CN113004431A - 一种光催化降解岩藻多糖的方法及其产物在抗菌中的应用 - Google Patents

一种光催化降解岩藻多糖的方法及其产物在抗菌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种光催化降解岩藻多糖的方法，包括以下步骤：S1、配制浓度为0.5～10mg/ml的岩藻多糖溶液；边加入TiO2、H2O2边搅拌；S2、在光条件下进行光催化降解；S3、于4000～10000rpm下离心5～10min，取上清液，进行透析操作得到透析后上清液；S4、蒸发得浓缩液，再真空冷冻干燥至水分质量百分含量至0.1％～1％，得到低分子量岩藻多糖粉末。本方法降解岩藻多糖的效率高，能在1小时内获得平均分子量低于70KDa的低分子量岩藻多糖，3小时内可以获得平均分子质量约为3kDa的低分子量岩藻多糖，其硫酸基含量为28％；而且对大肠杆菌、金色葡萄球菌、李斯特菌还有抑制作用。

Description

一种光催化降解岩藻多糖的方法及其产物在抗菌中的应用
技术领域
本发明涉及多糖降解技领域，更具体地说，涉及一种光催化降解岩藻多糖的方法及其产物在抗菌中的应用。
背景技术
岩藻多糖(Fucoidan)又名岩藻聚糖硫酸酯，主要来源于褐藻细胞壁。岩藻聚糖硫酸酯通常具有两种类型的主链，其中I型链由α(1→3)连接的岩藻糖构成，而II型链由α(1→3)和α(1→4)交替连接的岩藻糖构成。此外，它们还可能含有半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和糖醛酸等。岩藻多糖具有多种生物功能，如抗炎、抗肿瘤、调整肠道菌群、抗氧化、免疫调节、抗凝血、抗病毒等作用。研究表明，岩藻多糖的分子质量大小对其生物活性有重要影响，主要表现为低分子量的岩藻多糖或岩藻寡糖的生物活性更高，而且生物利用率也更高。因此，非常有必要将岩藻多糖降解为低分子量岩藻多糖或岩藻寡糖进行利用。
目前，常见的岩藻多糖得降解方法包括酸水解法、酶法降解、伽马射线辐照、超声波辅助降解、微波辅助降解等方式。但是，酸水解法的反应条件不够温和，对岩藻多糖硫酸基团破坏较大，影响产物活性；酶法降解效率低，生产成本高；伽马射线辐照、超声波辅助降解、微波辅助降解等方法均对仪器设备有较高要求，大幅提高了多糖降解的成本。
现有常用的降解岩藻多糖的方法有H2O2/铜离子氧化降解法、酸水解法等。其中H2O2/铜离子氧化降解法降解岩藻多糖在反应4小时的条件下，可得到分子量为19.6kDa的岩藻多糖，其硫酸基含量为28.2％；酸水解法降解岩藻多糖在110℃水解2小时的条件下，可得到分子量为7.4kDa的岩藻多糖，其硫酸基含量为3％。H2O2/铜离子氧化降解法虽然对岩藻多糖功能基团(硫酸基团)的破坏小，但是其降解效率较低，操作较为复杂。而酸水解法虽然效率变高，但是对岩藻多糖功能基团(硫酸基团)破坏严重。
光催化降解是指利用辐射、光催化剂在反应体系中产生的活性极强的自由基，再通过自由基与有机之间的加合、取代、电子转移等过程将有机物降解的过程。其原理为光敏半导体材料在一定能量的光辐射照射下,激发产生电子-空穴对,将其周围的O2、H2O转化为·OH、O2-·等自由基,这些自由基以及空穴都具有强氧化性,能将有机物进行氧化分解。这种降解方法清洁，利用太阳能，对环境无污染，且反应温度低，操作简单，对设备要求低，而且不破坏岩藻多糖的硫酸基团。因此本发明旨在利用光催化法对岩藻多糖进行降解，以制备低分子量的岩藻多糖或岩藻寡糖。
