CN113038949B - 嗜中性白血球发炎抑制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供式(I)化合物以及包含此式(I)化合物的医药组合物。其中式(I)化合物为嗜中性白血球发炎抑制剂，因此可用于治疗和/或预防与嗜中性白血球异常活化相关的发炎疾病和/或发炎异常，例如急性呼吸窘迫症候群(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)、急性肺损伤(acute lung injury，ALI)、慢性肺阻塞(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、肺纤维化、慢性支气管炎、肺气肿、α‑1抗胰蛋白酶缺乏症、囊状纤维化、特发性肺纤维化、肝脏损伤、脂肪性肝炎、肝纤维化、因缺血及再灌流所引发的损伤、心肌梗塞、休克、中风、器官移植、溃疡性结肠炎、血管炎、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、败血症、全身性炎症反应症候群(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、关节炎、干癣、异位性皮肤炎及发炎性皮肤病。

Description

嗜中性白血球发炎抑制剂及其用途
技术领域
本发明内容是有关嗜中性白血球发炎抑制剂，以及利用此抑制剂来治疗或预防与嗜中性白血球相关的疾病和/或异常。
背景技术
嗜中性白血球乃是一群内含宿主对抗入侵细菌的防卫系统的主要组成的白血球(白细胞)。回应受伤位置细胞释出的可溶性发炎媒介物，嗜中性白血球会从血液中跨越血管壁而迁移至组织内。在受伤处，活化的嗜中性白血球会通过吞噬作用和释出细胞毒素(如，氧化物、蛋白酶和细胞因子)来杀死外来细胞。尽管嗜中性白血球对于对抗感染而言非常重要，但嗜中性白血球本身也会为组织带来伤害。在异常发炎反应时，嗜中性白血球会因为释放毒性物质到血管壁或未受损组织处，而造成组织明显受损。或是，黏附在微血管壁的嗜中性白血球会引起缺氧而使组织受损。这类异常的发炎反应已被认为与多种临床疾病的病因有关，包括但不限于，急性成人呼吸窘迫症候群(Acute respiratory distresssyndrome，ARDS)、急性肺损伤(acute lung injury，ALI)、慢性肺阻塞(chronicobstructive pulmonary disease，COPD)、肺纤维化、肝脏损伤、脂肪性肝炎、肝纤维化、因缺血及再灌流所引发的损伤、心肌梗塞、休克、中风、器官移植、血管炎、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、败血症、全身性炎症反应症候群(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)、关节炎、干癣、异位性皮肤炎、及发炎性皮肤病。
有鉴于此，相关领域亟需一种可压制嗜中性白血球被异常活化的新颖治疗药剂，以便治疗及/或预防与其相关的发炎性疾病和/或异常。
发明内容
本发明内容是基于发现某些新的合成化合物是强力的嗜中性白血球发炎抑制剂，可拮抗因嗜中性白血球异常活化所致的发炎反应，因此这些化合物可作为先导化合物来开发药物，用以治疗与嗜中性白血球异常活化相关的发炎疾病和/或发炎异常，例如ARDS、ALI、COPD、肺纤维化、慢性支气管炎、肺气肿、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、囊状纤维化、特发性肺纤维化、肝脏损伤、脂肪性肝炎、肝纤维化、因缺血及再灌流所引发的损伤、心肌梗塞、休克、中风、器官移植、溃疡性结肠炎、血管炎、SLE、败血症、SIRS、关节炎、干癣、异位性皮肤炎及发炎性皮肤病。
因此，本发明内容的一方案是提供一种具有式(I)结构的新化合物、该化合物的盐类或溶剂合物(solvate)：
Figure BDA0003053012710000021
其中：
X是N或O；
R1是氢、烷基或不存在，其中当X是O时，R1不存在，且当X是N时，R1是氢或烷基；
R2、R3、R4及R5独立为氢、羟基、氢硫基、卤素、烷基、卤烷基、-OR6、-SR6、-(C＝O)R6或-COOH；
R6是烷基或卤烷基。
依据本发明内容的一较佳实施方案，在式(I)中，X是N；R1是甲基；R2、R3及R5独立为氢；且R4是羟基。
本发明也涵盖一种适用于治疗或预防因嗜中性白血球异常活化而引发的疾病和/或异常的医药组合物。所述医药组合物包含上述式(I)化合物、该化合物的盐类或溶剂合物；以及一医药上可接受的赋形剂。
同样涵盖于本发明的是一种用以治疗及/或预防一患有或疑似患有与嗜中性白血球异常活化相关的发炎疾病和/或发炎异常的个体的方法。本发明的方法包括对该个体投予一治疗或预防有效量的式(I)化合物、该化合物的盐类或溶剂合物，以减轻、缓减和/或防止该与嗜中性白血球异常活化相关的发炎疾病和/或发炎异常的症状。
依据本发明的实施方案，所述与嗜中性白血球异常活化相关的发炎疾病和/或发炎异常是选自由以下所组成的群组：ARDS、ALI、COPD、肺纤维化、慢性支气管炎、肺气肿、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、囊状纤维化、特发性肺纤维化、肝脏损伤、脂肪性肝炎、肝纤维化、因缺血及再灌流所引发的损伤、心肌梗塞、休克、中风、器官移植、溃疡性结肠炎、血管炎、SLE、败血症、SIRS、关节炎、干癣、异位性皮肤炎及发炎性皮肤病。
依据本发明一较佳实施方案，该发炎疾病和/或发炎异常是ARDS。
依据本发明另一较佳实施方案，该发炎疾病和/或发炎异常是ALI。
依据本发明又一较佳实施方案，该发炎疾病和/或发炎异常是干癣。
依据本发明某些实施方案，该式(I)化合物是以0.001-100毫克/公斤的剂量投予该个体。
依据本发明的较佳实施方案，所述个体为人类。
本发明的一种或多种实施方案的细节描述在以下说明中，通过这些细节说明及权利要求，可清楚的了解本发明内容的其他特征及优点。
须知前述的一般性说明和下面的详细说明均为例示，仅作为进一步说明所请发明内容之用。
附图说明
所附附图并于本申请说明书中并作为说明书的一部分，其用于说明多种例示系统、方法及本发明多种方案的其他例示性实施方案。配合附图阅读以下细节说明，本发明将更明显易懂：
图1说明化合物HKI-4971对于咪喹莫特(imiquimod，IMQ)在小鼠所诱发的干癣的治疗效果，(A)来自IMQ组(左方)及HKI-4971组(右方)的小鼠表型的影像；(B)取自IMQ组小鼠的皮肤的显微镜影像；(C)取自HKI-4971组小鼠的皮肤的显微镜影像；标尺＝1mm。
图2说明自本发明的一实施方案中的经化合物HKI-4971治疗的干癣小鼠取得的皮肤的H&E染色和免疫化学结果，标尺＝100μm。
图3说明HKI-4971对于IMQ诱发的小鼠的肝脏及肾脏功能的影响，测量(A)丙胺酸氨基转移酶；(B)天冬氨酸氨基转移酶；(C)血尿氮含量；及(D)肌酸；数据是以平均值±平均值标准误差(S.E.M)来表示(n＝3)。
图4说明HKI-4971对于脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)引起的小鼠急性肺损伤(ALI)的治疗效果，(A)肺组织内骨髓过氧化酶(myeloperoxidase，MPO)活性，(B)上图：肺脏代表性照片；下图：以光学显微镜拍摄的肺脏切片显微照片，该肺脏切片经H&E染色及免疫化学染色，数据是以平均值±平均值标准误差来表示(n＝3)，标尺＝100μm，***P<0.01。
具体实施方式
以下有关附图的详细说明是为了描述本发明的内容，而非代表建构或运用本发明内容的唯一形式。
1.定义
“烷基”一词包含有取代基(substituted)及无取代基(unsubstituted)的直链、支链及环状烷基。除非另有所指，否则每一烷基都可被个别地及选择性地以一个或多个取代基取代，而成为无取代的烷基或是有一个或多个取代基的烷基。当一个化学结构或是部分(moiety)被形容为有“取代”时，是指该结构或该部分的一个或多个氢原子被一个或多个诸如卤素、卤烷基或羟基的基团所取代而产生的衍生物。在某些实施方案中，所述烷基是没有取代基的烷基，尤指具有1-6个碳原子的烷基(或低碳数烷基)，如甲基、乙基、丙基、丁基等。在其他特定实施方案中，所述烷基是含有至少一个取代基的烷基，例如卤烷基。
“卤素(halo或halogen)”是指氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)或碘(-I)。
“卤烷基”是指如上定义的烷基，其上附有一、二、三、四、五、六或更多个卤素原子。卤烷基涵括氟烷基、氯烷基、溴烷基和碘烷基。“氟烷基”是指其上附有一、二、三、四、五、六或更多个氟原子的烷基。卤烷基上可具有一种以上的卤素原子，举例来说，氟烷基包括一具有一个或多个氟原子及一个或多个氯原子的烷基。卤烷基上也可具有一个或多个除卤素之外的其他取代基。
“烷氧基”指具有-OR’化学式的部分，其中R’可以是前述具有选择性取代基的烷基。
上述的取代基仅作为例示，本发明并不限于前述内容。
“盐类”一词在此是指在医学领域中适合用来接触人类组织和低等动物而不会引发不必要的毒性、刺激、过敏等不良反应，且具有合理的效益/风险比的医药上可接受的盐类。医药上可接受的盐类乃是相关领域熟知的。本发明化合物的医药上可接受的盐类是通过将化合物与适当的无机酸或有机酸或是碱反应后而制得。医药上可接受的无毒性酸的酸加成盐(acid addition salts)的示例包含，以胺基与无机酸(例如，氢氯酸、氢溴酸、磷酸、硫酸及次氯酸)或有机酸(例如，醋酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、或丙二酸)或是利用其他领域中现有的方式(如，离子交换)而形成的酸加成盐。其他医药上可接受的盐类包含，己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬胺酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、反丁烯二酸盐、葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸、2-羟乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐(2-naphthalenesulfonate)、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果冻酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐(picrate)、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫代氰酸盐、对甲苯磺酸盐(p-toluenesulfonate)、十一酸盐、戊酸盐等。与适当碱反应所产生的盐类包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4 -盐。代表性的碱金属盐及碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐和镁盐等。其他医药上可接受的盐包括(当适当时)无毒的铵盐、四级铵盐，以及利用相对离子(如卤化物、氢氧化物、羧化物、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低烷基硫酸根、和芳基磺酸根)形成的铵阳离子盐。
