CN113038942A - 以二苯甲基硫代乙酰胺(Benzhydryl Tthioacetamide)化合物为有效成分的纤维化疾病治疗用组合物 - Google Patents

以二苯甲基硫代乙酰胺(Benzhydryl Tthioacetamide)化合物为有效成分的纤维化疾病治疗用组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及以二苯甲基硫代乙酰胺化合物为有效成分含有的纤维化疾病治疗用组合物，具体是，抑制细胞膜中KCa2.3通道蛋白质的表达，尤其治疗肝纤维化以及肺纤维化效果突出的纤维化疾病治疗用组合物。

Description

以二苯甲基硫代乙酰胺(Benzhydryl Tthioacetamide)化合 物为有效成分的纤维化疾病治疗用组合物
【技术领域】
本发明涉及二苯甲基硫代乙酰胺化合物为有效成分含有的纤维化疾病治疗用组合物，具体是，抑制细胞膜中KCa2.3通道蛋白质的表达，尤其治疗肝纤维化以及肺纤维化效果突出的纤维化疾病治疗用组合物。
【背景技术】
生物组织的纤维化是胶原蛋白等细胞外基质(extracellular matrix)过度堆积于组织中的现象，在受损伤的组织修复(injury and repair)的过程中发生。这种纤维化在体内任何脏器中皆有可能发生，尤其在受损伤严重且广泛以及如慢性疾病损伤和修复反复时容易发生。纤维化发生以后，受损伤的组织被功能不正常的纤维化组织替代而导致脏器的功能减弱。因此纤维化广泛发生时，脏器的功能大幅减弱，引发各种疾病。尤其肝、肺、肾脏、心脏等对生命产生直接影响的内脏器官发生纤维化，会对健康产生致命性影响。
通常发生纤维化的过程可以分为1)接触到诱发纤维化疾病(大概慢性疾病)或诱发物质的过程；2)其结果而发生的纤维化过程(炎症、纤维化以及血管新生)。因诱发纤维化疾病或诱发物质而发生炎症或损伤时，因参与此过程的细胞中分泌出的生长因子(growthfactor)和细胞因子等而促进纤维化和血管新生(angiogenesis)。因此纤维化疾病是可以通过消除诱发纤维化因素(疾病或物质)或抑制纤维化过程达到治疗目的。
但事实上完全消除纤维化诱因是不可能的。如特发性肺纤维化症，会发生不明原因的情况，作为肝纤维化主要原因的慢性病毒性肝炎和脂肪性肝炎、诱发心脏及肾纤维化的糖尿病、各种纤维化疾病大量发生的衰老等大部分诱因是无法根治的。因此纤维化疾病治疗除了要治疗病因之外，还需并行抑制纤维化过程(炎症、纤维化、血管新生)的治疗。但至今尚未开发出能够抑制纤维化过程的治疗药物。
纤维化过程中肌成纤维细胞(myofibroblast)的形成与肝星状细胞(hepaticstellate cell)的活性化(在肝里活性化的肝星状细胞发挥肌纤维化细胞的作用)非常重要。包括肝星状细胞活性化的肌成纤维细胞形成是成纤维细胞(fibroblast)或者平滑肌细胞等活性化或者内皮细胞等通过内皮-间充质细胞转化(endothelial-mesenchymaltransition)过程发生。肌成纤维细胞形成以后，细胞增殖就会活跃，导致肌成纤维细胞数量大幅增加，胶原蛋白等细胞外基质生产增加，血管内皮细胞增殖也会活跃而促进血管新生。这种纤维化过程即肌成纤维细胞形成(包括肝星状细胞活性化)、肌成纤维细胞增殖、细胞外基质生成、血管内皮细胞的活性化和血管新生等是通过被细胞内Ca2+活性化的通路(Ca2+-dependent signaling pathways)发生。因此Ca2+在纤维化过程中发挥极重要的使用。
成纤维细胞、肝星状细胞、血管内皮细胞中Ca2+-activated K+channels即“KCa通道”对Ca2+的增加发挥非常重要的作用。因为KCa通道活性化时，膜电位超极化而产生使Ca2+流入的动力。负责这种作用的KCa通道包括KCa2.3通道和KCa3.1通道。这两个K+通道是结构和功能类似，但分布的细胞中存在差异。
KCa2.3通道是大部分在组织细胞中发生mRNA而存在分布于体内大部分组织(Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.2004；369(6)：602-15)的可能性，一般在肝、神经、血管内皮细胞中分布得较多。反之，KCa3.1通道是主要分布在血管内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞、红血球等(Curr Med Chem.2007；14(13)：1437-57；Expert Opin TherTargets.2013；17(10)：1203–1220)。
如上所述，KCa2.3通道或KCa3.1通道可以诱发细胞内Ca2+的增加，对纤维化进程的影响较大，因此被作为纤维化疾病治疗药物的主要靶点得以研究。据报告，KCa2.3通道的可选抑制剂蜂毒明肽(apamin)对纤维化过程重要的内皮-间充质细胞转化过程具有抑制效果，对肝纤维化和胆道纤维化具有治疗效果(Biochem Biophys Res Commun.2014；450(1)：195-201；Int J.Mol Med.2017；39(5)：1188-1194)。
至今开发的离子通道抑制药物均作为抑制离子通道活动度的药物，通过通道蛋白抑制离子的流动。但通过离子通道的细胞功能不仅可以通过所述抑制通道活动度的方式，也可以通过减少细胞膜中发生的通道蛋白数(抑制通道蛋白的细胞膜发生)的方法调节。但调节通道蛋白的细胞膜发生水平的药物至今尚未得以开发，今后这些方法有望成为开发新药所需的新的解决方案(Chem Med Chem.2012；7(10)；1741–1755)。尤其，纤维化疾病是通过生长因子，使KCa2.3通道的表达增加，因此可以将抑制KCa2.3通道蛋白表达的药物作为成纤维化疾病治疗药物进行开发。
