CN113030488A - 一种免疫磁性表面增强拉曼基底检测丝素蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及文物检测领域，本发明公开了一种免疫磁性表面增强拉曼基底检测丝素蛋白的方法，本发明结合表面增强拉曼和抗原抗体的优越性，提供了一种具有表面增强拉曼传感器的优势，又兼具免疫特异性的优点的丝素蛋白检测方法。本发明利用磁珠的顺磁性，合成的材料与反应体系可以更好的分离，便于合成材料的洗涤与纯化。本发明利用了Au的表面增强效果，且在SiO2和Fe3O4的保护作用下非常的稳定。此外由于抗原抗体的特异性结合，本发明有益于排除各项杂质的干扰，提高了结果的准确性。

Description

一种免疫磁性表面增强拉曼基底检测丝素蛋白的方法
技术领域
本发明涉及文物检测领域，尤其涉及一种免疫磁性表面增强拉曼基底检测丝素蛋白的方法，
背景技术
中国纺织品文化由来已久，丝绸之路作为中国对外文化交流的一条重要渠道，在中国发展史上画了浓墨重彩的一笔，出土的丝绸在中国的历史文化研究中也起到至关重要的作用。所以研究各种丝绸的各种表征手段是对中国丝绸文化研究的关键点。
丝绸在长时间的埋藏过程中很难完整保护，由于各种老化机理导致丝绸的表征非常困难，当其结构被破坏时，各种表征结果都将失去他们原有的特征，当发现的墓葬离我们越遥远，能保留下来的丝绸残片就越少，各种干扰就越多，所以低检出限和高特异性就是丝绸研究的关键。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种免疫磁性表面增强拉曼基底检测丝素蛋白的方法，本发明结合表面增强拉曼和抗原抗体的优越性，提供了一种具有表面增强拉曼传感器的优势，又兼具免疫特异性的优点的丝素蛋白检测方法。
本发明的具体技术方案为：
一种免疫磁性表面增强拉曼基底检测丝素蛋白的方法，包括以下步骤：
1）称取5-6g FeCl3·6H2O和2-4gFeSO4·7H2O溶解在蒸馏水中，将溶液倒入容器中，在充氮气的条件下搅拌至溶解；加入3-5gNaOH，70-90℃水浴持续搅拌0.5-1.5h制得Fe3O4磁性纳米颗粒。
2）称取200 mg Fe3O4于容器中，加入15-20mL浓硝酸，超声10-30 min，随后水洗，加入15-25 mL无水乙醇，35-45mL去离子水及 3-5 mL氨水超声10-30min后取出，搅拌下缓慢滴加3-4mL TEOS， 持续搅拌3-5h，随后乙醇洗，水洗，转移到比色皿中， 55-65℃条件下真空干燥1-3h得到Fe3O4@SiO2纳米颗粒。
3）取150-200 mL去离子水于容器中，加入8-12 mL 1.5-2.5%HAuCl4，在400-800r/min，120-140℃条件下搅拌20-30 min，随后加入8-12 mL、40-60mg/mL柠檬酸钠水溶液，在120-140℃条件下继续搅拌 20min，然后停止加热，继续搅拌至Au 溶胶为室温。
4）量取30-50 mg Fe3O4@SiO2于容器内，倒入50-100mL无水乙醇超声清洗 1-10min，重复，再水洗，随后加入30-50 mL 2-4%的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，35-45℃摇晃溶液至溶解，搅拌 15-25 min，水洗4-8次，得到 聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的 Fe3O4@SiO2。
5）超声条件下向150-250 mL步骤3）所得 Au 溶胶中迅速加入 聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的 Fe3O4@SiO2，摇晃条件下将含溶液的容器放入摇床内，常温摇晃 20-30min，水洗，得到Fe3O4@SiO2-Au。
6）称量 0.8-1.2gFe3O4@SiO2-Au放入含有 80-120mL无水乙醇的容器中，超声分散，待固体完全分散后加热至60-80℃，缓慢内滴加25-35ml 的APTEs，在N2条件下回流4-8h；反应结束后离心得到固体，用无水乙醇洗涤后真空干燥得（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au。
本发明合成的Fe3O4@SiO2-Au在Fe3O4和SiO2部分均可氨基化，即可以抓取更多的抗体。
