CN113025670A - 一种高效的缬氨酸制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高效的缬氨酸制备方法，包括下述步骤：(1)将缬氨酸生产菌按照接种量为1‑10％接种到LB培养基中，将其培养体系置于180‑220r/min、35‑37℃、pH为6‑7条件下，培养至OD值3‑4，得到一级种子液；(2)将一级种子液按照1‑10％接种量转接至合成培养基中，将其置于180‑220r/min、35‑37℃、pH为6‑7条件下，培养至OD值3‑4，得到二级种子液；(3)将二级种子液按接种量1‑10％接种到发酵培养基中，将其置于30～37℃、pH为6‑7下发酵培养至生长稳定期，继续在38～45℃、pH为6‑7条件下发酵培养至残糖量不高于2g/L，制得缬氨酸发酵液。本发明在保证缬氨酸转化率的同时提高糖酸生产率，并能降低产物中杂酸的含量，以降低后续提纯难度。

Description

一种高效的缬氨酸制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高效的缬氨酸制备方法。
背景技术
缬氨酸为机体必需氨基酸和营养物质，被广泛应用于食品、医药、化妆品、饲料等领域的食品添加剂、饲料添加剂、营养增补剂、风味剂、化妆品添加剂、药物(如抗生素、除草剂等)的制备前体等，市场前景十分广阔。
CN110607268A公开了一种缬氨酸发酵基因工程菌及其发酵方法，该方法的发酵周期为40h，缬氨酸产量为80g/L。但该方法存在发酵周期长、糖酸转化率低(30-40％)、产物中杂酸含量偏高等缺陷。
为此，需要研究开发糖酸转化率高、发酵周期短、杂酸含量少的缬氨酸发制备方法。
中国专利申请(CN202010401422.5、CN202010466347.0、CN202010460035.9)公开的内容作为理解本发明必不可少的内容。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效的缬氨酸制备方法，包括下述步骤：
(1)将缬氨酸生产菌按照接种量为1-10％接种到LB培养基中，将其培养体系置于180-220r/min、35-37℃、pH6-7条件下培养至OD值3-4，得到一级种子液；
(2)将一级种子液按照1-10％接种量转接至合成培养基中，将其置于180-220r/min、35-37℃、pH6-7条件下培养至OD值3-4，得到二级种子液；
(3)将二级种子液按接种量1-10％接种到发酵培养基中，将其置于30～37℃、pH为6-7下发酵培养至生长稳定期，继续在38～45℃、pH为6-7条件下发酵培养至残糖量不高于2g/L，制得缬氨酸发酵液。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中的缬氨酸生产菌选自野生大肠杆菌、重组大肠杆菌、野生黄色短杆菌、重组黄色短杆菌中的任一种。
本发明优选的技术方案中，所述缬氨酸生产菌选自Sval031菌株、Sval049菌株、Sval065菌株中的任一种。
本发明优选的技术方案中，所述Sval031菌株(保藏编号：CGMCC No.19456)于2020年3月6日提交保藏，分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明优选的技术方案中，所述Sval049菌株(保藏编号：CGMCC No.19457)于2020年3月6日提交保藏，分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明优选的技术方案中，所述Sval065菌株(保藏编号：CGMCC No.19458)于2020年3月6日提交保藏，分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明优选的技术方案，步骤(1)中的LB培养基组成为：8-10g/L蛋白胨，5-10g/L酵母粉和8-10g/L氯化钠。
本发明优选的技术方案，步骤(2)中的合成培养基组成为：甘油8-10g/L，磷酸二氢钾18-21g/L，硫酸铵5-7g/L，硫酸镁1-2g/L，酵母粉1.0-1.2g/L，维生素B1为0.002-0.004g/L，灭菌前用氨水调pH7.3-7.5。
本发明优选的技术方案，步骤(3)中的发酵培养基的组成为：葡萄糖100-150g/L，磷酸二氢钾18-22g/L，硫酸铵5-6g/L，VB1为0.010-0.012g/L，七水硫酸镁2-3g/L，硫酸铜0.03-0.05g/L，七水硫酸亚铁0.02-0.04g/L，聚醚消泡剂0.2mL/L。
本发明优选的技术方案中，发酵培养基中的葡萄糖量为140-150g/L。
本发明优选的技术方案，步骤(3)中的空气流量为80-100L/h。
本发明优选的技术方案，步骤(3)中的发酵转速为200-400r/min。
本发明优选的技术方案，步骤(3)中的环境压力为0.03-0.05MPa。
本发明优选的技术方案，步骤(3)中，培养至生长稳定期的温度为33-36℃。
本发明优选的技术方案，步骤(3)中，培养至残糖量不高于2g/L的温度为42-45℃。
本发明优选的技术方案中，所述的糖酸转化率不低于55％，发酵周期为不高于55h，发酵液中总杂酸含量不高于2.5g/L。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
除非另有说明，本发明采用如下检测方法：
1.OD值
仪器以及试剂：紫外可见光分光光度计，玻璃比色皿，纯水
