CN113030290A - 奶粉中维生素k2的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

奶粉中维生素k2的检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种奶粉中维生素K2的检测方法及检测试剂盒，包括以下步骤：样品前处理：取奶粉样品，加入酶和溶剂进行酶解后加入醇溶剂混合，再加入正己烷，离心，取上清液，浓缩，经稀释液稀释，作为待测样品溶液，注入二维切割色谱法进行测定；其中，所述酶为脂肪酶和蛋白酶中的至少一种。本发明的检测方法提取效率高，分析时间短，分离度好，检测限低，定量准确度高的检测方法。

Description

奶粉中维生素K2的检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分析领域，特别是涉及一种奶粉中维生素K2的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
维生素K2的检测方法主要参考《国家卫生和计划生育委员会公告(2016年第8号)》附录3(三)。该方法利用异丙醇直接对试样进行超声提取30min，过0.45μm滤膜后，定容并上高效液相色谱仪测试，利用反相色谱分离法测定试样中维生素K2的含量。但是在实际应用中发现，利用该方法对复杂样品基质中维生素K2进行测定时并不一定适合，因为奶粉中含有大量的脂肪和蛋白质，特别是目标物含量低且干扰因素多的奶粉试样，存在着提取效率低、定性困难、定量不准、干扰大、分析时间长等问题。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种提取效率高，分析时间短，分离度好，检测限低，定量准确度高的检测方法。
具体技术方案如下：
一种奶粉中维生素K2的检测方法，包括以下步骤：
样品前处理：取奶粉样品，加入酶和溶剂进行酶解后加入醇溶剂混合，再加入正己烷，离心，取上清液，浓缩，经稀释液稀释，作为待测样品溶液，注入二维切割色谱法进行测定；
其中，所述酶为脂肪酶和蛋白酶中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述二维切割色谱法的一维流动相为乙腈和异丙醇；所述二维切割色谱法的二维流动相甲醇和叔丁基甲醚。
在其中一些实施例中，所述一维流动相中乙腈和异丙醇的体积比为60～80:20～40；所述二维流动相中甲醇和叔丁基甲醚的体积比为75～95:5～25。
在其中一些实施例中，所述一维流动相中乙腈和异丙醇的体积比为65～75:25～35；所述二维流动相中甲醇和叔丁基甲醚的体积比为80～90:10～20。
在其中一些实施例中，所述二维切割色谱法的一维色谱柱为Agilent Extend-C18柱，二维色谱柱为Inertsil ODS-SP柱。
在其中一些实施例中，所述酶为脂肪酶和蛋白酶。
在其中一些实施例中，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。
在其中一些实施例中，样品前处理中，所述醇溶剂为乙醇。
在其中一些实施例中，所述稀释液为异丙醇。
在其中一些实施例中，所述醇溶剂、溶剂、正己烷的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(1～2)，进一步为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：1，或(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：2。
在其中一些实施例中，所述二维切割色谱法的色谱条件还包括：
柱温：30±3℃；
检测波长：254±3nm；
进样量：10±1μL；
流速：一维色谱为(1.0±0.1)mL/min，二维色谱为(1.0±0.1)mL/min。
在其中一些实施例中，所述样品前处理包括以下步骤：取奶粉样品，加入脂肪酶和木瓜蛋白酶和水混合，进行酶解后于(37±2)℃超声(15±5)min，加入乙醇混合并在(37±2)℃超声(15±5)min，再加入正己烷混合，以(4000±500)rpm的转速冷冻离心，取上清液，惰性气体吹干，经异丙醇稀释，作为待测样品溶液，用二维切割色谱法进行测定。
本发明的另一目的是提供一种检测奶粉中维生素K2的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如下试剂：
