19-二十二碳六烯酸)英文全称Docosahexaenoic acid，其在大脑发育中发挥着重要作用，因而被称为“脑黄金”，是ω-3系(第一个双键位于碳端第三个碳原子上)不饱和脂肪酸家族中的重要成员，DHA是海产动植物的特征性脂肪酸。DHA对人脑的发育起着重要的作用，而且对各种慢性和退行性人类疾病有一定的疗效。DHA是目前最具有药物潜力的PUFA，可用于治疗各种人类疾病，如治疗心脑血管疾病、多种炎症，改善视力，用于预防癌症、阿尔茨海默病等。

目前，可用于添加到食品中或直接用于营养添加剂的DHA大多来源于鱼油、藻油和蛋黄中。其中，鱼油DHA多是以甲酯型、乙酯型和甘油三酯型的形式从含脂肪比较多的深海鱼油中提取，藻油DHA则多是以同种存在形式从单细胞藻油中提取，而蛋黄DHA则主要以卵磷脂型的形式存在于蛋黄中。

DHA(docosahexaenoic acid)ω-3多烯不饱和脂肪酸在人体生物学中的重要功能已得到世人的共识。天然鱼油甘油酯型保健品中DHA含量低(30％左右)不再满足，期望提供安全性好、DHA含量高的保健产品。利用脂肪酶的选择性水解富集DHA甘油酯，关键在于寻找具有良好选择性的脂肪酶。有研究表明:脂肪酶具有对甘油酯中不同脂肪酸的专一性；具有对三甘酯中不同位置的专一性；通常认为鱼油三甘酯中2-位上连接着DHA高度不饱和脂肪酸。利用脂肪酶对鱼油脂肪酸的专一性，使鱼油中DHA留存在甘油酯中，切去其他饱和或低不饱和脂肪酸，使之成为游离酸除去，从而达到DHA在鱼油甘油酯中的高含量富集。

发明内容

本发明的目的为提供一种新型脂肪酶Lip11，利用该脂肪酶的水解活性催化鱼油中甘油酯的选择性水解，从而实现DHA的富集。

本发明提供一种脂肪酶Lip11，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白：

1)自序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

2)将自序列表中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的蛋白质。

所述脂肪酶Lip11的基因序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了所述脂肪酶Lip11的基因载体，优选地，所述基因载体为pP43NMK质粒。

本发明还提供了所述脂肪酶Lip11的基因载体的工程菌，优选地，所述基因载体的工程菌为枯草芽孢杆菌WB800。

本发明还提供了所述脂肪酶在鱼油水解反应中获得富集DHA的甘油酯中的应用。利用脂肪酶Lip11的碳链选择性，使用lip11酶粉催化DHA含量较低的甘油三酯部分水解后得到DHA含量较高的甘油单酯。

优选地，所述脂肪酶的最适温度为40℃，最适pH值为9.0。

有益效果：本发明的脂肪酶Lip11具有一定的碳链长度选择性和底物选择性，在催化水解反应48h后，可催化DHA含量较低甘油三酯水解为DHA含量较高的甘油单酯，体现了该脂肪酶富集DHA单甘酯的应用潜力。

附图说明

图1为本发明脂肪酶Lip11进化树分析图。

图2为本发明脂肪酶Lip11的SDS-PAGE电泳图，其中泳道2为纯化后的酶，泳道4为导入空质粒的枯草杆菌细胞发酵上清，泳道5为发酵上清液冻干后复溶的粗酶液。

图3为本发明脂肪酶Lip11的酶学性质研究图，其中图a为Lip11的最适温度图，图b为Lip11的最适pH图，图c是表面活性剂对Lip11活力的影响图；图d是金属离子对Lip11的酶活的影响图。

图4为脂肪酶Lip11催化水解反应得到的甘油单酯的液相图，出峰顺序从左至右(主要峰)为：甘油三酯，游离脂肪酸，甘油二酯，甘油单酯。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1脂肪酶Lip11片段的筛选以及克隆表达

根据两株海洋链霉菌(Streptomyces marinensis)的全基因测序结果，将可能的脂肪酶编码片段进行异源表达。考虑到最终得到的脂肪酶要用于油脂的改性，选用枯草芽孢杆菌WB800菌株作为宿主。

选用pP43NMK质粒，将脂肪酶片段无缝拼接到质粒上，构建成功后转入枯草芽孢杆菌感受态细胞。待长出单菌落后，挑取单菌落进行培养，并测定培养液上清的脂肪酶酶活。构建好重组表达菌株接种至5mL含抗性的LB培养基(50μg/mL卡纳抗性中，37℃，180rpm过夜培养8-12h，将菌种进行活化。菌液活化好后，按1％接种量加入到LB培养基(50μg/mL卡纳抗性)，20℃，220rpm低温培养48h，诱导表达脂肪酶。用含空载体的菌株，在相同条件下进行诱导表达作为空对照。