“溶剂合物(solvate)”一词在此代表化合物与溶剂分子通过溶剂分解反应(solvolysis)连结，此种物理性的连结可包含氢键。常见的溶剂包括水、甲醇、乙醇、醋酸、二甲亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、二乙醚等。本发明化合物可被制成(例如)结晶形式，也可被溶剂溶合。适当的溶剂包括医药上可接受的溶剂，且还包括化学计量溶剂与非化学计量溶剂两种。在某些实例中，溶剂合物可以被单离出来，例如，当一个或多个溶剂分子被并入到结晶晶格之内时。“溶剂合物”一词在此涵括溶剂相的溶剂合物以及可被单离出来的溶剂合物两大类。代表性的溶剂合物包括水合物、乙醇化物及甲醇化物。
“水合物”一词是指与水分子连结在一起的化合物。一般来说，化合物的水合物中水分子的数目与水合物中化合物分子的数目呈一定比例，因此一化合物的水合物一般可以(例如)R·xH2O的通式来表示，其中R是化合物，且x是大于零的数目。某一特定化合物可以形成一种以上的水合物，包括(例如)单水合物(x＝1)；低水合物(x大于0但小于1，例如半水合物(R·0.5H2O))；多水合物(x大于1，例如二水合物(R·2H2O)及六水合物(R·6H2O))。
“医药上可接受的赋形剂”(pharmaceutically acceptable excipients)是指在一医药组合物中能与其他成分相容且在投药后不会危害个体的化合物。
除非另有所指，“有效量(effective amount)”一词在此处是指足以产生所欲疗效反应的药物用量。对治疗目的而言，有效量也指一种化合物，其治疗利益效果超越其毒性或有害影响的量。具体的有效量或足够量取决于多种因素，如欲治疗的特定状况、患者的生理条件(如，患者体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质、以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。有效量可以(例如)克、毫克或微克表示，或以毫克/公斤(mg/Kg)表示。或者，可将有效量表示成活性成分(例如，本发明的式(I)化合物)的浓度，例如莫耳浓度、重量浓度、体积浓度、重量莫耳浓度、莫耳分率、重量分率及混合比值。此外，本领域技术人员也可依据动物模式的剂量来计算药物(如本发明的药物)的人体等效剂量(human equivalent dose，HED)。举例来说，本领域技术人员可依据美国食品药物管理局(US Food and Drug Administration，FDA)所公告的“估算成人健康志愿者在初始临床治疗测式的最大安全起始剂量(Estimating theMaximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics inAdult Healthy Volunteers)”来估算人体使用的最高安全剂量。
除非另有所指，一化合物的“治疗有效量(therapeutically effective amount)”是指足以对一疾病或病症的治疗或管理提供治疗效益，或是使与该疾病或病症相关的一种或多种症状延缓或最小化的用量。一化合物的“治疗有效量”是指单用一治疗药剂或与其他疗法并用一治疗药剂时，可对该疾病或病症的治疗或管理提供治疗效益的治疗药剂的用量。此“治疗有效量”用语也包括可改善整体治疗效果、降低或避免该疾病或病症的症状或病因，或提高另一治疗药剂效用的量。
除非另有所指，化合物的“预防有效量(prophylactically effective amount)”是指足以预防一疾病或病症，或是防止与该疾病或病症相关的一种或多种症状发生的用量。化合物的“预防有效量”是指单用一治疗药剂或与其他疗法并用一治疗药剂时，对预防该疾病有效益的治疗药剂的用量。“预防有效量”用语也包括可改善整体预防效果或提高另一治疗药剂预防效用的量。
除非另有所指，“治疗(treat、treating、treatment)”一词包含当患者罹患特定疾病或异常时所发生的以下作用：降低该疾病或异常的严重性、或降低该疾病或异常的一种或多种症状(symptom)、或减轻或延缓该疾病或异常的进展。
“个体(subject)”或“患者(patient)”一词在本文中可交替使用，是指包含人类的哺乳类动物，其可接受本发明化合物的治疗。“哺乳类动物”指哺乳类下所有的成员，包括人类、灵长类、家禽与家畜类动物，例如兔子、猪、羊和牛，以及动物园动物、竞赛动物及宠物，和啮齿类动物，例如小鼠及大鼠。除非特定指出，否则“个体”或“患者”一词同时意指雄性及雌性。因此，“个体”或“患者”一词涵盖任一种可受益于本发明化合物及方法的哺乳类动物。“个体”或“患者”的实例包括但不限于，人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、猪、羊、牛、马、狗、猫、鸟及禽类。在一较佳实施方案中，“个体”是指人类。
须知，当没有特别以(例如)粗体或虚线标示出一结构或一结构的部分的立体化学构造时，应将该结构或该结构的部分解读为包含其所有立体异构物。相似地，在叙述具有一个或多个中心的化合物时，若未特别指明这些中心的立体化学构造，则应将其解读为包含纯立体异构物及其混合物。此外，图式中任一具有不饱和价数的原子应假设其是与足够的氢原子结合，以满足其价数要求。
虽然用以限定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因不同测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考量而定。除了实验例之外，除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有数值范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似的情况)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求所限定的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而变动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
除非本说明书明确指出另有定义，否则本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型。
2.嗜中性白血球抑制剂
本发明的发明人意外发现某些合成化合物是强力的嗜中性白血球发炎抑制剂，可用来拮抗因嗜中性白血球异常活化而引发的发炎反应，因此该些化合物可做为先导化合物，来开发适以治疗与嗜中性白血球异常活化相关疾病和/或异常的药物。
本发明所述的化合物为一种具有式(I)结构的化合物，及其医药上可接受的盐类或溶剂合物：
Figure BDA0003053012710000101
依据某些实施方案，其可以是式(I)化合物的盐类、溶剂合物或水合物。
在式(I)中，X可以是N或O。或者(或额外地)，R1是氢、烷基或不存在，其中当X是O时，R1不存在，且当X是N时，R1是氢或烷基。此外，R1可以是经取代或未经取代的。在某些实例中，R1是甲基。
或者(或额外地)，R2、R3、R4及R5独立为氢、羟基、氢硫基、卤素、烷基、卤烷基、-OR6、-SR6、-(C＝O)R6、或-COOH；且R6是烷基或卤烷基。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物3，其中X是N，R1是甲基，且R2、R3、R4及R5独立为氢。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物4，其中X是N，R1是甲基，且R2、R3及R5独立为氢，R4是氟。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物7，其中X是N，R1是甲基，R4是-OR6，其中R6是甲基，且R2、R3及R5独立为氢。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物8，其中X是N，R1是甲基，R2是氢，R3、R4及R5独立为-OR6，其中R6是甲基。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物10，其中X是N，R1是甲基，R4是-(C＝O)R6，其中R6是甲基，且R2、R3及R5独立为氢。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物11，其中X是N，R1是甲基，R2是羟基，且R3、R4及R5独立为氢。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物12，其中X是N，R1是甲基，R3是羟基，且R2、R4及R5独立为氢。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物13，其中X是N，R1是甲基，R4是羟基，且R2、R3及R5独立为氢。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物15，其中X是N，R1是甲基，R2、R3及R5独立为氢，且R4是羧基。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物16，其中X是N，R1是甲基，R2是氢硫基，且R3、R4及R5独立为氢。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物17，其中X是N，R1是甲基，R4是氯，且R2、R3及R5独立为氢。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物28，其中X是O，R2是羟基，且R3、R4及R5独立为氢。
依据某些特定实施方案，所述式(I)化合物可为化合物30，其中X是O，R4是具有3个氟原子取代的烷基(即，三氟甲基(-CF3))，且R2、R3及R5独立为氢。
本发明化合物可选择性地抑制嗜中性白血球的活性，包括下述一种或多种的嗜中性白血球活性的抑制：超氧阴离子的释出、活性氧物质的释出、骨髓过氧化酶的释出、弹性酶的释出、嗜中性白血球凝集，黏合至塑性表面(adhesion to plastic surface)，黏合至血管内皮细胞、趋化性及迁移跨越单层内皮细胞。在一些实施方案中，本发明化合物可抑制自甲酰基-L-甲硫胺酰-L-白胺酰-L-苯丙胺酸(formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine，fMLF)活化的嗜中性白血球中产生超氧阴离子。在其他实施方案中，本发明化合物可抑制自fMLF活化的嗜中性白血球中释出弹性酶。
以本发明式(I)化合物或该化合物的盐类或溶剂合物直接或间接接触经fMLF活化的嗜中性白血球后的半抑制浓度的(IC50)，来代表本发明化合物抑制超氧阴离子生成的程度。依据某些特定实施方案，本发明化合物抑制经fMLF活化的嗜中性白血球生成超氧阴离子的IC50数值至高为约4nM，至高为约0.5μM，至高为约5μM，至高为约8μM，至高为约10μM。依据某些特定实施方案，本发明化合物抑制经fMLF活化的嗜中性白血球释出弹性酶的IC50数值为至少约30nM，至少约2μM，至少约5μM，至少约10μM。
