CN113008999A - 一种分离测定氟比洛芬酯中2种基因毒性杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离测定氟比洛芬酯中基因毒性杂质乙酸乙烯酯和苯的方法。该方法采用液相色谱法，以十八烷基硅胶色谱柱为固定相，以乙腈‑磷酸水为流动相，可以将乙酸乙烯酯和苯有效分离，各杂质峰形较好，柱效较高，专属性好，良好地控制氟比洛芬酯的质量。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及氟比洛芬酯中2种基因毒性杂质的分析方法。
背景技术
氟比洛芬酯（以下简称“FLUR”），是氟比洛芬的前药，可以抑制环氧化酶（COX-1和COX-2），从生理上减少前列腺素（PGs）的合成，达到解热、镇痛、抗炎等作用。
根据ICH M7，本发明人开展了对氟比洛芬酯的基因毒性杂质研究。发现氟比洛芬酯有关物质种类较多，杂质数量也相当多且复杂，具体研究内容如下：
首先，氟比洛芬酯基因毒性杂质谱分析见下表1。分为芳香胺类、亚硝基化合物、迈克尔加成反应受体、醛类、烷烃卤代物和苯等类别，共6种类型的化合物。
表
氟比洛芬酯基因毒性杂质谱汇总表
其次，根据不同类别的杂质化合物的特点，展开相应的方法学研究，各方法汇总见下表2。
表2氟比洛芬酯基因毒性杂质分析方法汇总表
需要说明的是，在方法学研究过程中，本发明人发现采用现有技术和常规的GC的方法难以将乙酸乙烯酯和苯很好的分离。乙酸乙烯酯和苯属于不同结构类别的化合物，但确实很难将它们分离测定。如采用胡婧等（丙烯酸酯压敏胶中残留单体的HPLC法测定，中国医药工业杂志，2010, 41(2) ：120-122）建立的同时测定丙烯酸酯压敏胶中三种残留单体——乙酸乙烯酯、丙烯乙烯酯和丙烯酸正丁酯的含量的HPLC法，其流动相为乙腈-水（40:60），等度或者梯度均不能将氟比洛芬酯中2个基因毒性杂质有效的分离。又如乙酸乙烯酯和苯这两个化合物各自常规分析方法都是GC-FID方法，然而采用常规GC-FID的测定方法也难以将这两个杂质分离检测，不能达到很好的检测灵敏度、方法重复性和精密度。
为了有效控制和保证氟比洛芬酯的质量，确保其基因毒性杂质的有效控制， 有必要研究一种灵敏度高、重复性好及精密度佳的有效分离乙酸乙烯酯和苯这两个杂质的测定方法，实现对氟比洛芬酯中对乙酸乙烯酯和苯的有效控制，本发明人经过大量反复的研究，最终开发出一种HPLC-UV的检测方法，该方法对氟比洛芬酯原料药和制剂的质量控制具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离测定氟比洛芬酯中基因毒性杂质的方法，该方法能对氟比洛芬酯中的乙酸乙烯酯和苯进行有效的分离检测，从而实现氟比洛芬酯的原料药的质量控制和保证氟比洛芬酯注射液的质量。
为实现本发明的目的，提供如下实施方案。
在一实施方案中，本发明的一种分离测定氟比洛芬酯中基因毒性杂质的方法，所述杂质为乙酸乙烯酯和苯，该方法为液相色谱法，包括：1）色谱柱为十八烷基硅胶键合的色谱柱，2）流动相由流动相A和流动相B组成，其中，流动相A为磷酸水，流动相B为乙腈，3）流动相中乙腈与磷酸水的体积比为：乙腈为10%~90%，磷酸水为10%~90%。
上述实施方案中，本发明的方法，磷酸水（流动相A）-乙腈（流动相B）的体积比为10:90~90:10，所述磷酸水，其磷酸含量为0.05%~0.15%。
上述实施方案中，本发明的方法，具体包含以下步骤：
a)对照品溶液：取乙酸乙烯酯、1,1-乙二醇二乙酸酯和苯适量，精密称定，用乙腈溶解并用稀释剂稀释制成每1ml中约含乙酸乙烯酯0.38μg、1,1-乙二醇二乙酸酯75μg和苯0.1μg的溶液，作为对照品溶液；
b)供试品溶液：取供试品约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，用乙腈溶解并用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
c)设置流动相的流速为0.9～1.1ml/min，流动相A中磷酸含量为0.05%~0.15%，检测波长为205nm，色谱柱的柱温为25℃～35℃，进样量为5μl至100μl；
d)取相同体积的步骤a）的混合对照溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，完成分离测定。
上述本发明的方法，步骤a）和b)中所述稀释剂为乙腈；步骤c）中，所述流动相的流速为1.0ml/min，流动相中磷酸的含量为0.1%，所述色谱柱的柱温为30℃，所述进样量为10μl。
在一具体实施方案中，本发明的一种分离测定氟比洛芬酯中基因毒性杂质的方法，所述基因毒性杂质为乙酸乙烯酯和苯，该方法为液相色谱法，包括：1）色谱柱为十八烷基硅胶键合的色谱柱，优选为安捷伦SB-C18，4.6×150mm，3.5μm；2）流动相由磷酸水（即流动相A）-乙腈（即流动相B）组成，3）流动相中乙腈与磷酸水的体积比为：乙腈为10%~90%，磷酸水为10%~90%。
优选的，上述本发明的方法，流动相A中磷酸的含量为0.1%；流动相磷酸水-乙腈的体积比为10:90~90:10。
上述具体实施方案中，本发明的分离测定氟比洛芬酯中乙酸乙烯酯和苯的方法，进一步包含以下步骤：