美国专利US 4,066,686和US 4,177,290将属于本发明的二苯基甲基亚磺酰基乙酰胺衍生物(benzhydryl sulfinyl acetamide derivatives)作为治疗中枢神经系统障碍药物提出，该化合物由法国拉菲(Lafon)公司开发成发作性睡病治疗药物，并以为“莫达非尼(modafinil)”作为药物通用名称进行销售。作为所述莫达非尼前驱的阿屈非尼(adrafinil)即二苯甲基硫代乙酰氧肟酸(diphenylmethyl-thioacetohydroxamic acid)也开发成与莫达非尼具有同样效果的药物(CNS Drug Reviews Vol5,No.3 193-212,1999)。
拉菲公司在US 4,927,855中公开表示作为莫达非尼R-异构体的(-)-二苯基甲基亚磺酰基乙酰胺[(-)-benzhydryl sulfinyl acetamide]对抑郁症(anti-depressant)、嗜睡症(hypersomnia)和老年痴呆具有治疗效果，US6,180,678中曾经报告R-莫达非尼通过法国的威隆公司具有老化狗的行动问题治疗、增进学习效果、调节膀胱、增加记忆等效果，US9,637,447中介绍称为拉弗米胺(lauflumide)的2-[双(4-氟苯基)甲亚磺酰]乙酰胺对注意缺陷多动障碍(ADHD)、发作性睡病、癫痫、嗜睡症具有效果。
外，本发明人在韩国专利KR10-1345860和KR10-1414831及与此对应的美国专利US9,259,412中提出，莫达非尼及其衍生物可以增加cAMP缓解血管，抑制KCa3,1电流，而可作为血管疾病和KCa3.1通道介质疾病即癌症、自身免疫性疾病等治疗药物使用。
【在先技术文献】
【专利文献】
美国专利US 4,066,686；
美国专利US 4,177,290；
美国专利US 4,927,855；
美国专利US 6,180,678；
美国专利US 9,637,447；
美国专利US 9,259,412。
【发明内容】
【技术问题】
本发明人在研究含有二苯基甲基亚磺酰基乙酰胺衍生物的二苯甲基硫代乙酰胺化合物药物学活性的过程中发现，这些化合物可以惊异地抑制KCa2.3通道的细胞膜表达，进一步发现对小鼠模型的纤维化疾病具有治疗效果。
因此本发明的目的在于，提供将二苯甲基硫代乙酰胺化合物或其药学上允许的盐作为有效成分含有的新型纤维化疾病的治疗用组合物。作为参与，本发明的“二苯甲基硫代乙酰胺化合物”是在概念上含有二苯基甲基亚磺酰基乙酰胺化合物。
【技术方案】
本发明的纤维化疾病治疗用组合物的特征在于，将用以下化学式A表示的二苯甲基硫代乙酰胺化合物或者其药学上允许的盐作为有效成分包含。
[化学式A]
Figure BDA0002970425000000041
[所述化学式A中，X1～X10是氢(H)或者氟(F)，皆可相同或不同；Y是硫磺或亚砜(S＝O)，*指手性体，R1指氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、羟基、碳3至6的碳化合物中的某一个。]
其特征是，所述化学式A化合物是，X1～X10为氢(H)或氟(F)，Y是硫磺(S)，R1是氢(H)。
其特征是，所述化学式A化合物是，X1～X10为氢(H)或氟(F)，Y是亚砜(S＝O)，R1是氢(H)。
其特征是，所述化学式A化合物对细胞膜中KCa2.3通道蛋白质表达具有抑制效果。
其特征是，所述化学式A对肝纤维化及肺纤维化具有治疗效果。
【有益效果】
本发明的二苯甲基硫代乙酰胺化合物是，其有益效果在于，在以培养细胞为对象的体外试验中确认，对KCa2.3通道蛋白质表达具有抑制效果，进一步，在引发肝和肺疾病的小鼠模型的体内试验中也确认到，具有抑制炎症和纤维化以及改善肝功能的效果；
因此本发明的二苯甲基硫代乙酰胺化合物可以作为药学组合物，有效用于人体内发生的各种炎症和纤维化疾病，尤其肝和肺的炎症及纤维化疾病的治疗，也可以按需作为动物用药品进行开发。
【附图说明】
图1a至图1c是显示PDGF、TGFβ、以及本发明的化学式A1化合物对血管内皮细胞、成纤维细胞、肝星状细胞中KCa2.3和KCa3.1通道表达产生的效果；
图2a和图2b是显示在引发KCa2.3通道表达增加及纤维化的TGFβ中暴露的成纤维细胞中化学式A1化合物对纤维化标志物表达(图2a)和细胞增殖产生的效果(图2b)；
图3是显示本发明的化学式A1至A9化合物对肝星状细胞中KCa2.3通道表达产生的效果；
图4是显示在本发明的化学式A2至A4、A9化合物中暴露24小时而减少KCa2.3通道表达的肝星状细胞中KCa2.3电流的记录；
图5是显示引发纤维化的TGFβ或PDGF中暴露24小时的成纤维细胞中本发明的化学式A2至A5、A8、A9化合物对细胞增殖产生的效果；
图6a至图6d是以组织学或免疫组织化学方法显示TAA引发的肝病小鼠模型中，本发明的化学式A1化合物及其异构体对炎症及纤维化的抑制效果；
图7a和图7b是显示TAA(图7a)或西方饲料(图7a)引发的肝病小鼠模型中，根据是否使用本发明的化学式A1至A5化合物发生的肝功能检查结果；
图8a和图8b是显示TAA引发的肝病小鼠模型中，使用本发明的化学式A1、A2至A5化合物而发生的诱发炎症细胞因子的mRNA表达变化；图8c是显示西方饲料(WD)引发的肝病小鼠模型中，使用化学式A1化合物而发生的诱发炎症细胞因子的mRNA表达变化；
图9是显示TAA引发的肝病小鼠模型中，根据是否使用了化学式A1化合物而发生的纤维化标志物的mRNA表达变化；