(1)酶：脂肪酶和木瓜蛋白酶；
(2)提取液：
提取液1：水；
提取液2：醇溶剂；
提取液3：正己烷；
(3)稀释液：异丙醇；
(4)标准工作液：维生素K2的异丙醇溶液。
在其中一些实施例中，所述检测试剂盒还包括用于二维切割色谱检测的一维流动相和二维流动相；进一步地，所述一维流动相为体积比为60～80:20～40乙腈和异丙醇，所述二维流动相为体积比为75～95:5～25的甲醇和叔丁基甲醚。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过采用特定的样品前处理步骤，即通过加入脂肪酶和蛋白酶有效避免奶粉中脂肪和蛋白对维生素K2的包裹作用，使维生素K2从奶粉中充分游离出来，并通过预先加入醇溶剂，可以有效克服酶解液和正己烷混合后出现的乳化现象并实现良好的分层，最终显著提高了奶粉中维生素K2的提取效率。在此基础上，本发明采用特定二维切割色谱条件对待测样品溶液进行测定，实现了维生素K2很好的定性和定量，具有检测限低、精密度和准确度好的优点。
进一步地，本发明方法采用一维流动相为乙腈和异丙醇、二维流动相甲醇和叔丁基甲醚，尤其是控制一维流动相中乙腈和异丙醇的体积比为(60～80):(20～40)；所述二维流动相中甲醇和叔丁基甲醚的体积比为(75～95):(5～25)，同时控制一维色谱柱为Agilent Extend-C18柱，二维色谱柱为Inertsil ODS-SP柱，在这所有的共同配合下，本发明进一步实现了一维和二维色谱峰出峰时间较早且出峰位置干扰少，基体干扰小，维生素K2与杂质峰完全分离，分离度和峰型好，分离时间短的优异效果。
附图说明
图1为实施例1的标准工作曲线；
图2为实施例1的空白试剂的色谱图；
图3为实施例1的标准物质的色谱图；
图4为实施例1的奶粉样品的色谱图；
图5为实施例2的奶粉样品的色谱图；
图6为一维色谱中流动相为甲醇时标准溶液图谱；
图7为一维色谱中流动相为异丙醇+乙腈(60+40)时标准溶液图谱；
图8为一维色谱中流动相为异丙醇+乙腈(30+70)时标准溶液图谱；
图9为一维色谱中流动相为异丙醇+乙腈(30+70)时阴性加标图谱；
图10为二维色谱中流动相为甲醇+乙腈(60+40)时阴性加标图谱；
图11为二维色谱中流动相为甲醇+叔丁基甲醚(85+15)时阴性加标图谱；
图12为一维色谱中色谱柱为Kromasil C18柱(5μm,250mm×4.6mm)，流动相为异丙醇+乙腈(30+70)时阴性加标图谱；
图13为二维色谱中色谱柱为Agilent Eclipse柱(3.5μm，2.1mm×100mm)，流动相为甲醇+叔丁基甲醚(98+2)时标准物质图谱；
图14为对比例1的标准工作曲线；
图15为对比例1的奶粉样品的色谱图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本实施方式提供一种奶粉中维生素K2的检测方法，包括以下步骤：
样品前处理：取奶粉样品，加入酶和溶剂进行酶解后加入醇溶剂混合，再加入正己烷，离心，取上清液，浓缩，经稀释液稀释，作为待测样品溶液，注入二维切割色谱法进行测定；
其中，所述酶为脂肪酶和蛋白酶中的至少一种。
优选地，所述酶为脂肪酶和蛋白酶，进一步优选所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。
本发明通过采用特定的样品前处理步骤，即通过加入脂肪酶和蛋白酶有效避免奶粉中脂肪和蛋白对维生素K2的包裹作用，使维生素K2从奶粉中充分游离出来。在这个过程中，发明人发现充分酶解后的酶解液与提取液正己烷会发生很严重的乳化现象，导致不能分层，从而不能有效吸取充分提取维生素K2的正己烷提取液。通过加热、静置离心等常规防止乳化的方法均不能去除乳化现象，最后发明人意外发现，在加入正己烷之前，预先加入醇溶剂(尤其是乙醇)，可以有效克服酶解液和正己烷混合后出现的乳化现象并实现良好的分层，最终显著提高了奶粉中维生素K2的提取效率。进一步优选的，所述醇溶剂、溶剂、正己烷的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(1～2)。
本发明所述酶的用量根据奶粉样品中的目标物的含量进行调整。例如，每g奶粉中加入(0.1～1)g脂肪酶和/或(0.02～0.2)g木瓜蛋白酶。进一步地，每g奶粉中加入(1～4)mL溶剂。