3.制备本发明化合物的方法
本文中所记载的任一种化合物都可通过本领域中惯常使用的方法或是实施例中教示的方法来制备。
一般来说，可通过以一个有取代的苯胺(例如，2-甲氧基苯胺、4-氟苯胺等)处理(接触)吡唑并[4,3-c]喹啉(即，实施例1的化合物2a或2b)，来制备本文所记载的化合物(即，式(I)化合物)。所述反应(例如接触步骤)可在无质子性溶剂中执行，该无质子性溶剂的实例包括二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone，NMP)、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、丙酮、乙醇、丙醇等。利用薄膜色层层析(TLC)或是高效能液体色层层析(HPLC)来监控反应进程，并以质谱仪或是NMR光谱来鉴别产物。
4.医药组合物及套组
本发明也涵盖用来治疗或预防发炎疾病和/或发炎异常，特别是与嗜中性白血球异常活化有关的疾病和/或异常的医药组合物。所述医药组合物包含一治疗有效量或一预防有效量的本发明式(I)化合物(例如化合物13)、该化合物的盐类或溶剂合物；以及一医药上可接受的赋形剂。
本发明式(I)化合物的重量约占医药组合物总重的0.1％到99％。在某些实施方案中，该式(I)化合物的重量至少占医药组合物总重的1％。在某些实施方案中，该式(I)化合物的重量至少占医药组合物总重的5％。在又一其他实施方案中，该式(I)化合物的重量至少占医药组合物总重的10％。在又再一其他实施方案中，该式(I)化合物的重量至少占医药组合物总重的25％。
特定医药组合物为适于经口、经黏膜(如，鼻腔、舌下、阴道内、颊内或直肠内)、非经肠胃道(例如皮下、静脉注射、单次快速注射(bolus injection)、肌肉注射或动脉内注射)或经皮方式来投药的单一剂型。剂型的实例包括，但不限于，锭剂、胶囊型锭剂、胶囊(例如软式弹性明胶胶囊)、扁囊剂、口含锭剂、分散体、栓剂、软膏、泥罨剂(敷糊药)、糊状剂、粉剂、敷料、乳剂、敷贴剂、溶液、贴剂、喷雾剂(例如鼻喷剂或吸入式)、凝胶、适于口服或黏膜方式投予至病患体内的液体剂型(包含悬浮液，例如与水相容或不溶的液体悬浮液、水包油乳剂、或是油包水乳剂，溶液及酏剂)、适于非口服方式投予至病患体内的液体剂型、及无菌固体(例如晶质或非晶质固体)，其可重制为适于非口服方式投予至病患的液体剂型。
剂型应配合投予方式。举例来说，口服投予需要肠溶衣包覆，以保护本发明化合物免于胃肠道中分解。相似地，剂型可包含将活性成分传递到作用位置的成分。举例来说，可以微脂体剂型来投予化合物，以防止其受到酵素作用而分解、辅助在个体的循环系统中运送、以及有效穿透细胞膜传送至细胞内位置。
相似地，溶解性较差的化合物可在助溶剂、乳化剂及表面活性剂的帮助下配制为液体剂型及适用于重制的剂型，这些助溶剂、乳化剂及表面活性剂包含但不限于，环糊精(例如α-环糊精及β-环糊精)、以及无水溶剂，其包含，但不限于，酒精、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、二甲亚砜(DMSO)、生物相容性油(例如棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油)、甘油、四氢呋喃、聚乙二醇、山梨醇酐的脂肪酸酯类及其组合(例如DMSO：玉米油)。
可依据使用需求来调整剂型的组成、形状及种类。举例来说，相比于一疾病的慢性治疗，对相同疾病进行急性治疗时，所使用的剂型可包含较大量的一种或多种活性成分。相似地，相较于口服剂型，非口服剂型在治疗相同疾病时可包含较少量的一种或多种活性成分。本领域技术人员可了解本发明特定剂型之间的差异性。例如可参照Remington’sPharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing,Easton PA(1990)。
4.1口服投予的剂型
本发明适于口服的医药组合物可配制为离散剂型(discrete dosage form)，例如但不限于，锭剂(例如咀嚼锭)、胶囊型锭剂、胶囊及液体(例如风味糖浆)。这些剂型包含预先决定量的活性成分，且可依据本领域技术人员所熟知的制药方法进行制备。例如可参照Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing,Easton PA(1990)。
可利用传统制造医药化合物的技术，将活性成分与至少一赋形剂混合成紧密混合物(intimate admixture)，以制备一般口服剂型。可依据所欲投予的制剂形式而采用不同类型的赋形剂。
基于易于投予的特性，锭剂及胶囊为两种最常见的口服剂型。若有必要，可以标准水性或非水性技术来包覆锭剂。一般来说，医药组合物及剂型是通过将活性成分与液体载体、细分的固体载体或它们两者均匀且紧密地混合后，塑形成所欲的制剂(如必要)。可于固体剂型中加入崩解剂，以辅助快速溶液。也可加入润滑剂以辅助制备剂型(例如锭剂)。
4.2非口服投予的剂型
非口服剂型可以多种途径投予至个体，包括但不限于，皮下、静脉内(包含单次快速注射)、肌肉内及动脉内。由于前述投予方式一般会避开病患对污染物的自我防御机制，因此非口服剂型一般为无菌，或可于投予至个体前进行灭菌处理。例示性的非口服剂型包含，但不限于，可直接注射的溶液、可溶解或悬浮于用以注射的医药上可接受的载体的干燥产物、可直接注射的悬浮液及乳化剂。
适用于制备本发明非口服剂型的载体为本领域技术人员所熟知。载体的例子包含但不限于，水、液体载体(例如，但不限于，氯化钠溶液、林格氏液及葡萄糖)、与水互溶的载体(例如，但不限于，乙醇、聚乙二醇及聚丙二醇)及非水性载体(例如，但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯(isopropyl myristate)及苯甲酸苄酯(benzyl benzoate))。
4.3经皮、局部及黏膜投予的剂型
经皮、区部及黏膜剂型包含但不限于，眼用溶液、喷剂、雾剂、乳剂、乳液、软膏、凝胶、溶液、乳化剂、悬浮液及其他本领域技术人员所熟知的形式。例如可参照Remington’sPharmaceutical Sciences,18th eds.,Mack Publishing,Easton PA(1990)。经皮剂型包含“储药型(reservoir type)”或“基质型(matrix type)”贴片，其可于皮肤贴附一特定时间，以促使特定剂量的活性成分穿透皮肤。
适当的赋形剂(例如载体及稀释剂)及其他可用于制备经皮、局部及黏膜剂型的材料为医药领域技术人员所熟知的物质，且可依医药组合物或其剂型所欲投予的特定组织来选用适合的赋形剂。
依据治疗组织的不同，可于投予本发明活性成分之前、同时或之后给予额外的成分。举例来说，可使用穿透增强剂来辅助活性成分传送至组织。
也可调整医药组合物或剂型的pH值，或是投予医药组合物或剂型的组织的pH值，来改善一种或多种活性成分的传送功效。相似地，可调整溶剂载体的极性、离子强度及张力来改善传送功效。可将硬脂酸盐等化合物添加于医药组合物及剂型中，以改变一种或多种活性成分的亲水性或亲油性，借以改善传送功效。于此，硬脂酸盐可作为一种制剂的脂质载体、一种乳化剂或表面活性剂，以及一种传送增加剂或穿透增强剂。可利用活性成分的不同盐类、水合物或溶剂合物来进一步调整组合物的特性。
4.4套组
本发明也涵盖一种包含可用来在个体中治疗或预防与嗜中性白血球相关的发炎疾病和/或发炎异常的制造物或是“套组”。
在一实施方案中，所述套组包含一个容器，其内含有本发明所述的化合物。所述套组适于用来治疗或预防发炎疾病和/或发炎异常，特别是与嗜中性白血球异常活化相关的疾病和/或异常，例如COPD、慢性支气管炎(CB)、肺气肿、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、囊状纤维化、特发性肺纤维化、ARDS、干癣、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、败血症、因缺血及再灌流所引发的损伤等。适当的容器包括，例如瓶、小玻璃瓶(vials)、注射针筒、气泡袋等。可使用各种不同的材料，例如玻璃或塑胶，来制造容器。容器可容纳一有效量的本发明化合物或其医药配方，以治疗或预防与嗜中性白血球异常活化相关的发炎疾病和/或发炎异常；且所述容器上还可具有一无菌通孔。举例来说，所述容器可以是静脉输液袋或是具有一可被皮下注射针穿透的止漏塞(stopper)的小玻璃瓶。所述套组可在该容器上还包含一标签或是仿单或是附带一标签或是仿单。该标签或是仿单会指明该组合物是用来治疗何种病症。或者(或额外地)，所述套组可还包含一第二容器，其中包含一医药上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲食盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)或葡萄糖液。所述套组还可包含从商业实施或是消费者角度而言，其他需要的材料，例如其他缓冲液、稀释液、填充剂、针头和针筒等。
所述套组可还包含用来投予本发明化合物的说明指引、以及(如果有)用来治疗或预防与嗜中性白血球异常活化相关的发炎疾病和/或发炎异常的第二配方。举例言之，如果所述套组包含一内含本发明化合物的第一配方，以及一第二医药配方，则所述套组可还包含说明如何对有需要的个体同时、连续或是单独投予所述第一及第二配方的指引。
于另一实施方案中，该套组为适于投予本发明化合物的固体口服剂型，举例而言，该套组包含多个单位剂量。这类套组应包括卡式包装，其上有依预定使用目的而整齐排列的单位剂量。这类套组的实例为“吸塑包装(blister pack)”。吸塑包装广泛使用于包装产业来包装医药单位剂量，必要的话，包装上还会提供用来指明依照疗程应于何时使用哪一单位剂量的(例如)数字、文字或其他标示或插入日历。
依据一实施方案，所述套组包括至少(a)一第一容器，其中包含本发明式(I)化合物；及视需要的(b)一第二容器，其中包含一第二治疗药剂，其是任何现有的抗发炎药、抗生素、抗肿瘤药或心血管药物；及(c)与所述套组相关的使用说明，用来指示使用者如何使用该套组。该使用说明可以是折页、影带、CD、VCD或DVD。
5.治疗方法
由于本发明化合物可拮抗嗜中性白血球活化后的讯递过程，因此可做为先导化合物，用来开发用以治疗发炎疾病和/或发炎异常(特别是与嗜中性白血球异常活化相关的疾病和/或异常)的药物。因此本发明内容是关于以式(I)化合物来治疗或预防与嗜中性白血球异常活化相关的疾病和/或异常的治疗用途，这些疾病和/或异常包括，例如，ARDS、ALI、COPD、肺纤维化、慢性支气管炎、肺气肿、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、囊状纤维化、特发性肺纤维化、肝脏损伤、脂肪性肝炎、肝纤维化、因缺血及再灌流所引发的损伤、心肌梗塞、休克、中风、器官移植、溃疡性结肠炎、血管炎、SLE、败血症、SIRS、关节炎、干癣、异位性皮肤炎及发炎性皮肤病。
因此本发明包含一种用以治疗或预防一患有或疑似患有与嗜中性白血球异常活化相关的发炎疾病和/或发炎异常的个体的方法。本发明方法包含对该个体投予一治疗有效量或预防有效量的式(I)化合物、该化合物的盐类或溶剂合物，以减轻、缓减和/或防止该与嗜中性白血球异常活化相关疾病的发炎疾病和/或发炎异常。