7）取450-550mg（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，加入到100mL PBS缓冲液中，超声分散；加入180-220mL、20-30%的戊二醛溶液，在30-40℃的振荡水浴锅中振荡反应2-3小时；磁性分离固液相，用PBS清洗3-5遍，之后将活化所得磁珠分散在40-60mL PBS缓冲液中，得到8-12mg/mL的活化的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au。
磁珠与顺磁场的相互作用使得分离纯化简单，损失少。
8）取25-35mL上述的活化的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，向其中加入含有20-55mg丝素蛋白单克隆抗体的BSA溶液，在30-40℃下振荡反应1-3h。
9）取丝素蛋白溶解在CB溶液中，加入步骤8）中结合抗体的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，在在30-40℃条件下震荡孵育1-3h。
10）混合均匀后滴在硅片上测试拉曼。
作为优选，步骤1）中，2价Fe与3价Fe的摩尔比例为1：1.5-2，反应溶液为100mL。
作为优选，步骤2）中，无水乙醇，去离子水及氨水依次加入。
作为优选，步骤3）中，涡流产生的颜色变化从淡黄色到红宝石色，得到Au 溶胶中纳米金颗粒粒径为15-25nm。
作为优选，步骤4）中，每100mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液包括：85-95mL DI，5-15 mL 1.5-2.5%聚二烯丙基二甲基氯化铵初溶液，85-90 mg,柠檬酸钠，10-15mg NaCl；聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液的用量为30-50mL。
作为优选，步骤7）中，所述PBS缓冲液的pH为7.4，戊二醛溶液浓度为20-25%，水浴温度为35-40℃。
作为优选，步骤8）中，所述CB溶液的pH=9.6，丝素蛋白用量为40-55mg，孵化温度选择为35-40℃，孵化时间为1-3h。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
（1）本发明的氨基化既可以修饰磁性部分，也可以修饰SiO2，故可以接上更多的氨基，可以抓取更多的抗体。
（2）本发明利用磁珠的顺磁性，合成的材料与反应体系可以更好的分离，便于合成材料的洗涤与纯化。
（3）本发明利用了Au的表面增强效果，且在SiO2和Fe3O4的保护作用下非常的稳定。
（4）由于抗原抗体的特异性结合，本发明有益于排除各项杂质的干扰，提高了结果的准确性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1)称取5gFeCl3·6H2O和3gFeSO4·7H2O溶解在蒸馏水中，将溶液倒入250mL三口烧瓶中，在充氮气的条件下搅拌至溶解。加入4gNaOH。80℃水浴持续搅拌1h制得F3O4磁性纳米颗粒。
2)称取200 mg Fe3O4于锥形瓶中，加入18mL浓硝酸，超声20min，随后用去离子水洗3 次，加入20 mL无水乙醇，40mL去离子水及 4 mL氨水超声25min后取出，玻璃棒搅拌下缓慢滴加3.6mL TEOS， 持续搅拌4h，随后用乙醇洗三次，水洗三次，转移到比色皿中， 60℃条件下真空干燥2 h得到Fe 3O4@SiO2纳米颗粒。
3)取180 mL去离子水于 500 mL锥形瓶中，加入10 mL 2%HAuCl4，在 600 r/min，130℃条件下磁力搅拌30min，随后加入10 mL、50mg/mL 柠檬酸钠水溶液，在130℃条件下继续磁力搅拌，待涡流产生的颜色变化从淡黄色到红宝石色后，停止加热，继续搅拌至Au 溶胶为室温。
4)量取40 mg Fe3O4@SiO2于锥形瓶内，倒入80mL无水乙醇超声清洗 5min，重复三次，再用80mL去离子水冲洗3次，随后加入40 mL 3%的 聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液，40℃摇晃溶液至溶解，搅拌 25 min。用去离子水清洗 6 次，得到 PDDA 修饰的 Fe3O4@SiO2。
5)超声条件下向步骤3）中的 Au 溶胶（200 mL）中迅速加入 PDDA 修饰的 Fe3O4@SiO2，摇晃条件下将含溶液的锥形瓶放入摇床内，常温摇晃 25min，磁性分离后去离子水清洗 3 次，得到Fe3O4@SiO2-Au。