图10a和图10b是显示TAA引发的肝病小鼠模型中，化学式A化合物的R-异构体和S-异构体对炎症标志物(图10a)和纤维化标志物(图10b)蛋白质表达产生的影响；
图11是显示TAA引发的肝病小鼠模型中，化学式A1化合物的R-异构体和S-异构体对KCa2.3通道蛋白质表达产生的影响；
图12是显示博来霉素(bleomycin)引发的肺纤维化小鼠模型中，化学式A9化合物对肺炎症及纤维化产生的效果；
图13a和图13b是显示博来霉素引发的肺纤维化小鼠模型中，化学式A9化合物对炎症标志物(图13a)和纤维化标志物(图13b)蛋白质表达产生的影响。
【具体实施方式】
本发明的所述化学式A的二苯甲基硫代乙酰胺化合物具体地包括以下化学式A1至化学式A9化合物。
【化学式A1】
Figure BDA0002970425000000061
所述化学式A1化合物公开的通用名称为“莫达非尼(modafinil)”，目前当作发作性睡病治疗药物使用，用于其它精神和疾病治疗的临床试验正在进行当中。所述莫达非尼的化学名为2-(二苯基甲基亚磺酰基)乙酰胺，可以用公知的方法合成或者购买已商用化的商品使用。
Figure BDA0002970425000000062
Figure BDA0002970425000000071
所述化学式A2至化学式A9化合物皆根据与所述莫达非尼相同的机理，对细胞膜中KCa2.3通道蛋白质表达具有抑制效果，进一步对人体纤维化疾病具有治疗效果。据悉，其中所述A9化合物的通用名称为拉弗米胺(lauflumide)。
所述化学式A1～A9化合物的化学名如下。各化学名末尾的括弧内记载的编码名是本发明人在下述实施例中使用的编码名。
1)化学式A1；2-(二苯基甲基亚磺酰基)乙酰胺(CBM-N1)
2)化学式A2；2-(二苯甲基硫基)-N-[(四氢呋喃-2-yl)甲基]乙酰胺(CBM-N2)
3)化学式A3；2-(二苯甲基硫基)-N-苯乙酰胺(CBM-N3)
4)化学式A4；2-(二苯基甲基亚磺酰基)-N-甲基乙酰胺(CBM-N4)
5)化学式A5；2-(二苯基甲基亚磺酰基)-N-[(四氢呋喃-2-yl)甲基]乙酰胺(CBM-N5)
6)化学式A6；2-(二苯甲基硫基)-N-甲基乙酰胺(CBM-N6)
7)化学式A7；2-[双(2-氟苯基)甲亚磺酰]乙酰胺(CBM-N7)
8)化学式A8；2-[双(3-氟苯基)甲亚磺酰]乙酰胺(CBM-N8)
9)化学式A9；2-[双(4-氟苯基)甲亚磺酰]乙酰胺(CBM-N9)
所述化学式A2至A6化合物是可以采用韩国专利KR10-1345860等中公开的方法合成或者购买已商用化产品使用，但对于所述化学式A7至A9化合物尚未出现有效的制造方法。因此本发明在下述实施例中记载了所述化学式A7至A9化合物的制造方法。
本发明的药学组合物包括所述化学式A化合物的药学上可接受的盐。在此“药学上可接受的盐”通常可以包括金属盐、有机碱盐、无机酸盐、有机酸盐、碱性或酸性氨基酸盐等。而且本发明的药学组合物将所述化学式A化合物的溶剂化物及水合物全部包含，尽可能包含所有立体异构体，进一步可以包含各化合物的晶体形态或非晶体形态。
本发明的药学组合物是根据常规方法可以制成片剂、丸剂、散剂、颗粒、胶囊、悬浮剂、内服液剂、油剂、糖浆、气雾剂、灭菌注射溶液等形态。根据使用目的，可以口服给药或者非口服给药，若非口服给药，则可以选择皮外或腹腔内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉注射、肌肉内注射或胸部内注射注入方式。
本发明的药学组合物的给药量是根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排泄率及疾病的重症度存在差异。优选的一日给药量是以有效成分为准0.2至20mg/kg，更优选的是0.5至10mg/kg，可以一日给药一次至两次，但不限于此。
【实施例】
1)化合物的合成
1-1)化学式A9化合物的合成
下面参照下述反应式阐述化学式A9化合物(lauflumide)的合成方法。在500ml的圆形烧瓶内倒入24g的4，4’-双氟苯甲醇(I)，在此添加150ml的三氟乙酸溶解后，添加12.05g的巯基乙酸(Thigolic acid)，再搅拌两小时左右后用薄层色谱图查看反应终结。将反应物减压蒸馏，去除三氟乙酸并中和后，用乙酸乙酯有机溶剂提取，用硫酸镁干燥后取得定量收率34.8g的黏稠的黄色油状化合物(II)。
取所述化合物(II)34.8g，在250ml无水乙醇中溶解后，加上4.2g深硫酸后回流8小时。然后室温下冷却、浓缩，去除乙醇，用二氯甲烷溶剂溶解后，用水洗涤两次。然后再用5％的NaHCO3溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥后取得定量收率39.1g的黄色油状化合物(III)。
将所述化合物(III)34.3g放入圆形烧瓶(500ml)内，添加210ml的甲醇后，加入酸催化剂21.4ml(酸催化剂是将4g硫酸在90ml异丙醇中溶解制成)，添加35％H2O2溶液后，室温下搅拌一夜。然后加70g氯化物(NaCl)，用二氯甲烷溶液提取3次，再用无水硫酸镁干燥后浓缩取得定量收率的化合物(IV)。
将所述化合物(IV)5.1g与甲醇13ml一起放入圆形烧瓶(100ml)内，加氯化铵(NH4Cl)1.3g以后，添加98ml的深氢氧化铵溶液(NH4OH)搅拌一夜后，过滤白色乳液状的溶液而取得4g固体粉末。将所述4g固体粉末在28g异丙醇中溶解、回流后，室温下冷却而取得白色晶体状化学式A9化合物即2-[双(4-氟苯基)甲亚磺酰]乙酰胺2.1g。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.68(bs，1H)；7.56–7.51(m，4H)，7.33(bs，1H)，7.29–7.24(m，4H)，5.4(s，1H)；3.4(d,J＝13.6Hz，1H)；3.16(d，J＝13.6Hz，1H)