可依据本发明操作例中提供的方法来合成所述的式(I)化合物。
依据本发明所提供的实施方案，与嗜中性白血球异常活化相关的疾病和/或异常可以是下列任一种：ARDS、ALI、COPD、肺纤维化、慢性支气管炎、肺气肿、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、囊状纤维化、特发性肺纤维化、肝脏损伤、脂肪性肝炎、肝纤维化、因缺血及再灌流所引发的损伤、心肌梗塞、休克、中风、器官移植、溃疡性结肠炎、血管炎、SLE、败血症、SIRS、关节炎、干癣、异位性皮肤炎及发炎性皮肤病。
本治疗方法也可和现存可治疗前述疾病和/或异常的其他治疗方式一起使用。因此，本方法也包含在投予式(I)化合物之前、之时或之后，投予用来治疗与嗜中性白血球活化相关的发炎疾病和/或发炎异常的另一种现有药剂。此另一种现有药剂可以是抗发炎剂(例如胆固醇)、抗生素(例如盘尼西林)、抗肿瘤剂或心血管药物。举例来说，若本发明方法所欲治疗的疾病为ARDS，则除了对气喘患者投予式(I)化合物、该化合物的盐类或溶剂合物外，还可进一步包括投予能减轻、降低或缓解与ARDS相关的支气管收缩或支气管痉挛的任意现有药剂。
依据本发明内容所提供的实施方案，投予至个体的式(I)化合物的剂量约为每公斤体重0.001到100毫克，例如每公斤体重0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100毫克；较佳地，约为每公斤体重0.01到90毫克，例如0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90毫克；更佳是约为每公斤体重0.11到80毫克，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80毫克。
可视诸如所欲治疗、防治或管理的特定适应症种类、患者的年龄、性别及状况等因素，来调整式(I)化合物、该化合物的盐类或溶剂合物的剂量、施用路径和/或疗程。这些因素所扮演的角色为本领域所现有，可通过例行实验调整适应。
本发明将通过以下实施方案进行进一步说明，这些实施方案是用于证明而非用于限制本发明。虽然这些实施方案是通常使用的，但本领域技术人员所知的其他手段、方法或技术也可交换使用。
实施例
材料及方法
制备嗜中性白血球
利用葡聚醣沉降(dextran sedimentation)和菲科尔(Ficoll)离心而获得不含脂多醣状态的人类嗜中性白血球。
动物
7-8周龄的BALB/c雄鼠是购自乐斯科生物科技股份有限公司(台北，中国台湾)并饲养在有12小时光暗循环的动物房中，并可自由取用标准实验饲料及饮水。所有动物试验的操作流程都符合长庚大学动物照护及使用委员会所颁订的准则。
测量O2 ·-的产量
以可受超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)抑制的亚铁细胞色素C(ferricytochrome c)还原的量，来决定O2 ·-的产量。简言之，先在细胞培养基中添加0.5毫克/毫升的亚铁细胞色素c及1mM钙离子(Ca2+)后，在37℃下以各种浓度(0.001-10μM)的候选化合物来处理嗜中性白血球(6x105/毫升)，历时5分钟。接着，先以细胞松弛素B(cytochalasin B，CB，1微克/毫升)预处理该些嗜中性白血球3分钟，接着以甲酰基-L-甲硫胺酰-L-白胺酰-L-苯丙胺酸(fMLF，0.1μM)活化10分钟。以双光束、6槽定位光谱仪(HitachiU-3010，东京，日本)连续监控随着亚铁细胞色素c还原在550nm波长下的吸光值变化，过程中持续搅拌内容物。以反应中有或无添加SOD(100单位/毫升)的差异除以亚铁细胞色素c的消光系数(ε＝21.1mM-1/10mm)来计算O2 ·-产量。
测量弹性蛋白酶释出量
以甲氧琥珀酰基-丙胺酸-丙胺酸-辅胺酸-缬胺酸-对-硝基苯胺(Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide)作为弹性蛋白酶基质，来测量弹性蛋白酶释出量。简言之，先在培养基中加入甲氧琥珀酰基-丙胺酸-丙胺酸-辅胺酸-缬胺酸-对-硝基苯胺(100μM)，并使嗜中性白血球(6x105/毫升)在37℃平衡2分钟，再以不同浓度的候选化合物培养5分钟。先以CB(0.5微克/毫升)预处理细胞3分钟，接着以fMLF(0.1μM)活化细胞10分钟，然后连续监控405nm波长下的吸光值变化，以评估弹性蛋白酶的释出量。结果以相对于无药控制组(DMSO)的弹性酶释出百分比来表示。
细胞存活力分析
一候选化合物对嗜中性白血球的细胞毒性是使用市售套组(Promaga)，通过测量乳醣去氢酶(LDH)的量来评估。LDH是细胞质的酵素，只有当细胞膜破裂(即，细胞死亡)时才会释出，因此可作为细胞存活力的指标物。该套组是测定LDH将NAD还原成NADH时的颜色变化(λmax＝450nm)。细胞毒性系以无细胞培养基中的LDH活性与总LDH活性比较的百分比来表示。总LDH量则是以0.1％Triton X-100在37℃下处理细胞30分钟，使细胞裂解来测定。
以LPS诱发的ALI动物模式
小鼠是经候选化合物(如，HKI-4971)预处理，其中该候选化合物是以50微升内含10％DMSO和20％Kolliphor EL(Sigma-Aldrich，USA)的生理食盐水溶解，并通过静脉注射投予。投予1小时后，以Zoletil 50(30毫克/公斤)和甲苯噻嗪(6毫克/公斤)将小鼠麻醉，并以喷雾方式从气管内投予50微克的LPS(Escherichia coli 0111:B4；Sigma-Aldrich，USA)(溶解在40微升的生理食盐水中)。没有以LPS喷雾处理的小鼠则是以生理食盐水进行注射而作为控制组。接种5小时后，将小鼠以颈椎脱位术牺牲并取出其肺脏组织。以10％经缓冲的中性福马林固定肺脏左叶以进行组织切片观察，右侧的四叶则用来分析MPO活性。
骨髓过氧化酶(myeloperoxidase，MPO)活性分析
以MagNA Lyser仪器(Roche，德国)在内含0.5％(w/v)溴化十六烷基三甲基铵(HETAB，Sigma-Aldrich，USA)的PBS溶液(50mM，pH6.0)中，将肺组织均质化，并于4℃下以12,000xg的速度离心20分钟，将不溶性物质移除。过氧化酶的活性是利用其能氧化邻-联茴香胺二盐酸盐(o-dianisidine dihydrochloride，Sigma-Aldrich，USA)的程度来评估。简言之，在均质物中加入内含0.001％过氧化氢的邻-联茴香胺二盐酸盐(0.2毫克/毫升)，并在室温下反应10钟。测量波长405nm下的吸光值。MPO活性是基于Bradford的方法(Bio-Rad，USA)，以蛋白质浓度进行标准化来表示。
以咪喹莫特(imiquimod，IMQ)对小鼠诱发的类干癣皮肤发炎
使用BALB/c雄性小鼠(7-8周龄)来产生以咪喹莫特诱发的类干癣疫病模型。将小鼠背部皮肤上的毛发剃除，然后每天局部投予62.5毫克的5％咪喹莫特(IMQ)软膏(Aldara，MEDA Pharma，Sweeden)，同时给予(或不给予)连续7天通过腹膜注射待测化合物(如，HKI-4971)。
组织病理及免疫组织化学
以10％中性经缓冲福马林将组织样本固定并包埋在石蜡块中，裁切出厚度5微米的样本切片后，再以苏木素-伊红(H&E)染色。在免疫组织染色方面，先以抗-Ly6g、MPO、ki67的一级抗体进行反应，再根据SuperPicture Polymer Detection Kit(Thermo Fisher，USA)的制造指示，施用二级抗体以侦测一级抗体。最后，切片以DAB色母质接续染色，再以苏木素进行对比染色。
统计分析
结果均以平均值±平均值标准误差(SEM)来显示，以学生t-测试来进行比较。机率等于或小于0.05代表具有显著性。使用SigmaPlot软体进行统计分析。
实施例1：式(I)化合物的制造及特性分析
1.1式(I)化合物的制造
一般来说是根据流程I所记载的方式来合成式(I)化合物。
流程I
Figure BDA0003053012710000231
式(I)化合物
Figure BDA0003053012710000232
Figure BDA0003053012710000241
4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物2a；X＝N,R1＝CH3)
将溶在乙醇(100毫升)的2,4-二氯-3-氰基喹啉(5.48克，24.6毫莫耳)与甲基肼(2.21克，48.0毫莫耳)的混合溶液回流2小时(以TLC监控)。在真空下将反应混合物浓缩，过滤后收集沉淀物，以乙醇、水清洗沉淀物，干燥后可获得淡黄色的固体。以乙醇将粗产物再结晶后可获得化合物2a(4.23克，74％)。
1H-NMR(200MHz,DMSO-d6)：δ7.65-7.78(m,2H,Ar-H),7.92-7.96(m,1H,Ar-H),7.39-7.44(m,1H,Ar-H)。
4-氯异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物2b；X＝O,R1＝H)
将溶在乙醇(30毫升)的2,4-二氯-3-氰基喹啉(1.12克，5毫莫耳)、羟基胺盐酸盐(1.03克，15毫莫耳)与K2CO3(2.07克，15毫莫耳)的混合溶液回流1小时(以TLC监控)。在真空下将反应混合物浓缩，加入水(100毫升)，过滤并收集沉淀物，以水清洗沉淀物，干燥后可获得黄色的固体。以甲醇将粗产物再结晶可获得化合物2b(0.71克，65％)。
Mp.：194-196℃。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：7.52-7.60(m,1H,Ar-H),7.73-7.78(m,2H,Ar-H),8.06(d,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),8.72(br s,2H,NH2)。
合成4-经取代-苯胺基-1甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物3-18)及4-经取代-苯胺基异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物19-33)的一般性方法
将化合物2a或化合物2b(2毫莫耳)与溶在DMF(25毫升)中经适当取代的苯胺(4毫莫耳)的混合物进行回流(过程中进行搅拌)，历时2-5小时(以TLC监控)。将混合物冷却并在真空下蒸发以获得残留物，且于残余物中加入水(50毫升)。收集沉淀物并以水清洗后，将其干燥以产生粗固体，并以乙醇将该固体再结晶。
以下列方式鉴别各化合物：薄层色层层析(TLC)(预涂布(0.2毫米)的硅胶60F254板，购自EM实验室股份有限公司)，以UV光(254nm)侦测；熔点(Electrothermal IA9100数位熔点侦测仪；未校正)；和1H、13C NMR光谱(400及100MHz的Varian-Unity-400光谱仪或200及50MHz的Varian-Gemini-200光谱仪，化学位移以ppm表示，其是以SiMe4作为内部标准品(＝0ppm)，耦合常数J以Hz表示)。元素分析是以Heraeus CHN-O-Rapid元素分析仪进行分析，且结果是以在计算数值的±0.4％范围内。