6)称量 1gFe3O4@SiO2-Au放入含有 100mL无水乙醇的烧瓶中，超声分散，待固体完全分散后加热烧瓶到70℃，缓慢向烧瓶内滴加30ml 的 APTEs，在 N2 条件下回流6h。反应结束后离心得到固体，用无水乙醇洗涤 5次后放入真空干燥箱干燥得（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au。
7)取500mg（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，加入到100mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（PBS）中，超声分散。加入200mL、23%戊二醛，在37℃的振荡水浴锅中振荡反应2小时。磁性分离固液相，用PBS清洗5遍，之后将活化后的磁珠分散在50mLPBS缓冲液，得到10mg/mL的活化的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au。
8)取30mL（300mg）上述的活化的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，向其中加入含有50mg丝素蛋白单克隆抗体的BSA溶液，在37℃下振荡反应1-3h。
9)取0.1mg/mL, 0.01 mg/mL，0.001mg/mL，0.0001 mg/mL的丝素蛋白溶解在CB溶液中，加入步骤7）中结合抗体的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，在在37℃条件下震荡孵育2h。
10)混合均匀后滴在硅片上测试拉曼。
实施例2
1)称取5gFeCl3·6H2O和3gFeSO4·7H2O溶解在蒸馏水中，将溶液倒入250mL三口烧瓶中，在充氮气的条件下搅拌至溶解。加入4gNaOH。80℃水浴持续搅拌1h制得F3O4磁性纳米颗粒。
2)称取200 mg Fe3O4于锥形瓶中，加入18mL浓硝酸，超声20min，随后用去离子水洗3 次，加入20 mL无水乙醇，40mL去离子水及 4 mL氨水超声25min后取出，玻璃棒搅拌下缓慢滴加3.6mL TEOS， 持续搅拌4h，随后用乙醇洗三次，水洗三次，转移到比色皿中， 60℃条件下真空干燥2 h得到Fe 3O4@SiO2纳米颗粒。
3)取180 mL去离子水于 500 mL锥形瓶中，加入10 mL 2%HAuCl4，在 600 r/min，130℃条件下磁力搅拌30min，随后加入10 mL、50mg/mL 柠檬酸钠水溶液，在130℃条件下继续磁力搅拌，待涡流产生的颜色变化从淡黄色到红宝石色后，停止加热，继续搅拌至Au 溶胶为室温。
4)量取40 mg Fe3O4@SiO2于锥形瓶内，倒入80mL无水乙醇超声清洗 5min，重复三次，再用80mL去离子水冲洗3次，随后加入40 mL 3%的 聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液，40℃摇晃溶液至溶解，搅拌 25 min。用去离子水清洗 6 次，得到 PDDA 修饰的 Fe3O4@SiO2。
5)超声条件下向步骤3）中的 Au 溶胶（200 mL）中迅速加入 PDDA 修饰的 Fe3O4@SiO2，摇晃条件下将含溶液的锥形瓶放入摇床内，常温摇晃 25min，磁性分离后去离子水清洗 3 次，得到Fe3O4@SiO2-Au。
6)称量 1gFe3O4@SiO2-Au放入含有 100mL无水乙醇的烧瓶中，超声分散，待固体完全分散后加热烧瓶到70℃，缓慢向烧瓶内滴加30ml 的 APTEs，在 N2 条件下回流6h。反应结束后离心得到固体，用无水乙醇洗涤 5次后放入真空干燥箱干燥得（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au。
7)取500mg（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，加入到100mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（PBS）中，超声分散。加入200mL、23%戊二醛，在37℃的振荡水浴锅中振荡反应2小时。磁性分离固液相，用PBS清洗5遍，之后将活化后的磁珠分散在50mLPBS缓冲液，得到10mg/mL的活化的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au。
8)取30mL（300mg）上述的活化的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，向其中加入含有50mg丝素蛋白单克隆抗体的BSA溶液，在37℃下振荡反应1-3h。