Figure BDA0002970425000000091
1-2)化学式A8化合物的合成
以公知的方法合成了3，3’双氟苯甲醇(3,3‘-bisfluoro benzhydrol)[Tetrahedron Lett(四面体快报)，vol 58，442，2017，EP 1，433，744，J.Med.Chem.vol 40，851，1997]。将该化合物用作起始原料，采用所述化学式A9化合物的合成方法合成了化学式A8化合物即2-[双(3-氟苯基)甲亚磺酰]乙酰胺。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.68(bs,1H)；7.5–7.2(m，9H)，5.4(s，1H)；3.4(d，1H)；3.16(d，Hz，1H)
1-3)化学式A7化合物的合成
以公知的方法合成了2，2’双氟苯甲醇(2,2’-bisfluoro benzhydrol)(EP 1,661,930,J.Med.Chem.vol 51,#4,976,2008)。将该化合物用作起始原料，采用所述化学式A9化合物的合成方法合成了化学式A7化合物即2-[双(2-氟苯基)甲亚磺酰]乙酰胺。
1H NMR(DMSO-d6):δ7.68(bs,1H)；7.5–7.2(m,9H),7.33(bs,1H),5.4(s,1H)；3.4(d,1H)；3.16(d,1H)
2)实验方法
2-1)培养细胞
成纤维细胞[CRL-2795；American Type Culture Collection(美国典型菌种保藏中心),VA]是在杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，Hyclone,Logan,UT)中培养，人子宫血管内皮细胞(human uterine microvascularendothelial cells；PromoCell GmbH,Heidelberg,Germany)是在MV2培养基(PromoCellGmbH)中培养，人肝星状细胞(human hepatic stellate cells；Innoprot,Bizkia,Spain)是在P60126培养基(Innoprot)中各自培养。
所有细胞是在5％二氧化碳湿式条件下保持在37℃。将如此培养的细胞分别在PDGF、TGFβ、本发明的化学式A1至A9化合物(CBM-N1～N9)中暴露24小时后进行实验。
2-2)肝病小鼠模型的建立
确认本发明的化学式A1至A5化合物(CBM-N1～N5)对肝炎及纤维化产生的治疗效果，对C57BL/6自然小鼠(购自东方生物)进行以下实验。首先，为了在小鼠身上诱发肝病，注射硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)(A实验)或者用诱发脂肪肝病的西方饲料进行饲养(B实验)。所述小鼠分正常对照组、疾病诱发组、给药组，对于这些三组，A实验中分别使用了15～100只小鼠，B实验中分别使用10只小鼠。对各组小鼠的药物处理方式如下。
(1)正常对照组：所述A实验的正常对照组是将疾病诱发组注射TAA时使用的TAA溶剂以同样的量一周三次注射至腹腔内，所述B实验的正常对照组是用正常饲料饲养。A实验和B实验均使用口管将CBM-N1溶剂以与注射CBM-N1时同样的量一周注射五次。所述TAA溶剂为蒸馏水，CBM-N1和其衍生物的溶剂是将DBSO和蒸馏水以1：1比率混合而成。附图中C或Control指正常对照组。
(2)疾病诱发组：所述A实验的疾病诱发组是将TAA一周三次在腹腔内每次注射100mg/kg，所述B实验的疾病诱发组是用西方饲料[western diet(西方饮食鼠粮)、WD、45％饱和脂肪、0.2％胆固醇、含果糖和葡萄糖的水]进行饲养。A实验和B实验均使用口管将CBM-N1溶剂以注射CBM-N1时同样的量一周注射五次。附图中TAA指使用TAA的疾病诱发组，WD指使用西方饲料的疾病诱发组。
(3)给药组：所述A实验中，除了TAA(100mg/kg，三次/周)之外注射所述化学式1～5化合物(50mg/kg/day，五次/周)，所述B实验中除了西方饲料外，注射了CBM-N1～N5(50mg/kg/day，五次/周)。对于用这种方法处理16周的小鼠，注射大量麻醉剂即时致死之后摘取了肝和血液。附图中TAA+CBM-N1、TAA+CBM-N2、TAA+CBM-N3、TAA+CBM-N4和AA+CBM-N5指分别注射化学式A1至A5化合物的疾病诱发组。
2-3)肺炎及肺纤维化的小鼠模型建立
为确认本发明的化学式A9化合物(CBM-N9)对因博来霉素(bleomycin)引发的肺炎及肺纤维化的治疗效果，对C57BL/6自然小鼠进行了以下实验。首先，将所述小鼠分为正常对照组、疾病诱发组、给药组，对这些三组每组分别使用10只小鼠。对各组小鼠的药物处理方法如下。
(1)正常对照组：将与疾病诱发组注射所述博来霉素时同样的量的蒸馏水注射到呼吸道。CBM-N9溶剂是以下述疾病诱发组中注射CBM-N9时同样的量一周五次注射至腹腔内。
(2)疾病诱发组：将1.5单位博来霉素注射至呼吸道内。CBM-N9溶剂是以注射CBM-N9时同样的量一周五次注射至腹腔内。
(3)给药组：将1.5单位博来霉素注射到呼吸道内。将CBM-N9(50mg/kg)一周五次注射至腹腔内。
将以如上所述的方法用药物处理四周时间的小鼠注射大量麻醉剂即时致死后摘取肺。