实施例2脂肪酶Lip11基因序列分析

脂肪酶Lip11的家族分类，使用文献已报道的方法来进行，使用MEGA6.0软件构建Lip11与其他家族脂类水解酶的进化树，Clustal X软件用于对脂类水解酶进行多序列比对，ESPript 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)用于比对序列的输出。如图1所示，Lip11属于脂肪酶第Ⅶ家族。

实施例3脂肪酶Lip11的纯化

重新对脂肪酶Lip11进行诱导发酵，发酵结束后，将Lip11的细胞外表达的粗酶液进行冻干，复溶于pH 9，10mM的缓冲液(100mg/ml)，使用30kDa，50kDa大小的超滤杯进行超滤，浓缩20倍后将复溶的粗酶液收集进行SDS-PAGE。如图2所示，泳道2为纯化后的酶，泳道4为导入空质粒的枯草杆菌细胞发酵上清，泳道5为发酵上清液冻干后复溶的粗酶液。

实施例4脂肪酶Lip11酶学性质研究

经实施例3纯化后的脂肪酶Lip11，用作酶学性质研究。

(1)脂肪酶Lip11最适温度

脂肪酶Lip11的最适温度，通过在不同温度(30，35，40，45，50，55，60，70，75℃)下孵育反应，并检测吸光值A₄₀₅来确定。最适温度下的活性定义为100％，其他温度下的活性以对最高活性的百分比表示。由结果(图3a)可以看出，温度<40℃时，随着温度的升高，脂类水解酶活性逐渐升高，温度>40℃后，随着温度升高，该脂肪酶活性逐渐降低，Lip11的最适温度为40℃。

(2)脂肪酶Lip11最适pH

pH对脂肪酶Lip11活性的影响，使用不同pH的不同缓冲液来检测。该过程使用的缓冲液包括：100mM柠檬酸缓冲液(pH 4.0-6.0)，100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0-8.0)，100mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)和100mM Glycine-NaOH缓冲液(pH 9.0-10.0)。最适pH下的活性定义为100％，其他pH下的活性以百分比来表示。结果(图3b)显示，Lip11在pH为9的Tris-HCl缓冲液中显示出最高的水解活性，并且较之酸性条件，Lip11在碱性条件下显示出更高的水解活性，说明Lip11属于一个典型的碱性脂肪酶。

(3)表面活性剂对脂肪酶Lip11活性的影响

为了检测表面活性剂对脂肪酶Lip11的影响，我们通过向反应液中添加不同的表面活性剂(终浓度1.0％)来测定，其中使用的试剂包括：SDS，TritonX-100，Tween 20，Tween80,Span20和Span80。反应液中未添加表面活性剂时测得的活性定义为100％，其余添加了表面活性剂的处理组以百分比表示。结果如图3c所示，Span20对于酶活有明显促进作用，相对酶活可达到111.84％，SDS，Tween 20，Tween 80对于酶活均有较为明显的抑制作用，可使相对酶活降至20％以下。

(4)金属离子对酶活性的影响

金属离子对脂肪酶Lip11活性的影响，通过向反应体系中添加终浓度为1mM和10mM的金属离子(CoCl₂，KCl，LiCl，FeCl₃，CaCl₂，MgCl₂，CuSO₄，ZnCl₂和NiCl₂)以及Na₂-EDTA来测定。未添加金属离子和Na₂-EDTA的作为对照，其活性定义为100％，结果如图3d所示。

从图3d可以看出，10mM K⁺、Fe³⁺、1mM Ca²⁺、10mM Mg²⁺、10mM Zn²⁺、1mM Mn²⁺、Ba²⁺增强了酶活性，其中10mM Fe3+可使其增加150％以上。10mM Na⁺、Co²⁺、1mM K⁺、1mM Ni⁺、1mMCu²⁺、1mM Na⁺、10mM Mg²⁺、10mM Zn²⁺、处理后，其酶活显示被抑制作用。其中10mM Ni²⁺、10mMCu²⁺对酶活抑制作用显著，可使相对酶活降低到25％以下。

实施例4脂肪酶Lip11催化得到富集的DHA甘油酯

重新发酵脂肪酶Lip11，离心收集后上清液，进行真空冷冻干燥，探索出最优条件：使用司班80作为乳化剂，油水比为2:1，反应温度为40℃，反应时间24h，并在该条件下水解甘油三酯底物得到较高相对含量的DHA甘油单酯。HPLC结果如图4所示，出峰顺序从左至右(主要峰)为：甘油三酯，游离脂肪酸，甘油二酯，甘油单酯。通过高效液相色谱检测生成的DHA甘油单酯的相对含量为23.68％，结果表明筛选得到的脂肪酶Lip11在制备DHA甘油单酯方面具有较高开发应用潜力。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种脂肪酶及其在获得富集DHA甘油酯中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 285

<212> PRT

<213> 海洋链霉菌(Streptomyces marinensis)

