CN113026114A - 缓冲液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了缓冲液及其应用，其中，该缓冲液包括：5‑25mM Tris缓冲液、5‑20mM二价阳离子、75‑150mM一价阳离子、0.05‑2质量％表面活性剂和0.5‑2mM二硫苏糖醇，pH8‑10。该缓冲液的兼容性好，稳定性高，适用于文库构建过程中的多步反应，使文库构建过程中的多步反应可以连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于提高构建DNA文库的方法的效率和稳定性，同时，对T4DNA连接酶无明显的抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及缓冲液及其应用，更具体地，涉及一种缓冲液、 一种试剂盒、该缓冲液在构建核酸文库中用于通用缓冲液，以及一种构建核酸文库的方法。
背景技术
对基因组DNA进行二代测序及相应的生物信息学分析，已经在医学健康领域和科技服 务领域广泛应用。
二代测序文库的构建的一般流程如下：对目的DNA片段化；对片段化DNA进行末端平齐化处理；在平齐化后的DNA的3’末端突出腺苷酸化；将突出腺苷酸化的DNA片段与 突出胸腺嘧啶化的双链Y型接头进行连接。现有的缓冲液体系样本兼容性差、也难以兼容 不同的建库步骤，需要频繁更换缓冲液，延长了文库构建的时间，并且，转化效率低。
由此，现有的建库中的缓冲液体系有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提 出一种缓冲液，该缓冲液的兼容性好，稳定性高，适用于文库构建过程中的多步反应。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种缓冲液。根据本发明的实施例，该缓冲液包 括：5-25mM Tris缓冲液、5-20mM二价阳离子、75-150mM一价阳离子、0.05-2质量％表面 活性剂和0.5-2mM二硫苏糖醇(DTT)，pH8-10。
发明人发现，该缓冲液的兼容性好，稳定性高，适用于文库构建过程中的多步反应，使 文库构建过程中的多步反应可以连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于 提高构建DNA文库的方法的效率和稳定性，同时，对T4 DNA连接酶无明显的抑制作用。
另外，根据本发明上述实施例的缓冲液还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述Tris缓冲液为Tris-盐酸缓冲液和/或Tris-醋酸缓冲液，优选 地，为Tris-盐酸缓冲液。
根据本发明的实施例所述二价阳离子为Mg2+或Ca2+，优选地，为Mg2+。
根据本发明的实施例，所述二价阳离子的浓度为8-14mM。
根据本发明的实施例，所述一价阳离子为Na+和/或K+。
根据本发明的实施例，所述一价阳离子包括40-60mM Na+和40-60mM K+。
根据本发明的实施例，所述表面活性剂为选自聚乙二醇辛基苯基醚、吐温20和乙基苯 基聚乙二醇的至少一种。
进一步地，根据本发明的第二方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例， 该试剂盒包括前述的缓冲液。
根据本发明实施例的试剂盒，采用前述缓冲液，该缓冲液的兼容性好，稳定性高，适用 于文库构建过程中的多步反应，从而，使本发明实施例的试剂盒在文库构建过程中实现了多 步反应连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于提高试剂盒的构建DNA 文库的效率和稳定性，同时，对T4 DNA连接酶无明显的抑制作用。
进一步地，根据本发明的第三方面，本发明提供了前述的缓冲液在构建核酸文库中用于 通用缓冲液。
进一步地，根据本发明的第四方面，本发明提供了一种构建核酸文库的方法。根据本发 明的实施例，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理是在前述的缓冲液中进行的。
根据本发明的实施例，该方法进一步包括片段化处理，且所述片段化处理是在前述的缓 冲液中进行的。
根据本发明的实施例，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理是连续进行的。
根据本发明的实施例，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理的条件是：27-37摄氏度， 5-30分钟；70-75摄氏度，10-20分钟。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件 或具有相同或类似功能的元件。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能 理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对 重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以 明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明， “多个”的含义是两个或两个以上。
缓冲液
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种缓冲液。根据本发明的实施例，该缓冲液包 括：5-25mM Tris缓冲液、5-20mM二价阳离子、75-150mM一价阳离子、0.05-2质量％表面 活性剂和0.5-2mM二硫苏糖醇(DTT)，pH8-10。
发明人发现，该缓冲液的兼容性好，稳定性高，适用于文库构建过程中的多步反应，使 文库构建过程中的多步反应可以连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于 提高构建DNA文库的方法的效率和稳定性，同时，对T4 DNA连接酶无明显的抑制作用。
