CN113005217A - 玉米耐盐性相关的ZmNF-YA8基因SNP标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米耐盐性相关的ZmNF‑YA8基因SNP标记及其应用。所述SNP位点位于ZmNF‑YA8基因的3’UTR下游5183bp处，存在两种等位变异：CC和TT基因型；与CC基因型相比，含有TT基因型的玉米自交系苗期耐盐性显著增强。通过选择该标记位点的有利等位变异选择耐盐性高的玉米材料，可缩短耐盐玉米材料的培育年限。

Description

玉米耐盐性相关的ZmNF-YA8基因SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于生物育种技术领域，具体涉及玉米耐盐性相关的ZmNF-YA8基因 SNP标记及其应用。

背景技术

土壤盐碱化趋势在世界范围内不断扩展，严重限制了农作物的生长，已经成为制约农业生产的重要因素。耕地盐碱化程度的逐年加剧严重影响了玉米的产量和品质，为提高在盐碱化土地上玉米的生物产量，进行玉米的耐盐育种十分必要。

研究和生产实践表明，玉米耐盐性状是一个复杂的数量性状，不同玉米自交系间耐盐性存在显著的基因型差异。玉米中响应盐胁迫机理复杂，对育种实践具有较高利用价值的关键基因挖掘工作仍然很有限。

全基因组关联分析是一种基于连锁不平衡鉴定自然群体中表型性状与遗传标记之间关系的分析方法，是挖掘优良等位基因的有效途径。随着玉米全基因组数据和转录组数据的公布，以及芯片技术的发展，许多SNP分子标记应运而生，关联分析也已经广泛应用于解析玉米复杂性状的遗传基础。与传统的连锁分析相比，关联分析可以利用自然群体结合基因型和表型快速定位性状的遗传位点，具有高分辨率、检测变异数目多等优点。通过在全基因组水平上挖掘玉米抗盐相关基因、开发功能标记等可以加快玉米植株耐盐品种的创制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米耐盐性相关的ZmNF-YA8基因SNP标记及其应用。

本发明在明确了玉米ZmNF-YA8基因对可以提高玉米耐盐性的基础上，对 216份玉米关联群体的自交系进行苗期耐盐性鉴定，并运用ZmNF-YA8基因上下游约10k的区间在自然关联群体自交系中存在的SNP位点，与苗期高盐胁迫存活率进行候选基因关联分析，挖掘出ZmNF-YA8基因下游上一个SNP位点与耐盐性性状显著相关。

一种玉米耐盐性相关的ZmNF-YA8基因SNP标记，所述SNP位点位于 ZmNF-YA8基因的3’UTR区下游，有一个位点，存在两种等位变异：CC和TT 基因型。

与CC基因型相比，含有TT基因型的玉米自交系苗期耐盐性显著增强。

所述玉米耐盐性相关的ZmNF-YA8基因SNP标记在筛选耐盐玉米中的应用。

一种用于鉴定耐盐玉米ZmNF-YA8基因SNP标记的引物，所述引物的上下游引物核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

一种含有所述引物用于检测耐盐玉米的试剂盒。

一种耐盐玉米的检测方法，对待检测样品的基因组检测所述的SNP标记，若检测为TT基因型，则所述样品为耐盐玉米。

所述待检测样品包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞的组织培养的材料。

所述适宜于有性繁殖的材料，如选自花粉、子房、胚珠等。

所述适宜于无性繁殖的材料如可以选自根、茎、原生质体等。

所述适宜于可再生的细胞的组织培养的材料如可以选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、幼胚、分生组织细胞、根、根端、花药、花、种子和茎等。

进一步地，所述检测可以包括测序、PCR、杂交等。

本发明还提供了一种耐盐玉米育种方法，挑选出上述的所述SNP标记为 TT基因型的玉米进行杂交繁殖。

利用本发明的SNP标记进行耐盐玉米辅助育种，能够早期筛选目标玉米，具有节省时间、成本低廉等优点。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括如下方面：

(1)本发明利用ZmNF-YA8基因上下游10k区间内存在的高质量的SNP位点，对216份玉米品种的苗期耐盐性(高盐胁迫下玉米品种存活率)性状进行候选基因关联分析，挖掘出ZmNF-YA8基因下游一个SNP位点与高盐胁迫下玉米幼苗存活率显著相关。

(2)本发明提供的一个SNP位点在基因的3’UTR区下游，存在两种等位变异：CC基因型和TT基因型。与CC基因型相比，含有TT基因型的玉米材料具有较强的耐盐性，可以借助TT基因型的标记位点选择耐盐性强的材料，显著提高选择效率和准确性。

(3)通过选择该标记位点的有利等位变异(TT基因型)选择耐盐性高的玉米材料，可缩短耐盐玉米材料的培育年限。

附图说明

图1是在216份关联群体自交系中ZmNF-YA8基因上下游10k区间内的SNP 位点与苗期耐盐性的连锁不平衡区块分析图；

图中上面图形为关联分析的曼哈顿图，其中点状表示SNP位点，红色点表示与存活率关联性最高的SNP位点SNP170554687；中间部分为ZmNF-YA8 基因结构和一个SNP位点所在位置，中间灰色矩形表示外显子，白色矩形表示内含子，两侧灰色矩形表示非翻译区；下部图形为成对连锁不平衡(LD)模型；横坐标表示SNP分子标记在玉米7号染色体V4版本上的位置：纵坐标表示-logP 值。