a）乙酸乙烯酯储备液：称取乙酸乙烯酯约385mg，精密称定，置20ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置50ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得；
b）苯储备液：称取苯约200mg，精密称定，置20ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得；
c）对照品储备液：精密量取苯储备液和乙酸乙烯酯储备液各1ml，置同一100ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
d）对照品溶液：精密量取对照品储备液1ml，置同一10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得；
e）供试品溶液：取供试品约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
f）设置流速为0.9～1.1ml/min，流动相A中磷酸含量为0.05%~0.15%，梯度变化为90%~10%，流动相B乙腈梯度变化为10%~90%，检测波长为205nm，色谱柱的柱温为25℃～35℃，进样量为5μl至100μl；
g）取相同体积的步骤d）对照品溶液、e）供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，完成氟比洛芬酯种基因毒性杂质乙酸乙烯酯和苯的分离测定。
上述本发明的方法，步骤a）~ e）所述稀释，其稀释剂为乙腈，步骤f）中所述流动相的流速为1.0ml/min，所述检测波长为205nm，流动相A中磷酸水为0.1%，色谱柱的柱温为30℃，进样量为10μl。
在上述具体实施方案中，本发明的方法，具体色谱条件优选如下：
仪器：Agilent 1200 高效液相色谱仪
色谱柱：安捷伦SB-C18，4.6×150mm，3.5μm；
进样量：10μl；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：205nm；
稀释剂：乙腈
流动相A：0.1%磷酸水溶液；流动相B：乙腈
梯度：流动相B的含量从10%变到90%。
本发明的方法的有益效果：本发明的方法可以将氟比洛芬酯中乙酸乙烯酯和苯有效分离，能准确测定乙酸乙烯酯和苯，而且峰形对称，柱效较高，从而可以准确控制氟比洛芬酯的质量，简单、快速、准确地分离检测出氟比洛芬酯的2个基因毒性杂质乙酸乙烯酯和苯。
特别是，本发明的方法采用常规十八烷基色谱柱，采用此色谱柱不但成本低，又能够有效的分离检测氟比洛芬酯的2个基因毒性杂质乙酸乙烯酯和苯，同时也能分析检测已知杂质1,1-乙二醇二乙酸酯，且灵敏度也能达到相应要求。选用乙腈作为稀释剂溶解样品，避免样品在流动相中析出，使杂质及样品均能充分溶解，又避免了产生较大的溶剂峰干扰；柱温为30℃，柱温耐用性好，峰形较好，又能让分离度达到最佳。流动相以0.1%磷酸水溶液和乙腈运行梯度，能有效分离氟比洛芬酯的2个基因毒性杂质乙酸乙烯酯和苯，同时提高工作效率。本发明解决了GC方法分离测定基因毒性杂质乙酸乙烯酯和苯灵敏度低和精密度差的问题，从而保证了氟比洛芬酯的质量可控。
附图说明
图1空白溶剂的液相色谱图；
图2杂质1,1-乙二醇二乙酸酯、乙酸乙烯酯和苯对照品溶液液相色谱图；
图3氟比洛芬酯供试品溶液的液相色谱图；
图4氟比洛芬酯+三个限度浓度的杂质对照品溶液的液相色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明和理解本发明的精神，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
仪器与条件
仪器：Agilent 1200 高效液相色谱仪
色谱柱：SB-C18，4.6×150mm，3.5μm；
进样量：10μl；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：205nm；
稀释剂：乙腈
流动相A：0.1%磷酸水溶液；流动相B：乙腈
梯度见下表3：
表3 洗脱梯度
实验步骤：
乙酸乙烯酯储备液：称取乙酸乙烯酯约385mg，精密称定，置20ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置50ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
1,1-乙二醇二乙酸酯储备液：精密称取1,1-乙二醇二乙酸酯约750mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
苯储备液：称取苯约200mg，精密称定，置20ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品储备液：精密量取苯储备液和乙酸乙烯酯储备液各1ml，1,1-乙二醇二乙酸酯储备液2ml，置同一100ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液：精密量取对照品储备液1ml，置同一10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：取供试品约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