此外，由于DNA文库所有腺苷酸化酶均显示出一定的偏好性，3’末端为嘧啶(dT或dC) 比3’末端为嘌呤(dA或dG)的DNA片段更易被腺苷酸化，不完全腺苷酸化将导致DNA 片段间的平末端连接反应，影响测序数据的基因组序列组装。
进一步地，本发明实施例缓冲液是构建DNA文库的方法使用相同流程兼容更多种类的 样本和应用方向，可以实现在一台液体处理工作站上完成更多样本的文库构建， 减少了处理过程中对机器、环境和人工操作精度的要求。
同时，根据本发明的一些实施例，该缓冲液对T4 DNA连接酶无明显的抑制作用，在这些体系用酶量的1/5以下，能达到更高的连接效率，有利于关注底物转化效率的应用项目。 并且，该缓冲液使该构建DNA文库的方法对投入的DNA纯度容忍度提高，在同样的操作条件能获得纯度更高的满足下游NGS文库构建的产物，降低了样本准入的纯度标准，适于用于高通量样本处理。
根据本发明的实施例，该Tris缓冲液为Tris-盐酸缓冲液和/或Tris-醋酸缓冲液。由此， 这两种缓冲液的样本兼容性和稳定性好，并且缓冲液在pH值7-9的范围内，缓冲能力强， 维持体系pH值稳定。根据本发明的优选实施例，该缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，缓冲液的缓 冲效果更佳。
发明人研究发现，DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离 子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点，降低Ca2+活化的DNase I与DNA 分子位点的比例，从而，可以降低位点偏好性；而加A(腺嘌呤)酶活性依赖于镁离子，镁离子可以提高加A反应的效率，从而，Mg2+和Ca2+有利于提高末端腺苷酸化的反应效率， 降低了偏好性。根据本发明的实施例，该二价阳离子为Mg2+或Ca2+。优选地，为Mg2+。 由此，Mg2+降低了偏好性效果更好，是本发明实施例的缓冲液在末端修复和加腺苷酸尾处 理过程中均适用，同时，末端腺苷酸化的反应效率高。请发明人说明二价阳离子的作用和 Mg2+或Ca2+的优点，根据本发明的实施例，该二价阳离子的浓度为8-14mM。由此，有利 于降低位点偏好性。
根据本发明的实施例，该一价阳离子为Na+和/或K+。由此，有利于稳定双螺旋结构，调节双链DNA末端的开放程度，提高加A反应的效率。进一步的，根据本发明的实施例， 该一价阳离子包括40-60mM Na+和40-60mM K+，加A反应的效率更高。
不同的提取方法得到的DNA样本，虽然会尽量避免，但是还是会有不同程度的蛋白质、 盐份以及糖类的残留。这也一定程度上影响了DNA分子的构型和表面开放性，由于DNA的分子结构开放性，很大程度上影响了末端修复和加A反应的效率。DNA分子在末端修复 和加A反应的过程中，构型发生急剧的变化，容易留下某些三级结构稳定的区域，这影响 了DNA末端的修复和与连接酶的接触，进而一定程度上抑制了末端修复和加A反应的进行。 因此，为了促进酶的快速出入这些区域，发明人研究发现，非离子型的表面活性剂能促进蛋白质从DNA分子上迅速解离而促进末端修复和加A反应的进行，其中，以聚乙二醇辛基 苯基醚(Triton-x-100)、吐温20和乙基苯基聚乙二醇(NP-40)效果更佳。
缓冲液的应用
进一步地，根据本发明的第二方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例， 该试剂盒包括前述的缓冲液。
根据本发明实施例的试剂盒，采用前述缓冲液，该缓冲液的兼容性好，稳定性高，适用 于文库构建过程中的多步反应，从而，使本发明实施例的试剂盒在文库构建过程中实现了多 步反应连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于提高试剂盒的构建DNA 文库的效率和稳定性，同时，对T4 DNA连接酶无明显的抑制作用。
其中，需要说明的是，该试剂盒的缓冲液具有前述缓冲液的全部技术特征和技术效果， 在此不再一一赘述。
进一步地，根据本发明的第三方面，本发明提供了前述的缓冲液在构建核酸文库中用于 通用缓冲液。
本发明实施例的前述缓冲液，具有兼容性好、稳定性高的特点，适用于文库构建过程中 的多步反应，尤其是样本的片段化处理、末端修改和加腺苷酸尾，从而，在文库构建过程中 实现了多步反应连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于提高构建DNA 文库的效率和稳定性，同时，对T4 DNA连接酶无明显的抑制作用。
进一步地，根据本发明的第四方面，本发明提供了一种构建核酸文库的方法。根据本发 明的实施例，该末端修复和加腺苷酸尾处理是在前述的缓冲液中进行的。
由此，通过利用前述的高兼容性和高稳定性的缓冲液，使文库构建实现了多步反应连续 进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，该构建核酸文库的效率和稳定性高，同时， 对T4 DNA连接酶无明显的抑制作用，显著减少了T4 DNA连接酶的用量，使建库成本显 著降低。其中，需要说明的是，该构建核酸文库的方法所采用的缓冲液具有前述缓冲液的全 部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。
由于核酸样本通常长度比较长，并且，通常在末端修复前需要进行片段化处理，也就是 说，如根据本发明的一些实施例，该方法在末端修复前进一步包括片段化处理，且该片段化 处理是在前述的缓冲液中进行的。由于前述的缓冲液具有良好的兼容性和稳定性，可以兼容 多种片段化处理的核酸样本，例如，该片段化预处理可以为酶切或机械打断。需要说明的是， 该片段化预处理与后续的末端修复和加腺苷酸尾可以是连续进行的。