4-苯胺-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物3，HKI-4961)
产率40％；熔点：186-187℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ4.19(s,3H,NCH3),5.58(br s,2H,NH2),6.99-7.03(m,1H,Ar-H),7.33-7.37(m,3H,Ar-H),7.52-7.56(m,1H,Ar-H),7.67-7.70(m,1H,Ar-H),7.95-7.97(m,2H,Ar-H),8.22-8.24(m,1H,Ar-H),8.25(brs,1H,NH)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ39.18,99.13,114.49,119.93(2C),121.71,121.96,122.46,126.96,128.45(2C),128.51,140.52,140.67,146.07,147.29,148.95。元素分析预测C17H15N5：C 70.57,H 5.23,N 24.21；实际：C 70.20,H 5.24,N 24.14。
4-(4-氟苯胺)-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物4，HKI-4962)
产率62％；熔点：218-219℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ4.19(s,3H,NCH3),5.90(br s,2H,NH2),7.24-7.28(m,2H,Ar-H),7.37-7.41(m,1H,Ar-H),7.55-7.59(m,1H,Ar-H),7.72-7.74(m,1H,Ar-H),7.84-7.87(m,2H,Ar-H),8.24-8.26(m,1H,Ar-H),9.26(brs,1H,NH)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ39.35,97.75,113.74,115.39,115.61,112.36(2C),123.37,123.84,129.14,135.390,140.05,142.33,148.59,157.37,159.74。元素分析预测C17H14FN5·0.3HCl：C 64.14,H 4.53,N 22.00；实际：C 63.87,H 4.73,N 21.77。
4-(2-甲氧基苯胺)-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物5，HKI-4966)
产率74％；熔点：229-230℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.90(s,3H,OCH3),4.21(s,3H,NCH3),5.21(br s,2H,NH2),6.98-7.08(m,3H,Ar-H),7.32-7.36(m,1H,Ar-H),7.53-7.57(m,1H,Ar-H),7.73-7.75(m,1H,Ar-H),8.22-8.24(m,1H,Ar-H),8.69(br s,1H,NH),8.99-8.02(m,1H,Ar-H)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ39.11,56.04,100.52,110.55,114.44,119.16,120.50,121.46,121.96,122.43,127.12,128.50,129.78,140.20,146.35,147.28,148.05,149.12。元素分析预测C18H17FN5O：C 67.70,H 5.37,N 21.93；实际：C67.37,H 5.39,N 21.85。
4-(3-甲氧基苯胺)-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物6，HKI-4965)
产率79％，熔点：284-286℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.80(s,3H,OCH3),4.19(s,3H,NCH3),5.58(br s,2H,NH2),6.58-6.60(m,1H,Ar-H),7.22-7.26(m,1H,Ar-H),7.32-7.42(m,2H,Ar-H),7.53-7.75(m,1H,Ar-H),7.69-7.71(m,1H,Ar-H),7.88(br s,1H,NH),8.23-8.26(m,2H,Ar-H)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ39.17,54.93,99.19,105.43,107.30,112.12,114.45,121.97,122.57,126.97,128.56,129.11,140.48,141.86,145.95,147.24,148.88,159.49。元素分析预测C18H17N5O·0.4HCl：C 64.72,H 5.26,N 20.97；实际：C 64.96,H 5.29,N 21.08。
4-(4-甲氧基苯胺)-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物7，HKI-4964)
产率62％；熔点：193-194℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.82(s,3H,OCH3),4.20(s,3H,NCH3),6.30(br s,2H,NH2),7.06-7.08(m,2H,Ar-H),7.43-7.47(m,1H,Ar-H),7.59-7.63(m,3H,Ar-H),7.81-7.83(m,1H,Ar-H),8.26-8.28(m,1H,Ar-H),9.74(br s,1H,NH)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ39.58,55.37,96.37,112.90,114.71(2C),121.28,122.79,124.23,125.78,129.59,129.82,138.43,139.55,148.50,149.88,157.43。元素分析预测C18H17N5O·0.5HCl：C 64.02,H 5.23,N 20.74；实际：C 64.13,H 5.42,N 20.69。
4-(3,4,5-三甲氧基苯胺)-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物8，HKI-4963)
产率63％；熔点：219-220℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.68(s,3H,OCH3),3.82(s,6H,OCH3),4.19(s,3H,NCH3),5.75(br s,2H,NH2),7.38(m,3H,Ar-H),7.56-7.60(m,1H,Ar-H),7.72-7.76(m,1H,Ar-H),8.24-8.26(m,1H,Ar-H)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ39.29,55.79(2C),60.12,98.54,113.92,122.24,122.97,123.13,127.10,129.00,140.11,148.59,152.85。元素分析预测C20H21N5O3·0.5HCl：C 60.39,H 5.46,N 17.61；实际：C60.08,H 5.57,N 17.36。
1-甲基-4-(4-甲基硫代苯胺)-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物9，HKI-4967)
产率84％；熔点：233-235℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.48(s,3H,SCH3),4.18(s,3H,NCH3),5.71(br s,2H,NH2),7.29-7.37(m,3H,Ar-H),7.53-7.57(m,1H,Ar-H),7.69-7.71(m,1H,Ar-H),7.86-7.88(m,2H,Ar-H),8.22-8.24(m,1H,Ar-H)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ15.88,39.22,98.58,114.15,121.42,122.10(2C),122.77,125.80,127.37(2C),128.74,130.67,137.67,140.28,144.66,147.78,148.65。元素分析预测C18H17N5S·0.2HCl：C63.08,H 5.06,N 20.43,S 9.36；实际：C 63.01,H 5.19,N 20.43,S 9.39。
4-(4-乙酰苯胺)-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物10，HKI-4968)
产率60％；熔点：272-274℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6+TFA-d)：δ2.65(s,3H,COCH3),4.28(s,3H,OCH3),7.62-7.74(m,4H,Ar-H),7.93-7.95(m,1H,Ar-H),8.14-8.17(m,2H,Ar-H),8.39-8.41(m,1H,Ar-H)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6+TFA-d)：δ26.89,40.06,96.94,113.17,119.71,123.61,123.98(2C),126.17,130.46(2C),131.04,135.22,135.53,140.11,140.97,147.68,151.36,197.17。元素分析预测C19H17N5O：C 68.87,H 5.17,N21.13；实际：C 68.67,H 5.18,N 20.95。
4-(2-羟基苯胺)-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物11，HKI-4973)
产率64％；熔点：233-235℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ4.21(s,3H,NCH3),5.98(br s,2H,NH2),6.91-6.95(m,1H,Ar-H),7.03-7.04(m,1H,Ar-H),7.13-7.14(m,1H,Ar-H),7.24-7.45(m,1H,Ar-H),7.58-7.62(m,1H,Ar-H),7.81-7.83(m,2H,Ar-H),8.26-8.28(m,1H,Ar-H)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ39.28,97.06,113.06,116.81(2C),119.44(2C),122.25,122.76,123.97,124.94,126.56,129.68,139.58,148.58,149.38,150.37。元素分析预测C17H15N5O·1.0HCl：C 59.72,H 4.72,N 20.49；实际：C 59.62,H 5.06,N20.30。