在一些优选地实施方式中，本发明的所述二维切割色谱法的一维流动相为乙腈和异丙醇；所述二维切割色谱法的二维流动相甲醇和叔丁基甲醚。进一步优选地，所述一维流动相中乙腈和异丙醇的体积比为60～80:20～40；所述二维流动相中甲醇和叔丁基甲醚的体积比为75～95:5～25。进一步优选所述一维流动相中乙腈和异丙醇的体积比为65～75:25～35，所述二维流动相中甲醇和叔丁基甲醚的体积比为80～90:10～20。并且，本发明所述二维切割色谱法的一维色谱柱为Agilent Extend-C18柱，二维色谱柱为Inertsil ODS-SP柱，在这所有的共同配合下，本发明最终实现了一维和二维色谱峰出峰时间适中且出峰位置干扰少，维生素K2与杂质峰完全分离，峰型好，分离时间短，最终检测时间短，检测效率高的优异效果。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明以下实施例部分所用试剂和标准物质：
脂肪酶：级别：BR；酶活力：>30000U/g；生产商：SIGMA ALDRICH；
木瓜蛋白酶：级别：BR；酶活力：>6000U/g；生产商：国药集团化学试剂有限公司；
无水乙醇：级别：AR；纯度：99.7％；生产商：广东光华科技股份有限公司；
正己烷：级别：AR；纯度：97.0％；生产商：广东光华科技股份有限公司；
异丙醇：级别：AR；纯度：99.7％；生产商：广东光华科技股份有限公司；
维生素K2标准物质：维生素K2(MK7)，CAS：2124-57-4；纯度：99.8％；生产商：USP。
本发明以下实施例部分所用设备及配件：
高效液相色谱仪：型号Agilent 1260infility中心切割二维液相色谱：生产商：安捷伦科技有限公司；
色谱柱：Agilent Extend-C18柱(1.8μm，4.6mm×50mm)、Inertsil ODS-SP柱(5μm，4.6mm×250mm)；
检测器：二极管阵列检测器。
实施例1
(1)前处理：
准确称取两个5g含维生素K2奶粉样品(精确至0.1mg)于两支50mL离心管中，记为①号和②号，同时再准确称取六个5g奶粉样品(精确至0.1mg)于6支50mL离心管，记为③号、④号、⑤号、⑥号、⑦号和⑧号，向③号和④号两支离心管中加入2.5μg维生素K2标准物质，向⑤号和⑥号两支离心管中加入5.0μg维生素K2标准物质，向⑦号和⑧号两支离心管中加入10.0μg维生素K2标准物质；再取一支50mL离心管作为空白，记为⑨号，分别向这九支离心管中加入1g脂肪酶和0.2g木瓜蛋白酶，再加入10mL水，混合均匀后，于(37±2)℃水浴中振荡2h，酶解后于(37±2)℃的温度下超声15min，再加入10mL无水乙醇，混合均匀后，于(37±2)℃的温度下超声15min。再加入10mL正己烷，涡旋振荡5min。于冷冻离心机中4000rpm，离心5min，吸取上层正己烷于100mL圆底烧瓶中。提取液再次加入10mL正己烷，涡旋振荡5min，于冷冻离心机中4000rpm，离心5min，合并两次提取正己烷溶液于100mL圆底烧瓶中。100mL圆底烧瓶中的正己烷溶液用氮气在(40±5)℃的水浴中吹至近干，用异丙醇冲洗瓶壁，并准确转移至10mL棕色容量瓶中，定容至刻度，混匀后过0.45μm有机滤膜于2.0mL棕色进样瓶中，获得九支待测溶液。
采用同样的前处理方法，获得六个平行样品，作为精密度测定溶液，测定结果见下表3。
(2)标准曲线溶液的配置：
准确称取10mg维生素K2标准物质于20mL棕色容量瓶中，用异丙醇溶解并定容至刻度，配成浓度为500μg/mL维生素K2标准储备液(4℃，保存3个月)。
准确吸取1mL维生素K2标准储备液至10mL棕色容量瓶中，用异丙醇定容，配成浓度为50μg/mL维生素K2标准中间溶液。
分别准确吸取适量的维生素K2标准中间溶液，配制成浓度系列为0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL标准工作溶液。
(3)仪器及其条件如表1所示：
表1
Figure BDA0002894128140000071
Figure BDA0002894128140000081