发明人研究发现，通过采用耐高温聚合酶，使聚和反应在较高的温度下即可进行，并且， 发明人对该末端修复和加腺苷酸尾处理的反应条件进行了反复的摸索，发现当末端修复和加 腺苷酸尾处理的条件是27-37摄氏度，5-30分钟，具体地，可以是该温度和时间条件下的任 意组合，末端修复的温度还可以是28、29、31、33、36、37、38和39摄氏度，时间还可以 是7、9、10、11、13、17、19、23、26、28和29分钟；70-75摄氏度，10-20分钟，具体地， 可以是该温度和时间条件下的任意组合，加腺苷酸尾的温度还可以是71、73和74摄氏度， 时间还可以是9、10、11、13、16、17和19分钟，该条件下DNA片段的末端修复和加尾效 率高，偏好性低，稳定性好，并且，该条件不仅适用于非打断DNA，还适用于打断DNA， 对打断DNA的末端修复效果也很好，可以对多种样本兼容处理；进一步地，根据本发明的 优选实施例，该末端修复和加腺苷酸尾处理的条件：32-37℃，时间为8-14分钟；温度为 72-75℃，时间为10-12分钟更优地，该末端修复和加腺苷酸尾处理的条件可以是：温度为 37℃，时间为10分钟；温度为75℃，时间为10分钟。由此，末端修复和加腺苷酸尾效率 进一步提高，偏好性更低，稳定性更佳，样本兼容性更好。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的， 而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例 仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按 照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子 克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明 生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
实施例1
本实施例中，分别采用本发明实施例的缓冲液和市售的blue缓冲液为通用缓冲液构建 DNA文库，方法如下：
1、构建DNA文库的流程和条件：
(1)打断末端修复和加腺苷酸尾
其中，通用缓冲液分别为本发明前述的缓冲液和市售的blue缓冲液，其中，本发明实 施例的缓冲液配方为5-25mM Tris缓冲液、5-20mM二价阳离子、75-150mM一价阳离子、0.05-2％表面活性剂和0.5-2mM二硫苏糖醇(DTT)，pH8-10。
(2)加接头
其中，连接缓冲液为快速连接缓冲液(由诺唯赞生物科技公司提供)。
(3)纯化：1×磁珠纯化，适量洗脱液洗脱后进行PCR。
*DNaseI为可选择成分，在做转录组测序建库或机械打断时以5U T4PNK和2.5Uklenow 片段代替DNaseI。
2、实验结果
利用上述两种通用缓冲液构建文库的转化效率结果如下：
不同体系下的转化效率
如上表所示，当连接反应进行10min时，其连接效率为0.5×blue+1×rapidligation buffer体系的 2倍。当连接反应6摄氏度过夜进行时，其连接效率为0.5×blue+1×rapid ligation buffer体系的2.6倍。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指 的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个 或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本 发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的 范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种缓冲液，其特征在于，包括：
5-25mM Tris缓冲液、5-20mM二价阳离子、75-150mM一价阳离子、0.05-2质量％表面活性剂和0.5-2mM二硫苏糖醇，pH8-10。
2.根据权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，所述Tris缓冲液为Tris-盐酸缓冲液和/或Tris-醋酸缓冲液，优选地，为Tris-盐酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，所述二价阳离子为Mg2+或Ca2+，优选地，为Mg2+，
任选地，所述二价阳离子的浓度为8-14mM。
4.根据权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，所述一价阳离子为Na+和/或K+，
任选地，所述一价阳离子包括40-60mM Na+和40-60mM K+。
5.根据权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，所述表面活性剂为选自聚乙二醇辛基苯基醚、吐温20和乙基苯基聚乙二醇的至少一种。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的缓冲液。
7.权利要求1-5任一项所述的缓冲液在构建核酸文库中用于通用缓冲液。
8.一种构建核酸文库的方法，其特征在于，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理是在权利要求1-5任一项所述的缓冲液中进行的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述末端修复前，进一步包括片段化处理，且所述片段化处理是在权利要求1-5任一项所述的缓冲液中进行的。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理是连续进行的，
任选地，所述末端修复和所述加腺苷酸尾处理的条件是：27-37摄氏度，5-30分钟；70-75摄氏度，10-20分钟。
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