4-(3-羟基苯胺)-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物12，HKI-4972)
产率70％；熔点：190-191℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ4.21(s,3H,NCH3),6.23(br s,2H,NH2),6.66-6.69(m,1H,Ar-H),7.07-7.09(m,1H,Ar-H),7.22-7.26(m,2H,Ar-H),7.45-7.4(m,1H,Ar-H),7.61-7.65(m,1H,Ar-H),7.83-7.85(m,2H,Ar-H),8.27-8.29(m,1H,Ar-H),9.75(br s,1H,OH)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ39.58,97.14,110.25,113.13,113.59,122.81,124.34,129.83,130.13,138.38,139.77,148.14,149.81,158.31。元素分析预测C17H15N5O·0.9HCl：C 60.36,H 4.77,N 20.71；实际：C 59.99,H 5.06,N20.31。
4-(4-羟基苯胺)-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物13，HKI-4971)
产率79％；熔点：320-322℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ4.20(s,3H,NCH3),6.47(br s,2H,NH2),6.93-6.97(m,2H,Ar-H),7.34-7.37(m,2H,Ar-H),7.48-7.52(m,1H,Ar-H),7.62-7.66(m,1H,Ar-H),7.89-7.91(m,1H,Ar-H),8.27-8.29(m,1H,Ar-H),9.94(brs,1H,OH),11.62(br s,1H,NH)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ39.29,95.29,112.33,116.47(2C),119.27,123.10,125.00,125.97,127.36,130.31,135.59,139.17,148.35,150.77,157.17。元素分析预测C17H15N5O·1.0HCl：C 59.72,H 4.72,N 20.49；实际：C 59.64,H4.85,N 20.41。
4-(4-三氟甲基苯胺)-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物14，HKI-4974)
产率59％；熔点：219-220℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，TFA-d)：δ4.28(s,3H,NCH3),7.60-7.63(m,1H,Ar-H),7.72-7.81(m,3H,Ar-H),7.90-7.95(m,3H,Ar-H),8.38-8.40(m,1H,Ar-H)。元素分析预测C18H14F3N5·1.3HCl：C 53.40,H 3.81,N 17.30；实际：C 53.00,H4.12,N 17.20。
4-[(3-胺基-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-4-基)胺基]苯甲酸(化合物15，HKI-4970)
产率68％；熔点：325-326℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ4.24(s,3H,NCH3),7.59-7.59(m,1H,Ar-H),7.69-7.79(m,3H,Ar-H),7.87-7.89(m,1H,Ar-H),8.04-8.06(m,1H,Ar-H),8.34-8.37(m,1H,Ar-H),8.27-8.29(m,1H,Ar-H)。13C-NMR(100MHz,SO-d6)：δ39.29,97.33,112.94,120.22,122.67,123.15,125.46,127.67,130.45,130.91(2C),131.16,136.34,139.79,141.47,147.39,150.81,166.82。元素分析预测C18H15N5O2·1.0HCl：C58.44,H 4.36,N 18.93；实际：C 58.04,H 4.50,N 18.79。
2-[(3-胺基-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-4-基)胺基]苯硫酚(化合物16，HKI-4975)
产率42％；熔点：235-236℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.14(s,3H,NCH3),5.03(br s,1H,SH),6.05(br s,1H,NH2),6.93-6.97(m,1H,Ar-H),6.85-6.87(m,1H,Ar-H),7.02-7.04(m,1H,Ar-H),7.20-7.30(m,2H,Ar-H),7.36-7.41(m,1H,Ar-H),7.81-7.86(m,1H,Ar-H)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ35.75,100.80,111.46,115.40,116.44,120.82,121.33,123.74,125.82,131.11,131.31,132.51,140.24,147.51,152.11,153.59,161.85。元素分析预测C17H15N5S·0.1HCl：C 62.82,H 4.68,N 21.55,S 9.86；实际：C 63.03,H4.72,N 21.55,S 9.88。
4-(4-氯苯胺)-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物17,TCH-30o)
产率82％；熔点：281-282℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ4.23(s,3H,NCH3),7.53-7.61(m,3H,Ar-H),7.66-7.71(m,3H,Ar-H),7.88-7.90(m,1H,Ar-H),8.33-8.34(m,1H,Ar-H),12.19(br s,1H,NH)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ39.77,96.36,112.62,119.49,123.18,125.36,126.43(2C),129.74(2C),130.46,130.99,135.31,135.70,139.49,147.76,150.97。元素分析预测C17H14ClN5·1.5HCl：C 53.93,H 4.13,N 18.50；实际：C54.09,H 4.44,N 18.53。
4-(4-甲基苯胺)-1-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]喹啉-3-胺(化合物18，TCH-30p)
产率85％；熔点：253-255℃(EtOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.36(s,3H,CH3),4.20(s,3H,NCH3),6.22(br s,2H,NH2),7.27-7.29(m,2H,Ar-H),7.43-7.47(m,1H,Ar-H),7.559-7.63(m,3H,Ar-H),7.79-7.81(m,1H,Ar-H),8.26-8.28(m,1H,Ar-H),9.72(br s,1H,NH)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ20.63,39.50,97.08,113.19,122.14,122.67(2C),123.14,124.05,129.65,129.78(2C),134.30,135.09,139.44,139.76,148.34,149.57。元素分析预测C18H17N5·1.1HCl：C 62.93,H 5.32,N 20.39；实际：C 62.80,H 5.73,N20.44。
4-苯胺异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物19，HKI-4978)
产率40％；熔点：266-267℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.42-7.45(m,2H,Ar-H),7.54-7.71(m,6H,Ar-H),7.96-7.99(m,1H,Ar-H),10.04(br s,2H,NH2),11.47(brs,1H,2H,NH,HCl)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ82.82,111.73,123.07,125.37,125.61(2C),127.63,129.80(2C),132.22,135.07,136.29,148.52,155.35,168.52。元素分析预测C16H12N4O·1.1HCl：C 60.71,H 4.18,N 17.70；实际：C 60.94,H 4.45,N 17.45。
4-(4-氟苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物20，HKI-4979)
产率67％；熔点：271-272℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.39-7.44(m,3H,Ar-H),7.60-7.70(m,4H,Ar-H),7.96-7.98(m,1H,Ar-H),7.96-7.99(m,1H,Ar-H),10.02(brs,2H,NH2),11.46(br s,1H,2H,NH,HCl)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ82.69,111.71,116.70(2C,J＝22.8Hz),118.97,123.11,125.39,128.45(2C,J＝8.3Hz),131.16,132.26,136.33,148.87,155.33,161.34(J＝242.6Hz),168.52。元素分析预测C16H11FN4O·1.0HCl：C58.08,H 3.66,N 16.94；实际：C 57.97,H 3.95,N 16.85。
4-(2-甲氧基苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物21，HKI-4983)