本发明方法通过使用二维切割色谱分离法代替传统色谱分离，选择一维色谱使用Agilent Extend-C18柱(1.8μm，4.6mm×50mm)，二维色谱使用Inertsil ODS-SP柱(5μm，4.6mm×250mm)，一维流动相为乙腈-异丙醇体系，二维流动相为甲醇-叔丁基甲醚，利用两根不同的色谱柱进行分离，在第一维色谱中将目标物从大部分的干扰物质中切割到第二维色谱中继续分离，分析时间由原来30min以上，缩短为15min内，分析时间短。最终实现了在较短时间内使目标物与大部分杂质干扰得到分离，实现了非常好的分离效果。
(4)准确度和精密度
将仪器设备调按照上表1中的条件进行设置，先测定标准溶液，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线(如图1所示)，标准工作曲线的相关系数为0.99984，曲线方程为y＝78.62240x+4.78904，实现了线性范围在0.1μg/mL～5μg/mL，相关系数R>0.999，检出限能达到0.2μg/g，检测限低。然后测试空白溶液，奶粉样品溶液和低中高加标溶液，获得的结果见下表2和表3所示：
表2回收率
Figure BDA0002894128140000082
Figure BDA0002894128140000091
表3精密度
Figure BDA0002894128140000092
从表2可以看出，采用本发明方法测定奶粉中的维生素K2，能够获得很好的准确度，低、中、高加标回收率都很好。通过三水平浓度加标回收试验，得出不同加标浓度回收率均在85％～115％之间。从表3可以看出，采用本发明方法测定奶粉中维生素K2的精密度为3.9％，小于5％，方法稳定性比较好，适合日常检测活动。
空白试剂(空白溶液)的色谱图如图2所示，标准物质溶液色谱图如图3所示，奶粉样品的色谱图如图4所示。通过比对空白试剂、标准对照品、供试品的图谱，证实使用本发明检测方法所得色谱图中，在目标物维生素K2保留时间处，没有其他干扰峰存在，分离效果好。
实施例2
(1)前处理：
准确称取两个5g不含维生素K2奶粉样品(精确至0.1mg)于两支50mL离心管中，记为①号和②号，同时再准确称取六个5g奶粉样品(精确至0.1mg)于6支50mL离心管，记为③号、④号、⑤号、⑥号、⑦号和⑧号，向③号和④号两支离心管中加入2.5μg维生素K2标准物质，向⑤号和⑥号两支离心管中加入5.0μg维生素K2标准物质，向⑦号和⑧号两支离心管中加入10.0μg维生素K2标准物质；再取一支50mL离心管作为空白，记为⑨号，分别向这九支离心管中加入1g脂肪酶和0.2g木瓜蛋白酶，再加入10mL水，混合均匀后，于(37±2)℃水浴中振荡2h，酶解后于(37±2)℃的温度下超声15min，再加入10mL无水乙醇，混合均匀后，于(37±2)℃的温度下超声15min。再加入10mL正己烷，涡旋振荡5min。于冷冻离心机中4000rpm，离心5min，吸取上层正己烷于100mL圆底烧瓶中。提取液再次加入10mL正己烷，涡旋振荡5min，于冷冻离心机中4000rpm，离心5min，合并两次提取正己烷溶液于100mL圆底烧瓶中。100mL圆底烧瓶中的正己烷溶液用氮气在(40±5)℃的水浴中吹至近干，用异丙醇冲洗瓶壁，并准确转移至10mL棕色容量瓶中，定容至刻度，混匀后过0.45μm有机滤膜于2.0mL棕色进样瓶中，获得九支待测溶液。
(2)标准曲线溶液的配置：
准确称取10mg维生素K2标准物质于20mL棕色容量瓶中，用异丙醇溶解并定容至刻度，配成浓度为500μg/mL维生素K2标准储备液(4℃，保存3个月)。
准确吸取1mL维生素K2标准储备液至10mL棕色容量瓶中，用异丙醇定容，配成浓度为50μg/mL维生素K2标准中间溶液。
分别准确吸取适量的维生素K2标准中间溶液，配制成浓度系列为0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL标准工作溶液。
(3)仪器及其条件
表4
Figure BDA0002894128140000101
Figure BDA0002894128140000111
(4)测定
将仪器设备调按照上表中的条件进行设置，先测定标准溶液，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线(同实施例1)。然后测试空白溶液，奶粉样品溶液和低中高加标溶液，获得的结果见下表5：
表5
Figure BDA0002894128140000112
从表5可以看出，采用本发明方法测定不含维生素K2奶粉样品的加标样品溶液，加标量低、中、高的三个梯度回收率分别为94.4％、93.8％、89.8％，回收都很好，能够满足日常检测的准确度要求。