实验步骤：分光光度计使用前提前15分钟开机进行预热，将波长调到600nm，再在比色皿中加入纯水，放入分光光度计中进行校零，取出比色皿，将纯水倒掉，加入待测样品，放入分光光度计中读取吸光度值，得到样品OD值。
2.杂酸量和产酸量
仪器以及试剂：岛津LC-16液相色谱仪，C18色谱组，衍生剂为5％的邻苯二甲醛乙醇水溶液、30％甲醇流动相，缬氨酸标准品为西格玛分析标准品，杂酸为市售的含量99％的其它氨基酸。
实验步骤：发酵液稀释100倍后，过滤，加衍生剂衍生2分钟，衍生后进样，波长234nm，进样量10ul，通过标准品峰面积计算样品中氨基酸浓度。
杂酸量＝杂酸标准品峰面积/杂酸峰面积*杂酸标准品浓度。
产酸量＝缬氨酸标准品峰面积/缬氨酸峰面积*缬氨酸标准品浓度。
3.残糖量
使用山东科学院生物研究所的SBA-40D生物传感器检测发酵产物中的葡萄糖含量。
4.糖酸转化率
糖酸转化率的计算方法＝产酸量/(发酵培养基中的总葡萄糖质量*0.9)。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1、本发明的缬氨酸制备方法筛选优化了发酵培养条件，显著提高了缬氨酸糖酸转化率并缩短发酵周期，显著降低杂酸的含量并提高发酵效率，利于缬氨酸发酵液的提纯，提高缬氨酸质量且质优价廉。
2、本发明缬氨酸的制备方法具有操作简便，适于工业化生产等优点。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例中的菌种为中国专利申请(CN202010401422.5、CN202010466347.0、CN202010460035.9)中的菌种Sval065菌株(保藏编号为CGMCC NO.19458)、Sval031菌株(保藏编号：CGMCC No.19456)、Sval049菌株(保藏编号：CGMCC No.19457)。
LB培养基的组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
合成培养基的组成：甘油8-10g/L，磷酸二氢钾18-21g/L，硫酸铵5-7g/L，硫酸镁1-2g/L，酵母粉1.0-1.2g/L，VB1为0.002-0.004g/L，灭菌前用氨水调至7.3-7.5。
发酵培养基的组成：葡萄糖150g/L，磷酸二氢钾18-22g/L，硫酸铵5-6g/L，VB1为0.010-0.012g/L，七水硫酸镁2-3g/L，硫酸铜0.03-0.05g/L，七水硫酸亚铁0.02-0.04g/L，聚醚消泡剂0.2mL/L。
实施例1
(1)取1mL甘油管保藏的Sval065菌株(保藏编号为CGMCC NO.19458)，将其接种至50mL的LB培养基中，在37℃、210r/min下摇床培养，调节pH6.2-6.5，培养至OD值为2-3结束时，获得一级种子液；
(2)取2mL的一级种子液接种到100mL合成培养基中，在37℃、210r/min下摇床培养，调节pH6.4-6.6，培养至OD值为3-4，获得二级种子液；
(3)在火焰保护环境下，将二级种子液按2.5％的接种量接种到发酵培养基中，35℃下培养30h，43℃下培养至残糖量小于2g/L，其中，环境压力为0.03MPa，发酵转速为200r/min、空气流量为100L/h，调节发酵pH为6.9-7.0。
经统计，本次发酵时长为51h，发酵结束后，检测产酸量和杂酸量，其中缬氨酸为74g/L，L-丙氨酸为0.24g/L，亮氨酸为0.16g/L，异亮氨酸为0.2g/L，糖酸转化率为54.8％。
对比例1
(1)取1mL甘油管保藏的菌种Sval065菌株(保藏编号为CGMCC NO.19458)，将其接种至50mL的LB培养基中，在37℃、210r/min下摇床培养，调节pH6.2-6.5，培养至OD值为2-3，获得一级种子液；
(2)取2mL的一级种子液种接到100mL合成培养基中，37℃、pH6.4-6.6、210r/min条件下摇床培养至OD值为3-4，获得二级种子液；
(3)在火焰保护环境下，将二级种子液按2.5％的接种量接种到发酵培养基中，35℃下培养至残糖量小于2g/L，其中，环境压力为0.03MPa，发酵转速为200r/min、空气流量为100L/h，调节发酵pH为6.9-7.0。
经统计，本次发酵时长为78h，发酵结束后，检测产酸量和杂酸量，其中缬氨酸为65g/L，L-丙氨酸为0.8g/L，亮氨酸为0.42g/L，异亮氨酸为0.36g/L，糖酸转化率为48.1％。
实施例2
(1)取1mL甘油管保藏的Sval031菌株(保藏编号：CGMCC No.19456)，将其接种至50mL的LB培养基中，37℃、210r/min下摇床培养，pH6.2-6.5，培养至OD值为2-3，获得一级种子液；
(2)取2mL的一级种子液种接种至100mL合成培养基中，在37℃、210r/min、pH6.4-6.6条件下摇床培养至OD值为3-4，获得二级种子液；
(3)在火焰保护环境下，将二级种子液按2.5％的接种量接种到发酵培养基中，35℃下培养至生长稳定期，43℃下培养至残糖量小于2g/L，其中，环境压力为0.03MPa，发酵转速为200r/min、空气流量为100L/h，发酵pH为6.9-7.0。
经统计，本次发酵时长为52h，发酵结束后，检测产酸量和杂酸量，其中缬氨酸为71g/L，L-丙氨酸为0.27g/L，亮氨酸为0.21g/L，异亮氨酸为0.26g/L，糖酸转化率为52.6％。
对比例2
(1)取1mL甘油管保藏的菌种Sval031菌株(保藏编号为CGMCC NO.19458)，将其接种至50mL的LB培养基中，在37℃、210r/min、pH6.2-6.5条件下摇床培养至OD值为2-3，获得一级种子液；