<400> 1

Met Lys Leu Pro Leu Ser Leu Pro Leu Pro Pro Arg Pro Ser Thr Ala

1 5 10 15

Leu Leu Ala Ala Thr Val Leu Glu Leu Val Val Leu Thr Gly His Leu

20 25 30

Ala Ala Tyr Pro Phe Gly Ile Ala Gln Glu Arg His Ala Arg Arg Pro

35 40 45

Ala Pro Asp His Gln Arg His Ala Pro Gly Thr Ser Thr Gly Leu His

50 55 60

His Leu Pro Gly Ser Gln Asp Ala Glu Arg Pro Val Val Leu Leu His

65 70 75 80

Gly Phe Ile Asp Asn Arg Ser Val Phe Val Leu Leu Arg Arg Ala Leu

85 90 95

Ala Arg His Gly Arg Arg His Leu Ala Ser Leu Asn Tyr Ser Pro Leu

100 105 110

Thr Arg Asp Leu Arg Thr Ala Ala Glu Leu Leu Gly Arg His Val Glu

115 120 125

Glu Val Cys Ala Arg Thr Gly Gln Arg Glu Val Asp Ile Val Gly His

130 135 140

Ser Leu Gly Gly Leu Ile Ala Arg Tyr Tyr Val Gln Arg Leu Gly Gly

145 150 155 160

Asp His Arg Val Arg Thr Leu Val Thr Leu Gly Thr Pro His Gly Gly

165 170 175

Thr Ala Val Ala Pro Gly Ala Gly Ile His Pro Ile Val Arg Gln Met

180 185 190

Arg Gly Gly Ser Pro Leu Ile Glu Glu Leu Arg Arg Pro Ala Pro Gly

195 200 205

Cys Arg Thr Arg Phe Val Ser Phe Trp Gly Glu Leu Asp Gln Val Met

210 215 220

Val Pro Val Glu Thr Ala Cys Val Asp His Pro Asp Leu Asp Ala Val

225 230 235 240

Asn Val Arg Val Thr Gly Ile Gly His Leu Ala Leu Pro Val His Pro

245 250 255

Ala Val Ala Thr Ala Val Arg Glu Ala Leu Glu Ser Gln Arg Thr Arg

260 265 270

Glu Gly Thr Ala Pro Ser Thr Gly Thr Ser Ser Val Ala

275 280 285

<210> 2

<211> 858

<212> DNA

<213> 海洋链霉菌(Streptomyces marinensis)

<400> 2

atgaaacttc ccctttccct ccccttaccg ccccgcccct ccaccgcact gctcgccgcc 60

accgtgctgg agctggtcgt cctcaccggc catctcgccg cctacccctt cggcatcgcc 120

caggagcgcc acgcccggcg cccggcgccg gaccaccaac gccacgcccc cggcaccagc 180

accggcctcc accatctgcc cggctcccag gacgccgagc ggcccgtcgt cctgctccac 240

ggcttcatcg acaaccgctc cgtcttcgtc ctgctgcgcc gcgcgctcgc ccggcacggc 300

cgccgccatc tggcgtccct caactactcg ccgctcaccc gcgacctgcg caccgccgcc 360

gaactgctcg gccggcacgt ggaggaggtc tgcgcccgca ccggacagcg cgaggtcgac 420

atcgtcgggc acagcctcgg cggcctgatc gcccgctact acgtccagcg gctgggtggc 480

gaccaccggg tgcgcaccct cgtcacgctc ggcacgccgc acggcggcac cgccgtcgcc 540

cccggggcag gcattcaccc catcgtgcgg cagatgcgcg gcggttcccc gctgatcgag 600

gaactgcgcc gccccgcgcc ggggtgccgg acccggttcg tcagcttctg gggcgagctg 660

gaccaggtca tggtcccggt cgagacggcc tgcgtggacc accccgacct ggacgccgtg 720

aacgtacgcg tcaccgggat cgggcatctc gcgctgccgg tgcacccggc ggtcgccacc 780

gccgtccgtg aggctctgga gtcacagcgg acccgggagg gcacagcccc ctcaaccgga 840

acgtcctctg tcgcttag 858

Claims

1.一种脂肪酶Lip11，其特征在于，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白：

1)自序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

2.根据权利要求1所述脂肪酶Lip11，其特征在于，所述脂肪酶的基因序列如序列表SEQID NO：2所示。

3.一种权利要求1所述脂肪酶Lip11的基因载体。

4.根据权利要求3所述脂肪酶Lip11的基因载体，其特征在于，所述基因载体为pP43NMK质粒。

5.含有权利要求3所述脂肪酶Lip11的基因载体的工程菌。

6.根据权利要求5所述脂肪酶Lip11的基因载体的工程菌，其特征在于，所述基因载体的工程菌为枯草芽孢杆菌WB800。

7.权利要求1所述脂肪酶Lip11在鱼油水解反应中获得富集DHA的甘油酯中的应用。

8.根据权利要求7所述脂肪酶Lip11在水解鱼油反应获得富集DHA的甘油酯中的应用，其特征在于，所述脂肪酶的最适温度为40℃，最适pH值为9.0。