100%限度浓度杂质的供试品溶液：取供试品约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取对照品储备液1ml，置同一10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
分别取空白溶液（稀释剂）、对照品溶液、供试品溶液和100%限度浓度杂质的对照品溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图；结果见图1、图2、图3和图4。
图1 图中表明，溶剂不干扰测定。
图2 图中杂质出峰顺序依次为乙酸乙烯酯、1,1-乙二醇二乙酸酯和苯。
图3 表明，氟比洛芬酯中的基因毒性杂质（乙酸乙烯酯和苯）均为未检出。
图4 表明，本发明的方法可以有效分离检测氟比洛芬酯中乙酸乙烯酯和苯这2种基因毒性杂质以及1,1-乙二醇二乙酸酯，可以用于氟比洛芬酯中的基因毒性杂质（乙酸乙烯酯和苯）的分离测定。
实施例2 耐用性实验
乙酸乙烯酯储备液：称取乙酸乙烯酯约385mg，精密称定，置20ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置50ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
1,1-乙二醇二乙酸酯储备液：精密称取1,1-乙二醇二乙酸酯约750mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
苯储备液：称取苯约200mg，精密称定，置20ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品储备液：精密量取苯储备液和乙酸乙烯酯储备液各1ml，1,1-乙二醇二乙酸酯储备液2ml，置同一100ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液：精密量取对照品储备液1ml，置同一10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：取供试品约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
分别取空白溶液（稀释剂）、对照品溶液、供试品溶液，下图表4中柱温、流速和流动相比例条件测试对照品和供试品溶液。对照品溶液中，乙酸乙烯酯、1,1-乙二醇二乙酸酯和苯峰面积的RSD均小于10.0%，乙酸乙烯酯、1,1-乙二醇二乙酸酯和苯之间分离度均大于1.5。
各改变色谱条件下测得的乙酸乙烯酯、1,1-乙二醇二乙酸酯和苯含量，与正常条件测得的乙酸乙烯酯、1,1-乙二醇二乙酸酯和苯含量结果的差值均小于10.0%。
符合接受标准，方法色谱条件在柱温±2℃、流速±0.1ml/min和洗脱程序中乙腈比例±2%时，耐用性合格。结果汇总见下表4。
表4 耐用性实验结果汇总
耐用性实验结论：对照品溶液中，乙酸乙烯酯、1,1-乙二醇二乙酸酯和苯峰面积的RSD均小于10.0%，乙酸乙烯酯、1,1-乙二醇二乙酸酯和苯之间分离度均大于1.5；各改变色谱条件下测得的乙酸乙烯酯、1,1-乙二醇二乙酸酯和苯含量，与正常条件测得的乙酸乙烯酯、1,1-乙二醇二乙酸酯和苯含量结果的差值均小于10.0%；符合接受标准，在柱温±2℃、流速±0.1ml/min和洗脱程序中乙腈比例±2%时，耐用性符合要求。
实施例3 溶液稳定性实验
乙酸乙烯酯储备液：称取乙酸乙烯酯约385mg，精密称定，置20ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置50ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
1,1-乙二醇二乙酸酯储备液：精密称取1,1-乙二醇二乙酸酯约750mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
苯储备液：称取苯约200mg，精密称定，置20ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品储备液：精密量取苯储备液和乙酸乙烯酯储备液各1ml，1,1-乙二醇二乙酸酯储备液2ml，置同一100ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液：精密量取对照品储备液1ml，置同一10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：取供试品约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
取对照品溶液、供试品溶液，分别于室温下相应时间后，各进样1针，记录色谱图。在室温下：对照品溶液放置19h相对0h峰面积的比值乙酸乙烯酯为94%， 1,1-乙二醇二乙酸酯为102%，苯为95%，在90%~110%范围内；供试品溶液放置10h相对0h峰面积的比值乙酸乙烯酯为98%，1,1-乙二醇二乙酸酯为97%，苯为94%，在90%~110%范围内。