不含维生素K2奶粉试样的色谱图如图5所示，证明在目标物维生素K2保留时间处，没有其他干扰峰存在。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，一维色谱流动相分别为以下(1)～(2)组：
(1)甲醇；
(2)异丙醇：乙腈＝60:40。
组(1)的一维色谱流动相选择较常规在一维色谱流动相中使用的流动相甲醇，结果如图6所示，发现其出峰时间较后不利于提高检测效率，且峰宽较大，在切割到二维时比较容易夹杂较多杂质。
组(2)的一维色谱流动相选择异丙醇和乙腈体积比为60:40，结果如图7所示，出峰时间太前，容易受溶剂峰的干扰，对于杂质较多样品，保留时间太短不利于分离杂质。
而本发明的实施例1选择异丙醇和乙腈体积比为30:70，结果如图8和图9所示；图8中出峰时间适中，从图9阴性加标图谱来看，出峰位置干扰少，最大程度的减少杂质切被割到二维分离系统中，分离效果好。而如果单纯使用异丙醇会发现柱压过高，本发明加入乙腈与异丙醇配合可以改善这一状况。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，二维色谱流动相为：甲醇+乙腈(60+40)(V/V)。
本实施例选择甲醇+乙腈(60+40)作为二维色谱流动相，结果如图10所示，其色谱峰的出峰时间太晚，效率低。而实施例1中的色谱峰甲醇+叔丁基甲醚(85+15)作为二维色谱流动相，结果如图11所示，维生素K2与杂质峰完全分离，且保留时间控制在15min以内。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于，一维色谱柱为Kromasil C18柱(5μm,250mm×4.6mm)。
本实施例选择用其他常规C18色谱柱代替实施例1的Agilent Extend-C18柱，结果如图12所示，发现其对维生素K2的保留作用强，出峰时间靠后，峰宽较大，并且通过调节流动相难以改善其保留。而本发明实施例1选择Agilent Extend-C18柱，如图9所示，一维色谱出峰时间在5min内，附近干扰少，峰形好。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于，二维色谱柱为Agilent Eclipse柱(3.5μm，2.1mm×100mm)，二维色谱流动相为甲醇+叔丁基甲醚(V/V＝98：2)时标准物质图谱。
结果如图13所示，发现其保留时间满足要求，但其峰宽过大。而本发明实施例1选择Inertsil ODS-SP柱，见图11，其二维色谱出峰处无干扰，检测时间短。
对比例1
本对比例与实施例1使用同一批次样品。
(1)前处理：
精确称取适量样品(0.001g)于10mL棕色容量瓶中，加入异丙醇溶解，超声30min，用异丙醇定容到刻度。涡旋振荡2min混匀，过0.45μm滤膜后上机测定。
(2)标准曲线溶液的配置：
准确称取10mg维生素K2标准物质于20mL棕色容量瓶中，用异丙醇溶解并定容至刻度，配成浓度为500μg/mL维生素K2标准储备液(4℃，保存3个月)。
准确吸取1mL维生素K2标准储备液至10mL棕色容量瓶中，用异丙醇定容，配成浓度为50μg/mL维生素K2标准中间溶液。
分别准确吸取适量的维生素K2标准中间溶液，配制成浓度系列为0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL标准工作溶液。
(3)仪器及其条件：
表6
高效液相色谱仪 安捷伦1260
色谱柱 Inertsil ODS-SP柱(5μm，4.6mm×250mm)
柱温/℃ 50
流动相 甲醇
流速/(mL/min) 1.0
检测波长/nm 254
进样量/μL 10
出峰时间 15min左右
(4)测定
将仪器设备调按照上表中的条件进行设置，先测定标准溶液，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线(如图14所示)，标准工作曲线的相关系数为0.99932，曲线方程为y＝78.62282x-4.14327。然后测试空白溶液，奶粉样品溶液和低中高加标溶液，获得的结果见下表7：
表7
Figure BDA0002894128140000141