产率40％；熔点：261-262℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.79(s,3H,OCH3),7.11-7.15(m,1H,Ar-H),7.26-7.28(m,1H,Ar-H),7.40-7.52(m,3H,Ar-H),7.61-7.65(m,1H,Ar-H),7.74-7.76(m,1H,Ar-H),7.96-7.98(m,1H,Ar-H),9.91(br s,2H,NH2),10.99(brs,1H,2H,NH,HCl)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ55.95,82.11,111.55,113.24,118.81,121.19,122.12,123.25,125.54,128.55,130.19,132.50,136.21,148.49,154.43,155.19,168.64。元素分析预测C17H14N4O2·1.1HCl：C 58.92,H 4.40,N 16.17；实际：C 59.01,H4.58,N 15.92。
4-(3-甲氧基苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物22，HKI-4982)
产率50％；熔点：262-263℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.80(s,3H,OCH3),6.99-7.02(m,1H,Ar-H),7.26-7.28(m,2H,Ar-H),7.40-7.48(m,2H,Ar-H),7.62-7.66(m,1H,Ar-H),7.71-7.73(m,1H,Ar-H),7.97-7.98(m,1H,Ar-H),10.02(br s,2H,NH2),11.44(br s,2H,NH,HCl)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ55.38,82.50,111.27,111.74,113.43,117.60,119.07,123.05,125.36,130.57,132.23,136.08,136.35,148.48,155.36,160.20,168.51。元素分析预测C17H14N4O2·1.1HCl：C 58.92,H 4.40,N 16.17；实际：C 58.92,H4.56,N 15.85。
4-(4-甲氧基苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物23，HKI-4981)
产率43％；熔点：257-259℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.84(s,3H,OCH3),7.10-7.13(m,2H,Ar-H),7.38-7.48(m,3H,Ar-H),7.60-7.63(m,1H,Ar-H),7.70-7.72(m,1H,Ar-H),7.95-7.96(m,1H,Ar-H),9.98(br s,2H,NH2),11.17(br s,1H,NH),11.32(br s,1H,HCl)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ55.45,82.38,111.61,115.06(2C),118.97,123.05,125.19,127.13,127.66(2C),132.17,136.42,148.83,155.31,158.81,168.42。元素分析预测C17H14N4O2·1.1HCl：C 58.92,H 4.40,N 16.17；实际：C 58.83,H 4.49,N 16.01。
4-(3,4,5-三甲氧基苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物24，HKI-4980)
产率63％；熔点：264-266℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.74(s,3H,OCH3),3.79(m,6H,OCH3),6.95(s,2H,Ar-H),7.42-7.44(m,1H,Ar-H),7.62-7.67(m,1H,Ar-H),7.76-7.78(m,1H,Ar-H),7.96-7.99(m,1H,Ar-H),10.02(br s,2H,NH2),11.34(br s,1H,NH),11.44(br s,1H,HCl)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ56.12(2C),60.01,82.50,103.75(2C),111.62,119.01,123.03,125.33,130.14,132.26,136.27,136.87,148.50,153.55(2C),155.31,168.47。元素分析预测C19H18N4O4·1.2HCl：C 55.64,H 4.72,N 13.66；实际：C55.65,H 5.01,N 13.51。
4-(4-甲基硫代苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物25，HKI-4984)
产率42％；熔点：246-247℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.55(s,3H,SCH3),7.39-7.52(m,5H,Ar-H),7.61-7.69(m,3H,Ar-H),7.95-7.97(m,1H,Ar-H),10.02(br s,2H,NH2),11.39(br s,2H,NH,HCl)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ14.67,82.70,111.69,119.03,123.04,125.25,126.35(2C),126.87(2C),131.69,132.16,136.44,137.79,148.55,155.33,168.43。元素分析预测C17H14N4OS·1.1HCl：C 56.33,H 4.20,N 15.46,S 8.85；实际：C 56.21,H 4.22,N 15.34,S 8.88。
4-(3-乙酰基苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物26，HKI-4986)
产率40％；熔点：249-250℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.62(s,3H,COCH3),7.36(m,1H,Ar-H),7.60-7.65(m,3H,Ar-H),7.89-7.96(m,3H,Ar-H),8.25(m,1H,Ar-H),9.61(br s,2H,NH2),10.94(br s,1H,NH),11.27(br s,1H,HCl)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ26.89,112.30,122.96(2C),124.10,124.63,125.77,128.83,129.84,131.92,137.90,148.66,156,13,167.86,197.60。元素分析预测C18H14N4O2·1.2HCl：C 59.69,H4.23,N 15.47；实际：C 59.50,H 4.62,N 15.19。
4-(4-乙酰苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物27，HKI-4987)
产率50％；熔点：255-257℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.60(s,3H,COCH3),7.36(m,1H,Ar-H),7.60(m,2H,Ar-H),7.79-7.80(m,2H,Ar-H),7.94-7.96(m,1H,Ar-H),8.04-8.06(m,1H,Ar-H),9.45(br s,2H,NH2),10.48(br s,1H,NH),11.83(br s,1H,HCl)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ26.67,84.16,112.45,121.48,122.95(2C),123.33,124.81,125.15,129.63(2C),130.57,131.87,133.32,148.15,156.25,167.76,196.85。元素分析预测C18H14N4O2·1.3HCl：C 59.09,H 4.22,N 15.31；实际：C 59.20,H 4.58,N14.96。
4-(2-羟基苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物28，HKI-4990)
产率42％；熔点：240-241℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ6.87-6.96(m,2H,Ar-H),7.10(m,1H,Ar-H),7.21(m,1H,Ar-H),7.34-7.36(m,2H,Ar-H),7.50(m,1H,Ar-H),7.88(m,1H,Ar-H),8.46(br s,1H,NH),8.78(br s,2H,NH2),11.42(br s,1H,OH)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ83.79,112.90,119.13,122.78,123.03,124.31,124.92,126.09,128.00,131.36(2C),145.30,149.84,150.29,157.64,166.34。元素分析预测C16H12N4O2·0.7HCl：C60.45,H 4.03,N 17.62；实际：C 60.34,H 4.45,N 17.52。
4-(4-羟基苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物29，HKI-4988)
产率45％；熔点：236-237℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ6.80-6.85(m,2H,Ar-H),7.19-7.23(m,1H,Ar-H),7.44-7.52(m,4H,Ar-H),7.86-7.88(m,1H,Ar-H),8.88(brs,2H,NH2),9.43(br s,1H,NH),10.84(br s,1H,OH)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ83.55,112.63,113.98,115.39(2C),116.15,122.67(2C),122.98,125.34,127.16,131.27,149.09,154.57,157.10,166.70。元素分析预测C16H12N4O2·1.9HCl：C 58.84,H 4.88,N17.16；实际：C 58.74,H 4.59,N 17.01。
4-(4-三氟甲基苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物30，HKI-4991)