(2)取2mL的一级种子液种接到100mL合成培养基中，在37℃、210r/min、pH6.4-6.6条件下摇床培养至OD值为3-4，获得二级种子液；
(3)在火焰保护环境下，将二级种子液按2.5％的接种量接种到发酵培养基中，35℃下培养30h，39℃下培养10h，43℃下培养至残糖量小于2g/L，其中，环境压力为0.03MPa，发酵转速为200r/min、空气流量为100L/h，发酵pH为6.9-7.0。
经统计，本次发酵时长为57h，发酵结束后，检测产酸量和杂酸量，其中缬氨酸为62g/L，L-丙氨酸为0.44g/L，亮氨酸为0.34g/L，异亮氨酸为0.23g/L，糖酸转化率为45.9％。
实施例3
(1)取1mL甘油管保藏的Sval049菌株(保藏编号：CGMCC No.19457)，将其接种至50mL的LB培养基中，37℃、210r/min、pH6.2-6.5下摇床培养至OD值为2-3，获得一级种子液；
(2)取2mL的一级种子液种接到100mL合成培养基中，37℃、210r/min、pH6.4-6.6下摇床培养至OD值为3-4，获得二级种子液；
(3)在火焰保护环境下，将二级种子液按2.5％的接种量接种到发酵培养基中，35℃下培养至生长稳定期，43℃下培养至残糖量小于2g/L，其中，环境压力为0.03MPa，发酵转速为200r/min、空气流量为100L/h，发酵pH为6.9-7.0。
经统计，本次发酵时长为52h，发酵结束后，检测产酸量和杂酸量，其中缬氨酸为68g/L，L-丙氨酸为0.3g/L，亮氨酸为0.16g/L，异亮氨酸为0.14g/L，糖酸转化率为50.4％。
对比例3
(1)取1mL甘油管保藏的菌种Sval049菌株(保藏编号为CGMCC NO.19458)，将其接种至50mL的LB培养基中，在37℃、210r/min、pH6.2-6.5下摇床培养至OD值为2-3，获得一级种子液；
(2)取2mL的一级种子液种接到100mL合成培养基中，在37℃、210r/min、pH6.4-6.6下摇床培养至OD值为3-4，获得二级种子液；
(3)在火焰保护环境下，将二级种子液按2.5％的接种量接种到发酵培养基中，35℃下培养至残糖量小于2g/L，其中，环境压力为0.03MPa，发酵转速为200r/min、空气流量为100L/h，发酵pH为6.9-7.0。
经统计，本次发酵时长为75h，发酵结束后，检测产酸量和杂酸量，其中缬氨酸为64g/L，L-丙氨酸为0.71g/L，亮氨酸为0.33g/L，异亮氨酸为0.21g/L，糖酸转化率为47.4％。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种高效的缬氨酸制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)将缬氨酸生产菌按照接种量为1-10％接种到LB培养基中，将其培养体系置于180-220r/min、35-37℃、pH为6-7条件下，培养至OD值3-4，得到一级种子液；
(2)将一级种子液按照1-10％接种量转接至合成培养基中，将其置于180-220r/min、35-37℃、pH为6-7条件下，培养至OD值3-4，得到二级种子液；
(3)将二级种子液按接种量1-10％接种到发酵培养基中，将其置于30～37℃、pH为6-7下发酵培养至生长稳定期，继续在38～45℃、pH为6-7条件下发酵培养至残糖量不高于2g/L，制得缬氨酸发酵液。
2.如权利要求1任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的缬氨酸生产菌选自野生大肠杆菌、重组大肠杆菌、野生黄色短杆菌、重组黄色短杆菌中的任一种。
3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述缬氨酸生产菌选自Sval031菌株、Sval049菌株、Sval065菌株中的任一种。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述Sval031菌株保藏编号为CGMCCNo.19456；所述Sval049菌株保藏编号为CGMCC No.19457；所述Sval065菌株保藏编号为CGMCC No.19458。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，发酵培养基中的葡萄糖浓度为140-150g/L。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的空气流量为80-100L/h。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中调节发酵pH为6.9-7.0。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的发酵转速为200-400r/min。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，培养至生长稳定期的温度为33-36℃。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，培养至残糖量不高于2g/L的温度为42-45℃。
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