室温下，对照品溶液19h内稳定，供试品溶液10h内稳定。具体结果见下表5和表6。
表5 对照品溶液稳定性试验结果
表6 供试品溶液稳定性试验结果
实施例4 灵敏度实验
乙酸乙烯酯储备液：称取乙酸乙烯酯约385mg，精密称定，置20ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置50ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
1,1-乙二醇二乙酸酯储备液：精密称取1,1-乙二醇二乙酸酯约750mg，置20ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
苯储备液：称取苯约200mg，精密称定，置20ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
定量限储备液：精密移取乙酸乙烯酯储备液1ml、1,1-乙二醇二乙酸酯储备液0.8ml和苯储备液1ml，置200ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。
定量限溶液：精密量取定量限储备液1ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限溶液：精密移取5ml定量限溶液，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
取定量限溶液连续进样6次，取检测限溶液进样1次，记录色谱图。
定量限结果见表7，连续进样6针，乙酸乙烯酯峰面积RSD为2.0%，S/N为106.4～253.6；1,1-乙二醇二乙酸酯峰面积RSD为2.5%，S/N为90.7～215.8；苯峰面积RSD为5.6%，S/N为25.5～63.6。符合接受标准。
故定量限分别为：乙酸乙烯酯为0.19μg/ml，相当于限度的50%，相当于供试品溶液的3.8ppm；1,1-乙二醇二乙酸酯为15.16μg/ml，相当于限度的20%，相当于供试品溶液的0.03%；苯为0.05μg/ml，相当于限度的50%，相当于供试品溶液的1ppm。
检测限结果见表8，乙酸乙烯酯S/N为128.6；1,1-乙二醇二乙酸酯S/N为108.3；苯S/N为21.5。符合接受标准。
故检测限分别为：乙酸乙烯酯为0.10μg/ml，相当于限度的25%，相当于供试品溶液的1.9ppm；1,1-乙二醇二乙酸酯为7.58μg/ml，相当于限度的10%，相当于供试品溶液的0.015%；苯为0.03μg/ml，相当于限度的25%，相当于供试品溶液的0.5ppm。
灵敏度实验的结果表明本发明提供的方法灵敏度良好。
表7 定量限试验结果
表8 检测限试验结果
上述表4~8的实验结果表明，本发明的技术方案能获得良好的分离测试效果，很好的控制氟比洛芬酯中2个基因毒性杂质的质量，从而保证氟比洛芬酯的质量。
在不改变本发明的精神实质的条件下，对本发明作简单的替换或调整也属于本发明的范围。
Claims (10)
1.一种分离测定氟比洛芬酯中基因毒性杂质的方法，所述杂质为乙酸乙烯酯和苯，该方法为液相色谱法，包括：1）色谱柱为十八烷基硅胶键合的色谱柱，2）流动相由流动相A和流动相B组成，其中，流动相A为磷酸水，流动相B为乙腈，3）流动相中乙腈与磷酸水的体积比为：乙腈为10%~90%，磷酸水为10%~90%。
2.根据权利要求1所述的方法，所述磷酸水，其中磷酸含量为0.05%~0.15%。
3.根据权利要求1所述的方法，磷酸水-乙腈的体积比为10:90~90:10。
4.根据权利要求1所述的方法，所述杂质进一步包括1,1-乙二醇二乙酸酯。
5.根据权利要求1所述的方法，采用梯度洗脱法。
6.根据权利要求5所述的方法，所述梯度洗脱法，其流动相梯度变化如下：
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，包含以下步骤：
a) 对照品溶液：取乙酸乙烯酯、1,1-乙二醇二乙酸酯和苯适量，精密称定，用乙腈溶解并用稀释剂稀释制成每1ml中约含乙酸乙烯酯0.38μg、1,1-乙二醇二乙酸酯75μg和苯0.1μg的溶液，作为对照品溶液；
b) 供试品溶液：取供试品约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，用乙腈溶解并用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
c) 设置流动相的流速为0.9～1.1ml/min，流动相中磷酸含量为0.05%~0.15%，检测波长为205nm，色谱柱的柱温为25℃～35℃，进样量为5μl至100μl；
d) 取相同体积的步骤a）的混合对照溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，完成分离测定。
8.根据权利要求7所述的方法，步骤a）和b)中所述稀释剂为乙腈。
9.根据权利要求7所述的方法，步骤c）中所述流动相的流速为1.0ml/min，所述色谱柱的柱温为30℃,所述进样量为10μl。
10.根据权利要求7所述的方法，步骤c）中流动相中磷酸的含量为0.1%。
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