9)取0.001 -0.0001mg/mL之间五个浓度的丝素蛋白溶解在CB溶液中，加入步骤7）中结合抗体的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，在在37℃条件下震荡孵育2h。
10)混合均匀后滴在硅片上测试拉曼。
实施例3
1)称取5gFeCl3·6H2O和3gFeSO4·7H2O溶解在蒸馏水中，将溶液倒入250mL三口烧瓶中，在充氮气的条件下搅拌至溶解。加入4gNaOH。80℃水浴持续搅拌1h制得F3O4磁性纳米颗粒。
2)称取200 mg Fe3O4于锥形瓶中，加入18mL浓硝酸，超声20min，随后用去离子水洗3 次，加入20 mL无水乙醇，40mL去离子水及 4 mL氨水超声25min后取出，玻璃棒搅拌下缓慢滴加3.6mL TEOS， 持续搅拌4h，随后用乙醇洗三次，水洗三次，转移到比色皿中， 60℃条件下真空干燥2 h得到Fe 3O4@SiO2纳米颗粒。
3)取180 mL去离子水于 500 mL锥形瓶中，加入10 mL 2%HAuCl4，在 600 r/min，130℃条件下磁力搅拌30min，随后加入10 mL、50mg/mL 柠檬酸钠水溶液，在130℃条件下继续磁力搅拌，待涡流产生的颜色变化从淡黄色到红宝石色后，停止加热，继续搅拌至Au 溶胶为室温。
4)量取40 mg Fe3O4@SiO2于锥形瓶内，倒入80mL无水乙醇超声清洗 5min，重复三次，再用80mL去离子水冲洗3次，随后加入40 mL 3%的 聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液，40℃摇晃溶液至溶解，搅拌 25 min。用去离子水清洗 6 次，得到 PDDA 修饰的 Fe3O4@SiO2。
5)超声条件下向步骤3）中的 Au 溶胶（200 mL）中迅速加入 PDDA 修饰的 Fe3O4@SiO2，摇晃条件下将含溶液的锥形瓶放入摇床内，常温摇晃 25min，磁性分离后去离子水清洗 3 次，得到Fe3O4@SiO2-Au。
6)称量 1gFe3O4@SiO2-Au放入含有 100mL无水乙醇的烧瓶中，超声分散，待固体完全分散后加热烧瓶到70℃，缓慢向烧瓶内滴加30ml 的 APTEs，在 N2 条件下回流6h。反应结束后离心得到固体，用无水乙醇洗涤 5次后放入真空干燥箱干燥得（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au。
7)取500mg（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，加入到100mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（PBS）中，超声分散。加入200mL、23%戊二醛，在37℃的振荡水浴锅中振荡反应2-3小时。磁性分离固液相，用PBS清洗5遍，之后将活化后的磁珠分散在50mLPBS缓冲液，得到10mg/mL的活化的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au。
8)取30mL（300mg）上述的活化的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，向其中加入含有50mg丝素蛋白单克隆抗体的BSA溶液，在37℃下振荡反应1-3h。
9)取0.001g的丝素蛋白和0.001g的羊毛角蛋白溶解在CB溶液中，加入步骤7）中结合抗体的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，在在37℃条件下震荡孵育2h。
10)磁性分离洗涤后分散在去离子水中滴在硅片上测试拉曼。
实施例1，2中本发明有较低的检出限，在浓度大于0.003mg/mL时表现出阳性值，实施例3只有丝素蛋白拉曼特征峰说明该发明具有很好的针对性。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (7)

1.一种免疫磁性表面增强拉曼基底检测丝素蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）称取5-6g FeCl3·6H2O和2-4gFeSO4·7H2O溶解在蒸馏水中，将溶液倒入容器中，在充氮气的条件下搅拌至溶解；加入3-5gNaOH，70-90℃水浴持续搅拌0.5-1.5h制得Fe3O4磁性纳米颗粒；
2）称取200 mg Fe3O4于容器中，加入15-20mL浓硝酸，超声10-30 min，随后水洗，加入15-25 mL无水乙醇，35-45mL去离子水及 3-5 mL氨水超声10-30min后取出，搅拌下缓慢滴加3-4mL TEOS， 持续搅拌3-5h，随后乙醇洗，水洗，转移到比色皿中， 55-65℃条件下真空干燥1-3h得到Fe3O4@SiO2纳米颗粒；