图2是不同单倍型玉米的苗期存活率差异分析箱线图；

上面部分为SNP位点的两种单倍型，下部分为关联群体中自交系存活率差异箱线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1

一、试验材料和方法

1、玉米材料和种植

本发明所用的216份玉米材料来自共包含有540份材料的玉米自然变异群体(Liuet al.,2017)。这些材料种植在中国农业科学院生物技术研究所培养室中。采用8.0cm×8.0cm培养盒种植，每个培养盒中装入相同量营养土，每盒种植10-15株，每个材料共三个重复。

2、苗期盐处理和存活率调查

播种后3周，待幼苗长至两叶一心期，用200mM NaCl浇灌，每盒80mL，每周浇一次，共4次后，第五周统计幼苗存活率。

3、存活率性状与ZmNF-YA8基因的关联分析

借助玉米重测序后被过滤的高密度SNP标记，选取在ZmNF-YA8等位基因上下游10k区间内的SNP位点。利用TASSEL 5.0软件的混合线性模型(MLM) 进行216份材料的盐处理存活率性状和ZmNF-YA8基因的关联分析。

二、试验结果

关联分析结果如图1所示，在这个群体中，在ZmNF-YA8基因的3’UTR区存在显著影响玉米苗期耐盐性的位点，最强关联的SNP位点为SNP170554687。 SNP170554687位点在216个自交系品种中有176个为C/C，40个为T/T。

实施例2目的DNA扩增及测序

(1)引物的设计

通过maizeGDB网站(https://www.maizegdb.org/gbrowse)下载本7号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列。

设计引物的DNA序列如下所示：

正向引物F：5’-CCATGCACCATCTTTTAGGC-3’(SEQ ID NO：2) 反向引物R：5’-GTGTCGGAACGGAACCACT-3’(SEQ ID NO：3)

(2)PCR扩增

10ul反应体系中加入DNA模板1uL，双蒸水3uL，2X Taq PCR mix 5uL，正向引物F和反向引物R各0.5uL。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，34个循环，最后72℃，延伸10min。

(3)DNA序列测定

将PCR产物送给华大生物工程股份有限公司进行正向和反向测序，得到下列碱基序列。

CCATGCACCATCTTTTAGGCTATGCCGACCCCTGGCCTTCGTAGCCTGGGG CTCAGTGTGGCCCGTGTTGCGCTCTGCCGGAGGCCTGCGCACTCAGGCCT AGTTCGATAGGTCATGAGTGCTCCGTAGACCGAGGGGCGCGCGGACCATA AATGCGCTGCAGGTCAGGGCN[C/C或

T/T]GGCTCGTAGGTCATGAGTGGTATGCGGTTCGAGGGGTTCGTAGGTCAT GAGTGGGAAGCGAATTGGTGCTCGCGACGTGGCTCGATGTTAGGCGTGG TTACCACGTCCAGTTATTTACGATGGGTCAGTCTGGGGCCGGGCGTGAGA TCCACTCGAGTGGTTCCGTTCCGACAC

这个SNP位点分别形成2种基因型(CC型与TT型)与苗期耐盐性显著关联。其中TT基因型具有最高的耐盐性。显著性分析表明，两种基因型耐盐性差异显著(p＝0.043)(图2)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 玉米耐盐性相关的ZmNF-YA8基因SNP标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 345

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L)

<400> 1

ccatgcacca tcttttaggc tatgccgacc cctggccttc gtagcctggg gctcagtgtg 60

gcccgtgttg cgctctgccg gaggcctgcg cactcaggcc tagttcgata ggtcatgagt 120

gctccgtaga ccgaggggcg cgcggaccat aaatgcgctg caggtcaggg cggctcgtag 180

gtcatgagtg gtatgcggtt cgaggggttc gtaggtcatg agtgggaagc gaattggtgc 240

tcgcgacgtg gctcgatgtt aggcgtggtt accacgtcca gttatttacg atgggtcagt 300

ctggggccgg gcgtgagatc cactcgagtg gttccgttcc gacac 345

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccatgcacca tcttttaggc 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgtcggaac ggaaccact 19

Claims (7)

1.一种玉米耐盐性相关的ZmNF-YA8基因SNP标记，其特征在于，所述SNP位点位于ZmNF-YA8基因的3’UTR下游5183bp处，存在两种等位变异：CC和TT基因型。

2.根据权利要求1所述玉米耐盐性相关的ZmNF-YA8基因SNP标记，其特征在于，与CC基因型相比，含有TT基因型的玉米自交系苗期耐盐性增强。

3.权利要求1所述玉米耐盐性相关的ZmNF-YA8基因SNP标记在筛选耐盐玉米中的应用。

4.一种用于鉴定耐盐玉米ZmNF-YA8基因SNP标记的引物，其特征在于，所述引物的上下游引物核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

5.一种含有权利要求4所述引物用于检测耐盐玉米的试剂盒。

6.一种耐盐玉米的检测方法，其特征在于，对待检测样品的基因组检测权利要求1所述的SNP标记，若检测为TT基因型，则所述样品为耐盐玉米。

7.根据权利要求6所述耐盐玉米的检测方法，其特征在于，所述待检测样品包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞的组织培养的材料。

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