2-4)肝和肺组织的石蜡组织标本制作及形态学变化的观察
为了从组织学角度确认小鼠模型中各化学式A1化合物(CBM-N1)或化学式A9化合物(CBM-N9)的治疗效果，制作了石蜡组织标本。将肝和肺组织用多聚甲醛溶液固定后，切割成1至2mm的厚度。将切割组织在石蜡中包埋(embedding)后，切割成4μm厚度，用二甲苯脱去石蜡后，用乙醇去除二甲苯，然后用自来水洗涤。对如此处理的组织实施苏木精和伊红染色，或者进行免疫组织化学染色(immunohistochemistry)。
(1)苏木精-伊红染色：用哈里斯(Harris)苏木精染色溶液处理五分钟，先染色(蓝色)核之后，用伊红溶液实施对照染色(粉红色)。
(2)对炎症标志物的免疫组织化学染色：使用特异抗体染色炎症标志物(CD82，CD45)，淋巴样细胞((lymphoid cell)染色成褐色。
(3)对纤维化标志物的免疫组织化学染色：采用马森三色(Masson's trichrome)染色法染色胶原蛋白，或者采用网织蛋白染色法染色网状纤维。
2-5)肝功能检查
使用从肝病小鼠模型中提取的血液测量天门冬氨酸氨基转移酶(AST，GOT)和丙氨酸氨基转移酶(ALT，GPT)、总胆红素、白蛋白浓度。肝功能检查方法如下表1。
【表1】肝功能检查方法
Figure BDA0002970425000000111
Figure BDA0002970425000000121
2-6)实时聚合酶链反应(Real time PCR)分析
从摘取的肝组织中通过实时聚合酶链反应测定炎症或纤维化因子的mRNA表达程度。将所述肝组织的RNA用TRIzol试剂(Molecular Research Center,Cincinnati,OH)分离后，使用BcaBEST聚合酶(TakaraShuzo)合成单链cDNA，然后进行聚合酶链反应。
此时使用的引发炎症细胞因子及纤维化标志物的引物序列(序列号1至30)是如下表2至表4所示。
【表2】KCa2.3通道引物序列
Figure BDA0002970425000000122
【表3】引发炎症细胞因子的引物序列
Figure BDA0002970425000000123
Figure BDA0002970425000000131
【表4】纤维化标志物的引物序列
Figure BDA0002970425000000132
2-7)蛋白质免疫印迹分析
用蛋白质提取缓冲液溶解细胞，通过考马斯亮蓝法(Bradford)决定上清液中蛋白质浓度后，将蛋白质30μg加到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，移到硝酸纤维素膜。将所述硝酸纤维素膜用含有5％BSA的TBST(10mM Tris-HCl,150mM NaCl,and0.1％(v/v)Tween-20,pH 7.6)在室温下阻断一小时。印迹是与一抗孵育一夜时间后，与辣根过氧化物酶结合物二抗孵育一小时。带是通过化学发光实现视觉化。数据收集与处理是使用发光图像分析仪(Image analyzer LAS-3000)和IMAGE GAUSE软件(Fuji film，Japan)实施。
2-8)MTT细胞增殖试验法
将细胞在96孔板上撒2×104个/孔程度后，在促进细胞增殖的TGFβ中暴露24小时。然后在各孔中添加MTT0.1mg以后，37℃温度下暴露四个小时。然后去除培养液，用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)分解细胞，然后使用测定仪在590nm中测定吸光度。
2-9)电生理学分析
在分离培养的单一细胞中用膜片钳技术(pach-clamp technique)测量了全细胞电流(whole cell current)。全细胞电压钳(whole-cell voltage clamp)细胞中将通过微玻璃电极施加100mV至+100mV的电压斜波(voltage ramp)而发生的电流用放大器(EPC-10,HEKA,Lambrecht,Germany)放大后，按以下1至4kHz的标本提取率进行记录。
标准外用液包括150mM NaCl、6mM KCl、1.5mM CaCl2、1mM MgCl2,、10mM HEPES、10mM葡萄糖、pH7.4(用NaOH滴定)，微玻璃电极(pipette)溶液包括40mM KCl、100mM K-aspartate、2mM MgCl2、0.1mM EGTA、4mM Na2ATP、10mM HEPES、pH7.2(用KOH滴定)。Pipette溶液中自由Ca2+浓度是5mM EGTA存在的条件下添加适量Ca2+调节成1μM(用CaBuf计算；G.Droogmans,Leuven,Belgium)。
KCa2.3电流是按以下方法分离。全细胞电压钳的细胞中通过玻璃电极注入1μM Ca2 +，加激活KCa2.3电流的1-乙基-2-苯并咪唑啉酮(1-ethyl-2-benzimidazolinone；1-EBIO，100μM)后记录的电流中，将被KCa2.3通道抑制剂即蜂毒明肽(200mM)抑制的电流判断为KCa2.3
Figure BDA0002970425000000141
电流，将被记录的电流以细胞电容分别实施标准化。
2-10)统计分析
实验结果是以平均值±标准误差(S.E.M)表示。统计分析是用T检验(Student'st-test)进行，将低于显著性水平0.05的判断为具有显著性差异。
3)使用培养细胞的实验结果
为了阐明本发明的化学式A1至A9化合物(CBM-N1～N9)在体外对KCa2.3通道表达产生的影响，并查明是否抑制纤维化而进行了本实验。