3）取150-200 mL去离子水于容器中，加入8-12 mL 1.5-2.5%HAuCl4，在400-800 r/min，120-140℃条件下搅拌20-30 min，随后加入8-12 mL、40-60mg/mL柠檬酸钠水溶液，在120-140℃条件下继续搅拌 20min，然后停止加热，继续搅拌至Au 溶胶为室温；
4）量取30-50 mg Fe3O4@SiO2于容器内，倒入50-100mL无水乙醇超声清洗 1-10min，重复，再水洗，随后加入30-50 mL 2-4%的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，35-45℃摇晃溶液至溶解，搅拌 15-25 min，水洗4-8次，得到 聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的 Fe3O4@SiO2；
5）超声条件下向150-250 mL步骤3）所得 Au 溶胶中迅速加入 聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的 Fe3O4@SiO2，摇晃条件下将含溶液的容器放入摇床内，常温摇晃 20-30min，水洗，得到Fe3O4@SiO2-Au；
6）称量 0.8-1.2gFe3O4@SiO2-Au放入含有 80-120mL无水乙醇的容器中，超声分散，待固体完全分散后加热至60-80℃，缓慢内滴加25-35ml 的APTEs，在N2条件下回流4-8h；反应结束后离心得到固体，用无水乙醇洗涤后真空干燥得（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au；
7）取450-550mg（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，加入到100mL PBS缓冲液中，超声分散；加入180-220mL、20-30%的戊二醛溶液，在30-40℃的振荡水浴锅中振荡反应2-3小时；磁性分离固液相，用PBS清洗3-5遍，之后将活化所得磁珠分散在40-60mL PBS缓冲液中，得到8-12mg/mL的活化的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au；
8）取25-35mL上述的活化的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，向其中加入含有20-55mg丝素蛋白单克隆抗体的BSA溶液，在30-40℃下振荡反应1-3h；
9）取丝素蛋白溶解在CB溶液中，加入步骤8）中结合抗体的（H2N-）Fe3O4@SiO2-Au，在在30-40℃条件下震荡孵育1-3h；
10）混合均匀后滴在硅片上测试拉曼。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中，2价Fe与3价Fe的摩尔比为1：1.5-2，反应溶液为100mL。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中，无水乙醇，去离子水及氨水依次加入。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中，涡流产生的颜色变化从淡黄色到红宝石色，得到Au 溶胶中纳米金颗粒粒径为15-25nm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）中，每100mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液包括：85-95mL DI，5-15 mL 1.5-2.5%聚二烯丙基二甲基氯化铵初溶液，85-90 mg,柠檬酸钠，10-15mg NaCl；聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液的用量为30-50mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤7）中，所述PBS缓冲液的pH为7.4。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤8）中，所述CB溶液的pH=9.6。
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