产率42％；熔点：227-229℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.34(m,1H,Ar-H),7.57(m,2H,Ar-H),7.81-7.93(m,3H,Ar-H),7.93-7.94(m,2H,Ar-H),9.26(br s,2H,NH2),10.16(br s,1H,NH),11.65(br s,1H,OH)。元素分析预测C17H11F3N4O·0.4HCl：C 56.88,H3.20,N 15.61；实际：C 56.59,H3.34,N 15.35。
4-[(3-胺基异恶唑[4,5-c]喹啉-4-基)胺]苯甲酸(化合物31，HKI-4985)
产率58％；熔点：308-310℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.44-7.46(m,1H,Ar-H),7.61-7.72(m,4H,Ar-H),7.98-8.09(m,3H,Ar-H),10.05(br s,2H,NH2),11.62(brs,1H,NH),11.80(br s,1H,HCl),13.01(br s,1H,COOH)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ83.57,111.94,119.23,123.12,124.74,125.61,129.03,130.84(2C),131.16,132.29,136.40,139.78,148.40,155.43,166.75,168.60。元素分析预测C17H12N4O3·1.4HCl：C54.96,H 3.64,N15.08；实际：C 54.97,H 3.95,N 15.303。
4-(4-氯苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物32，TCH-30q)
产率75％；熔点：268-269℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.41-7.46(m,1H,Ar-H),7.59-7.69(m,6H,Ar-H),7.97-7.99(m,1H,Ar-H),9.94(br s,2H,NH2),11.31(br s,2H,NH,HCl)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ83.09,111.86,119.17,123.25,125.67,127.79(2C),129.99(2C),132.22,132.45,134.15,136.45,148.82,155.48,168.68。元素分析预测C16H11ClN4O·1.0HCl：C 55.33,H 3.49,N 16.140；实际：C 55.37,H 3.45,N16.24。
4-(4-甲基苯胺)异恶唑[4,5-c]喹啉-3-胺(化合物33，TCH-30r)
产率80％；熔点：173-175℃(己烷)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.40(s,3H,CH3),7.37-7.45(m,5H,Ar-H),7.61-7.65(m,1H,Ar-H),7.70-7.72(m,1H,Ar-H),7.95-7.98(m,1H,Ar-H),9.92(br s,2H,NH2),11.20(br s,2H,NH,HCl)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ20.88,82.71,111.75,119.14,123.20,125.50,125.92(2C),130.52(2C),132.20,132.40,136.42,137.57,148.78,155.44,168.63。元素分析预测C17H14N4O·1.1HCl：C 61.78,H4.61,N16.96；实际：C 61.63,H 4.62,N 16.97。
1.2实施例1的化合物的特性分析
1.2.1式(I)化合物抑制人类嗜中性白血球中O2 ·-的产生及弹性蛋白酶的释出
在本实施例中，探查实施例1的化合物(即，式(I)化合物)于抑制人类嗜中性白血球中超氧阴离子的产生及弹性蛋白酶释出的效果。结果归纳于表2中。
表2：实施例1的化合物对经FMLF/CB诱发的人类嗜中性白血球中的超氧阴离子产生及弹性蛋白酶释出的影响
Figure BDA0003053012710000361
Figure BDA0003053012710000371
在浓度10μM下的抑制百分比(抑制％)
结果是以平均值±平均值标准误差(S.E.M.)来表示(n＝3-5)，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，相对于控制组而言
a指达到50％抑制所需的浓度(IC50)
如表2所示，除化合物6、9、16、19、21、24、25、27、30、31、32及33之外，大部分的化合物都能抑制嗜中性白血球细胞因fMLF所产生的超氧阴离子(IC50介于约4nM至8.6μM间)及弹性蛋白酶释出(IC50介于约32nM至7.2μM间)。在这些化合物中，又以化合物13(HKI-4971)的效力最强，其抑制超氧阴离子产生的IC50约为3.7±1.7nM；且抑制弹性蛋白酶释出的IC50约为32±17nM。因此，在后续的实施例2及3中，即选用HKI-4971来进一步评估其生物活性。
实施例2：HKI-4971抑制咪喹莫特诱发的干癣的进程
在本实施例中，是使用已被完善建立的干癣动物模型来评估HKI-4971(或化合物13)对干癣进程的影响，其中，该模型是经咪喹莫特(IMQ)诱发类干癣皮肤发炎。简言之，以腹膜注射方式将HKI-4971(20毫克/公斤)注射至BALB/c小鼠体内进行预处理，30分钟后再于小鼠背部皮肤涂抹5％IMQ软膏，连续涂抹7天。接着，以显微镜观察从这些动物采样的皮肤样本，并进行免疫组织化学染色；同时抽取血液样品分析其肝脏及肾脏功能。结果绘示于图1至图3。
图1(A)是拍摄自一接受IMQ(左方)或是IMQ+HKI-4971(右方)处理的代表性小鼠的照片；至于图1(B)及图1(C)的照片则分别是拍摄自经IMQ处理的控制组小鼠及接受IMQ+HKI-4971处理的小鼠的皮肤的显微影像。以取自这些小鼠的皮肤样本进行免疫染色后确认其中的细胞增生标记物(即，ki-67)和嗜中性白血球的标记物(即，Ly6g及MPO)均受到HKI-4971的抑制(图2)。因此，HKI-4971可降低实验动物因IMQ-诱发的干癣的严重程度及进程。
分析取自经IMQ-或IMQ+HKI-4971处理的小鼠的血液样本中代表肝功能的丙胺酸转胺酶和天冬胺酸转胺酶的量、以及代表肾脏功能的血尿氮(BUN)和肌酸酐(CRE)的量，结果显示于图3。如图3所示的数据所显示，以IMQ或HKI-4971单独或并用来处理小鼠，并不会显著损伤其肝脏或肾脏功能。
整体而言，上述数据确认HKI-4971对IMQ诱发的干癣具有保护效果，因此可当作治疗干癣或是肇因于多种病因(包括，但不限于细菌感染、创伤、自体免疫异常和过敏)的皮肤发炎性疾病的药物。
实施例3：HKI-4971调控LPS诱发的ALI
在本实施例中，以格兰氏阴性细菌内毒素LPS对小鼠诱发产生ALI，以模拟人类ARDS，并评估HKI-4971的效果。简言之，先对BALB/c小鼠施以静脉注射HKI-4971(20毫克/公斤)进行预处理，历时1小时，接着以气管内注射方式投予LPS(2毫克/公斤)，历时5小时。测量肺脏组织中的MPO活性与嗜中性白血球标记物(即，Ly6g和MPO)的量作为肺脏受损的指标。结果绘示于图4。
如图4(A)所绘示，LPS会诱发肺脏中代表发炎细胞的MPO活性激增，此激增的活性可被HKI-4971所抑制。图4(B)是以H&E染色的肺脏切片、以及在光学显微镜下观察嗜中性白血球标记物的代表性照片。可发现HKI-4971能明显减轻LPS诱发的嗜中性白血球渗透及肺脏损伤。
整体而言，上述数据确认HKI-4971对LPS诱发的肺脏损伤具有保护效果，因此可用作治疗ALI或是ARDS(其往往肇因于多种因素，包括但不限于，败血症、创伤、及肺炎)的药物。
应了解，上文对实施方案的叙述仅用于例示，本领域技术人员可对其进行各种修饰。上述说明书、实施例及数据对本发明例示性实施方案的结构及用途提供了完整叙述。虽然上文已以具有某种程度的特定性的方式、或参照一个或多个个别实施方案的方式叙述本发明的多种实施方案，本领域技术人员可在不悖离本发明的精神或范围的情况下，对所记载的实施方案进行多种变动。

Claims (11)

1.一种式(I)化合物、或该化合物的盐类：
Figure FDA0004264324170000011
其特征在于，
X是N或O；
R1是烷基或不存在，其中当X是O时，R1不存在，且当X是N时，R1是烷基；
R2、R3、R4及R5独立为氢、羟基、氢硫基、卤素、烷基、卤烷基、-OR6、-SR6、-(C＝O)R6或-COOH；且
R6是烷基或卤烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中X是N，R1是甲基，R2、R3及R5独立为氢，且R4是羟基。
3.一种医药组合物，其特征在于，包含一式(I)化合物、或该化合物的盐类
Figure FDA0004264324170000012
其中：
X是N或O；
R1是烷基或不存在，其中当X是O时，R1不存在，且当X是N时，R1是烷基；
R2、R3、R4及R5独立为氢、羟基、氢硫基、卤素、烷基、卤烷基、-OR6、-SR6、-(C＝O)R6或-COOH；且
R6是烷基或卤烷基；以及
一医药上可接受的赋形剂。
4.如权利要求3所述的医药组合物，其特征在于，其中在式(I)化合物中，X是N，R1是甲基，R2、R3及R5独立为氢，且R4是羟基。
5.一种使用式(I)化合物、或该化合物的盐类在制造一医药组合物的用途，其特征在于，该医药组合物用来治疗罹患发炎疾病和/或发炎异常的个体，该式(I)的结构为
Figure FDA0004264324170000021
其中：
X是N或O；
R1是烷基或不存在，其中当X是O时，R1不存在，且当X是N时，R1是烷基；
R2、R3、R4及R5独立为氢、羟基、氢硫基、卤素、烷基、-OR6、-SR6、-(C＝O)R6或-COOH；且
R6是烷基或卤烷基。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，其中在式(I)中，X是N，R1是甲基，R2、R3及R5独立为氢，且R4是羟基。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，其中该发炎疾病和/或发炎异常选自由以下所组成的群组：急性呼吸窘迫症候群、急性肺损伤、慢性肺阻塞、肺纤维化、肝脏损伤、脂肪性肝炎、肝纤维化、因缺血及再灌流所引发的损伤、心肌梗塞、休克、中风、器官移植、血管炎、全身性红斑狼疮、败血症、全身性炎症反应症候群、关节炎、干癣、异位性皮肤炎及发炎性皮肤病。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，其中该发炎疾病和/或发炎异常是急性肺损伤。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，其中该发炎疾病和/或发炎异常是急性呼吸窘迫症候群。
10.如权利要求7所述的用途，其特征在于，其中该发炎疾病和/或发炎异常是干癣。
11.如权利要求5所述的用途，其特征在于，其中该个体是人类。
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