3-1)影响KCa2.1和KCa3.1通道的生长因子和CBM-N1的效果
附图1a是显示血管内皮细胞中PDGF、TGFβ、CBM-N1分别对KCa2.3通道或者KCa3.1通道表达产生的影响。将血管内皮细胞在PDGF(20ng/ml)或者TGFβ(5ng/ml)中暴露24小时以后，KCa2.3通道mRNA(左片)和蛋白质(中间片)的表达增加。反之KCa3.1通道的表达是通过PDGF处理没有增加(右片)。对于用PDGF使KCa2.3通道蛋白质的表达增加的细胞处理24小时的CBM-N1时，KCa2.3通道蛋白质表达显著减少(中间片)。
附图1b是显示成纤维细胞(左片)或肝星状细胞(右片)中CBM-N1对KCa2.3通道蛋白质表达产生的效果。试验结果，通过CBM-N1的处理，稳定状态的KCa2.3通道表达水平在成纤维细胞中减少，在肝星状细胞中依浓度减少。
附图1c是显示肝星状细胞中通过CBM-N1的KCa2.3通道表达抑制对KCa2.3通道电流产生的影响。对CBM-N1中暴露24小时的细胞和未暴露的细胞之间KCa2.3电流大小进行比较。KCa2.3电流大小在CBM-N1中未暴露的细胞中显示为18.98±4.17pA/pF，在未暴露细胞中显示为7.77±2.65mV/pF。就是说，因通过CBM-N1抑制KCa2.3通道表达而KCa2.3电流显著减少。如上所述，因CBM-N1而KCa2.3通道蛋白质的表达减少的细胞中KCa2.3电流减少是表示，因CBM-N1而该通道蛋白质的细胞膜表达减少。
3-2)CBM-N1的纤维化抑制效果
附图2是显示CBM-N1对成纤维细胞中因TGFβ而引发的纤维化的抑制效果。因TGFβ而引发的纤维化效果是判断成纤维化标志物的蛋白质表达程度(图2a)和细胞增殖引发效果(图2b)。将成纤维细胞在TGFβ(5ng/ml)中暴露24小以后，纤维化标志物即α-smooth muscleactin(α-SMA：α-平滑肌肉肌动蛋白)、collagen 1α(Col1α：胶原蛋白1α)、collagen 3α(Col3α：胶原蛋白3α)蛋白质的量增加，细胞被促进增殖。但将所述成纤维细胞在TGFβ+CBM-N1中暴露24小时，纤维化标志物的表达程度减少，细胞增殖被缓解。该结果表明，CBM-N1可以抑制因纤维化诱发引子而发生的纤维化。
3-3)CBM-N1至CBM-N9对KCa2.3通道表达和细胞增殖产生的效果
附图3是显示肝星状细胞中CBM-N1衍生物对KCa2.3通道蛋白质表达产生的影响。具体是，将所述细胞在CBM-N2、CBM-N5、CBM-N8和CBM-N9中暴露24小时的结果，KCa2.3通道的表达显著减少。
附图4是肝星状细胞中通过CBM-N2至CBM-N4、CBM-N9抑制KCa2.3通道表达对KCa2.3电流产生的效果。对于在所述化合物中分别暴露24小时抑制KCa2.3通道表达的细胞和未暴露在所述化合物中的细胞之间的KCa2.3电流大小进行比较的结果，在暴露于CBM-N2至CBM-N4、CBM-N9而KCa2.3通道表达减少的细胞中KCa2.3电流大小显著减少。
附图5是显示成纤维细胞中对于因TGFβ或PDGF而细胞增殖产生的CBM-N2至CBM-N5、CBM-N8、CBM-N9的效果。将所述细胞在诱发因子即TGFβ(5ng/ml)或PDGF20ng/ml)中暴露24小时以后，成纤维细胞的增殖大幅增加，这些细胞增殖因CBM-N2至CBM-N5、CBM-N8、CBM-N9而大幅减少。
4)对肝病小鼠模型的实验结果
为查明肝病小鼠模型中本发明的化学式A1至A5化合物(CBM-N1至CBM-N5)的治疗效果而进行了本实验。
4-1)组织学或免疫组织化学分析
附图6a是显示所述肝组织的苏木精-伊红染色结果，将上片中用虚线表示的部分放大显示在下片。疾病诱发组(TAA)是，因TAA而以中心静脉为中心的邻近部位发生炎症，而且是众多聚集于中心静脉附近的核较大的炎症细胞而得以确认(图6a的箭头)。尤其与正常对照组(Control)相比，疾病诱发组中炎症细胞大幅增加，在给药组(TAA+CBM-N1)中与疾病诱发组相比，炎症细胞的数量大幅减少。
附图6b是显示所述肝组织的炎症标志物即CD82的染色结果，观察到正常对照组(Control)的肝组织中不存在被染色成褐色的细胞，因此确认无淋巴样细胞((lymphoidcell)。反之，TAA引发的疾病诱发组(TAA)的肝组织中发现众多在中心静脉和中心静脉之间染色成褐色的细胞。反之，将TAA和CBM-N1 R-异构体或S-异构体一起使用的给药组的肝组织(TAA+CBM-N1(R)或者TAA+CBM-N1(S)中能微微地观察到染色成褐色的细胞。
附图6c是显示对所述肝组织的胶原蛋白纤维的马森三色染色结果，胶原蛋白被染色成蓝色。正常对照组(Control)的肝组织是未进行纤维化的健康状态，但疾病诱发组(TAA)的肝组织是中心静脉周边和中心静脉以及中心静脉之间被染色成蓝色(箭头部分)而观察到发生纤维化。但将TAA和CBM-N1 R-异构体或S-异构体一起使用的给药组(TAA+CBM-N1(R)、TAA+CBM-N1(S))的肝组织是在中心静脉附近能微微地观察到纤维化。
附图6d是显示所述肝组织的网状(Reticulin)纤维的染色结果，网状纤维被染色成黑色。正常对照组(Control)的肝组织中没有观察到网状纤维，反之，疾病诱发组(TAA)的肝组织是在中心静脉周边以及中心静脉和中心静脉之间可以观察到网状纤维(箭头部分)。将TAA和CBM-N1 R-异构体或S-异构体一起使用的给药组的肝组织(TAA+CBM-N1(R)或(TAA+CBM-N1(S))中仅在中心静脉附近能微微地观察到网状纤维。
4-2)通过血液ALT、AST分析的肝功能检查