从表7可以看出，采用旧方法测定含维生素K2的奶粉样品，结果未发现含有维生素K2，证明旧方法不能很好的从奶粉样品中提取出维生素K2。
图15为本对比例常规方法测定奶粉样品的色谱图，由图可知在维生素K2保留时间15min左右，没有发现维生素K2目标峰，且需要运行30min才能完全保证所有杂质流出色谱柱，不再对下一针样品造成干扰。而在实施例1中，维生素K2被切换到二维后，其余杂质部分被切换回一维色谱，在15min内完全流出一维色谱柱，不会对下一针样品的分离造成影响。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，样品前处理过程中，不添加乙醇。
结果发现，酶解后的混合酶解体系中直接加入正己烷后，体系乳化严重，不能实现分层，难以吸取得到上清液，从而无法实现后续测定。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种奶粉中维生素K2的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
样品前处理：取奶粉样品，加入酶和溶剂进行酶解后加入醇溶剂混合，再加入正己烷，离心，取上清液，浓缩，经稀释液稀释，作为待测样品溶液，注入二维切割色谱法进行测定；
其中，所述酶为脂肪酶和蛋白酶中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述二维切割色谱法的一维流动相为乙腈和异丙醇；所述二维切割色谱法的二维流动相甲醇和叔丁基甲醚。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述一维流动相中乙腈和异丙醇的体积比为(60～80):(20～40)；所述二维流动相中甲醇和叔丁基甲醚的体积比为(75～95):(5～25)。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述一维流动相中乙腈和异丙醇的体积比为(65～75):(25～35)；所述二维流动相中甲醇和叔丁基甲醚的体积比为(80～90):(10～20)。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述二维切割色谱法的一维色谱柱为Agilent Extend-C18柱，二维色谱柱为Inertsil ODS-SP柱。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，样品前处理中，所述醇溶剂为乙醇；和/或，所述稀释液为异丙醇；和/或，所述醇溶剂、溶剂、正己烷的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(1～2)。
7.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述二维切割色谱法的色谱条件还包括：
柱温：30±3℃；
检测波长：254±3nm；
进样量：10±1μL；
流速：一维色谱为(1.0±0.1)mL/min，二维色谱为(1.0±0.1)mL/min。
8.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述样品前处理包括以下步骤：取奶粉样品，加入脂肪酶和木瓜蛋白酶和水混合，进行酶解后于(37±2)℃超声(15±5)min，加入乙醇混合并在(37±2)℃超声(15±5)min，再加入正己烷混合，以(4000±500)rpm的转速冷冻离心，取上清液，惰性气体吹干，经异丙醇稀释，作为待测样品溶液，用二维切割色谱法进行测定。
9.一种检测奶粉中维生素K2的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如下试剂：
(1)酶：脂肪酶和木瓜蛋白酶；
(2)提取液：
提取液1：水；
提取液2：醇溶剂；
提取液3：正己烷；
(3)稀释液：异丙醇；
(4)标准工作液：维生素K2的异丙醇溶液。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括用于二维切割色谱检测的一维流动相和二维流动相；进一步地，所述一维流动相为体积比为(60～80):(20～40)乙腈和异丙醇，所述二维流动相为体积比为(75～95):(5～25)的甲醇和叔丁基甲醚。
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