附图7a是对正常对照组、TAA引发的疾病诱发组以及用CBM-N1至CBM-N5处理的给药组进行的肝功能检查结果。正常对照组(Control)、疾病诱发组(TAA)、给药组(TAA+CBM-N1、TAA+CBM-N2、TAA+CBM-N3、TAA+CBM-N4、TAA+CBM-N5)中ALT分别为41.6±7.9units/L、209.0±42.4units/L、70.3±14.7units/L、113.4±7.9units/L、103.0±6.9units/L、114.1±8.8units/L、106.4±12.8units/L，AST血液中水平分别显示为60.4±7.5units/L、211.1±22.4units/L、62.7±11.6units/L、83.6±14.8units/L、73.4±7.4units/L、66.6±9.4units/L、67.7±10.2units/L。
图7b是显示使用西方饲料的疾病诱发组试验结果，正常对照组(Control)、使用西方饲料的疾病诱发组(WD)、给药组(WD+CBM-N1)中ALT分别显示为38.7±9.7units/L、189.8±37.6units/L、87.2±24.7units/L，AST血液中水平分别显示为47.4±18.2units/L、173.5±31.5units/L、71.4±19.8units/L。
所述试验结果表明，因TAA或西方饲料引发的肝功能低下，可以通过本发明的化学式A1至A5化合物(50mg/kg/day)得到显著性恢复。
4-3)对炎症标志物的mRNA检查
附图8显示正常对照组、疾病诱发组、给药组中炎症诱发细胞因子mRNA表达进行比较的结果。炎症标志物是使用出现炎症时增加的TNFα(tumor necrosis factor alpha：肿瘤坏死因子-α)、CCL2(chemoattractant protein-1：趋化蛋白-1)、IL12(interleukin-12：白介素-12)、TGF(transforming growth factor：转化生长因子)、IL1α、IL6、MIP-2(macrophage inflammatory protein-2：巨噬细胞炎症蛋白-2)。炎症因子mRNA水平在疾病诱发组(TAA)中与正常对照组(Control)相比增加，在CBM-N1使用组(TAA+CBM-N1)与疾病诱发组(TAA)相比减少(图8a)。
CBM-N2至CBM-N5使用组(TAA+CBM-N2、TAA+CBM-N3、TAA+CBM-N4、TAA+CBM-N5)中也与疾病诱发组相比减少(图8b)。因此本发明的化学式A1至化学式A5化合物可以减少诱发炎症细胞因子的表达，进而对TAA引发的炎症性肝病具有治疗效果。
图8c是对正常对照组(Control)、使用西方饲料的疾病诱发组(WD)、给药组(WD+CBM-N1)的诱发炎症细胞因子mRNA表达进行比较的结果。作为诱发炎症细胞因子对CCL2、IL6、IL1α进行测定。所述炎症因子mRNA表达水平在疾病诱发组中与正常对照组相比增加，在给药组中与疾病诱发组相比减少。
4-4)对纤维化标志物的mRNA检查
附图9显示对正常对照组、疾病诱发组、给药组的纤维化标志物mRNA表达水平进行比较的结果。纤维化标志物是使用Col1α、Col3α、Col4α、α-SMA、TGFR2(transforminggrowth factor receptor 2：转化生长因子受体2)。所述纤维化标志物在疾病诱发组(TAA)中与正常对照组(Control)相比增加，由此表明，炎症导致纤维化的发生。但CBM-N1使用组(TAA+CBM-N1)中可以观察到这种纤维化因子的水平减少。
4-5)对炎症标志物或纤维化标志物蛋白质表达产生的效果
附图10a显示TAA引发的肝病小鼠模型中，CBM-N1的R-异构体和S-异构体对炎症标志物的蛋白质表达产生的影响。在疾病诱发组(TAA)与正常对照组(Control)相比肝组织中TIMP-2和CCR2的蛋白质表达水平大幅增加而显示发生炎症。但，在CBM-N1 R-异构体或S-异构体使用组[TAA+CBM-N1(R)、TAA+CBM-N1(S)]中TIMP-2T和CCR2的蛋白质表达水平减少，由此确认炎症得到抑制。
附图10b显示TAA引发的肝病小鼠模型中，CBM-N1的R-异构体或S-异构体对纤维化标志物的蛋白质表达产生的影响。疾病诱发组(TAA)的肝组织中与正常对照组(Control)相比显示α-SMA和Col1α的蛋白质表达水平大幅增加而发生纤维化。但，CBM-N1 R异构体或S-异构体使用组是α-SMA和Col1α的蛋白质表达水平大幅减少，由此确认纤维化得到抑制。
4-6)对KCa2.3通道蛋白质表达产生的效果
附图11显示TAA引发的肝病小鼠模型中，CBM-N1的R-异构体或S-异构体对KCa2.3通道蛋白质表达产生的效果。在疾病诱发组(TAA)的肝组织与正常对照组(Control)相比，KCa2.3通道蛋白质表达水平大幅增加。但CBM-N1的R-异构体或S-异构体使用组中，KCa2.3通道蛋白质表达水平大幅减少。这种结果表明，TAA引发的肝病与KCa2.3表达增加有关，而CBM-N1的治疗效果则与KCa2.3表达减少有关。
5)对肺病小鼠模型的CBM-N9试验结果
为查明博来霉素引起的肺病小鼠模型中，本发明的化学式A9化合物(CBM-N9)的治疗效果而进行本实验。
5-1)组织学或免疫组织化学分析
附图12显示对肺组织中苏木精-伊红染色、CD45[leukocyte common antigen(白细胞共同抗原)，LCA染色]的免疫组织化学染色(immunohistochemistry)、对胶原蛋白的马森三色(Masson’s trichrome)染色结果。在疾病诱发组(Bleomycin：博来霉素)炎症和纤维化程度比正常对照组增加，在CBM-N9使用组(Bleomycin+CBM-N9)中比疾病诱发组减少。
5-2)对炎症或纤维化标志物蛋白质表达的分析
图13a显示肺病小鼠模型中CBM-N9对炎症标志物蛋白质表达产生的影响。疾病诱发组(Bleomycin：博来霉素)的肺组织与正常对照组(ControL)相比炎症标志物即TIMP-2和CCR2的蛋白质表达水平大幅增加而显示发生炎症。在CBM-N9给药组(Bleomycin+CBM-N9)中TIMP-2和CCR2的蛋白质表达水平大幅减少而确认炎症得到抑制。
图13b显示肺病小鼠模型中，CBM-N9对纤维化标志物蛋白质表达产生的影响。疾病诱发组(Bleomycin：博来霉素)的肺组织与正常对照组(Control)相比纤维化标志物即α-SMA和Col1α的蛋白质表达水平大幅增加而显示发生纤维化。反之给药组(Bleomycin+CBM-N9)中TIMP-2和CCR2的蛋白质表达水平大幅减少而确认纤维化得到抑制。
6)评估与结论
如上所述，本发明的化学式A1至A9化合物是在以培养细胞为对象的体外实验中显示，将所述化合物长时间(24小时或16周)使用时，KCa2.3通道蛋白质的表达减少而抑制纤维化。具体地，将培养的肝星状细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞在化学式A1至A9化合物中暴露24小时时，可以抑制KCa2.3通道的细胞膜表达，抑制引发纤维化的生长因子引起的纤维化相关因子(α-SMA、Col1α)的表达以及细胞增殖。
而且本发明的化学式A1至A9化合物是在以小鼠模型为对象的体内试验中也观察到，在肝病诱发组可以有效抑制炎症和纤维化。具体地，对于肝病或肺病小鼠模型，利用16周的时间使用所述化学式A1至A9化合物的结果显示，炎症和纤维得到显著抑制。
另一方面，如本发明人在韩国专利KR10-1345860和KR10-1414831及与此对应的美国专利US9,259,412中所提出，本发明的化学式A1至A5化合物具有因cAMP引发KCa3,1通道磷酸化而抑制KCa3.1通道活动度的效果。但认为，如此通过cAMP增加抑制KCa3.1通道的活动度对纤维化的治疗基本无效。
所述专利涉及化学式A1至A5化合物中短时间(几分钟)暴露时显现的效果，因这些化合物而cAMP增加，到20分钟左右达到峰值以后骤减，三小时内达到与给药之前差不多的程度(Endocrinology 144(4):1292–1300)。因此通过cAMP的效果最多只能持续一小时左右的时间，不像本发明可以持续24小时或16周的时间。
如本发明的图1a中所示，在纤维化诱发因子PDGF中暴露24小时时，KCa2.3通道表达大幅增加，反之，KCa3.1通道表达没有增加。这种结果表明，纤维化过程中KCa2.3通道表达增加是非常重要的因素，由此得到结论，本发明的化学式A1至A化合物的纤维化抑制效果是通过KCa2.3通道表达减少而出现的结果。
另一方面，本发明中由于现实条件有限，对属于所述化学式A化合物的所有化合物未能进行如上所述的实验，但是从所述化学式A化合物的化学活性以及体内代谢机制角度考虑，所述化学式A化合物与所述化学式A1至A9化合物均具有同样或类似的药理效应。

Claims (8)

1.一种纤维化疾病治疗用组合物，其特征在于，
将用以下化学式A表示的二苯甲基硫代乙酰胺化合物或者其药学上可接受的盐作为有效成分包括，
[化学式A]
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述化学式A中， X1~X10是氢（H）或者氟（F），皆可相同或不同；Y是硫磺或亚砜（S=O），*指手性体，R1指氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、羟基、碳3至6的碳化合物中的某一个。
2.根据权利要求1所述的纤维化疾病治疗用组合物，其特征在于，
所述化学式A化合物是，X1~X10为氢（H）或氟（F），Y是硫磺（S），R1是氢（H）。
3.根据权利要求1所述的纤维化疾病治疗用组合物，其特征在于，
所述化学式A化合物是，X1~X10为氢（H）或氟（F），Y是亚砜（S=O），R1是氢（H）。
4.根据权利要求1所述的纤维化疾病治疗用组合物，其特征在于，
所述化学式A化合物是，从2-（二苯基甲基亚磺酰基）乙酰胺、2-（二苯甲基硫基）-N-[（四氢呋喃-2-yl）甲基]乙酰胺、2-（二苯甲基硫基）-N-苯乙酰胺、2-（二苯基甲基亚磺酰基）-N-甲基乙酰胺、2-（二苯基甲基亚磺酰基）-N-[（四氢呋喃-2-yl）甲基]乙酰胺、2-（二苯甲基硫基）-N-甲基乙酰胺、2-[双（2-氟苯基）甲亚磺酰]乙酰胺、2-[双（3-氟苯基）甲亚磺酰]乙酰胺、2-[双（4-氟苯基）甲亚磺酰]乙酰胺（CBM-N9）中选择的某一个。
5.根据权利要求1所述的纤维化疾病治疗用组合物，其特征在于，
所述化学式A化合物是2-（二苯基甲基亚磺酰基）乙酰胺。
6.根据权利要求1所述的纤维化疾病治疗用组合物，其特征在于，
所述化学式A化合物是2-[双（4-氟苯基）甲亚磺酰]乙酰胺。
7.根据权利要求1至要求6中某一项所述的纤维化疾病治疗用组合物，其特征在于，
所述化学式A化合物对细胞膜中KCa2.3通道蛋白质表达具有抑制效果。
8.根据权利要求1至6中某一项所述的纤维化疾病治疗用组合物，其特征在于，
所述化学式A对肝纤维化及肺纤维化具有治疗效果。
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