发明内容
本发明提供了一种光催化降解岩藻多糖的方法，以解决现有降解方法作用条件不够温和、对多糖结构破坏性较大、多糖降解操作难度大、对仪器设备要求高、成本极大等问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种降解岩藻多糖的方法，包括以下步骤：
S1、将岩藻多糖溶于水中，配制成浓度为0.5～10mg/ml的岩藻多糖溶液；然后边加入质量分数0.5～1％的TiO2、体积分数0～5％的H2O2边搅拌岩藻多糖溶液至均匀分布；
S2、在光条件下进行光催化降解1～10小时，在降解过程中边光照边搅拌，使催化剂均匀分布；
S3、于4000～10000rpm下离心5～10min，取上清液，进行透析操作得到透析后上清液；
S4、在30～60℃下蒸发至其体积减小到原体积的1/3～1/6，得浓缩液，再真空冷冻干燥至水分质量百分含量至0.1％～1％，得到低分子量岩藻多糖粉末。
优选的，所述光催化反应催化剂TiO2的粒径包括10～100nm。
优选的，步骤S2中所述光条件包括300～700W的氙灯。
优选的，步骤S3中所述透析方法为用300～1000Da的透析袋流水透析4～5天，再用去离子水透析3～4天。
优选的，步骤S4中所述真空冷冻干燥的条件包括压力10～20Pa、物料厚度5～10mm、冷阱温度-45～-80℃。
优选的，步骤S4中所述蒸发方法包括旋转蒸发。
所述方法制造的岩藻多糖的应用，用于抑制细菌的生长。
优选的，所述岩藻多糖用于抑制的细菌包括大肠杆菌、金色葡萄球菌、李斯特菌。
本发明的有益效果是：
本发明利用二氧化钛光催化法降解高分子量的岩藻多糖，解决了现有降解方法作用条件不够温和、对多糖结构破坏性较大、多糖降解操作难度大、对仪器设备要求高等问题。
本方法降解岩藻多糖的效率高，能在1小时内获得平均分子量低于70KDa的低分子量岩藻多糖，3小时内可以获得平均分子质量约为3kDa的低分子量岩藻多糖，其硫酸基含量为28％；本方法对岩藻多糖功能基团(硫酸基团)的基本没有破坏，产率高。该方法可利用太阳能，绿色环保，对设备要求低，反应条件简单，操作简便，光催化剂可回收再利用，有效的降低了多糖降解的成本，适合应用于降解岩藻多糖的工业生产中。
本发明获得的岩藻多糖降解产物具有抗菌作用，能够抑制细菌的生长，在5mg/ml浓度下几乎完全抑制了大肠杆菌、金色葡萄球菌、李斯特菌等细菌的生长，效果明显优于采用过氧化氢/铜离子制备的低分子量岩藻多糖。
本发明以二氧化钛作为光催化反应催化剂，加入过氧化氢以加速光催化反应效率，不仅有绿色环保，对设备要求低，反应条件简单，而且操作也简便，且光催化剂可回收等优点。
附图说明
图1是本发明实施例1降解岩藻多糖相对分子质量图；
图2是本发明实施例2降解岩藻多糖相对分子质量图；
图3是本发明实施例3降解岩藻多糖相对分子质量图；
图4是本发明制备的低分子量岩藻多糖抑菌效果对比图。
具体实施方式
一种降解岩藻多糖的方法，包括以下步骤：
S1、将岩藻多糖溶于水中，配制岩藻多糖溶液，溶液浓度为0.5～10mg/ml。向该岩藻多糖溶液中加入溶液质量0.5％～1％、粒径为10～100nm的光催化反应催化剂TiO2，再加入溶液体积0～5％的H2O2以提高光催化反应效率。边加入TiO2、H2O2时边搅拌岩藻多糖溶液，以保证催化剂在岩藻多糖溶液中均匀分布，得到待降解溶液。
S2、将S1中的待降解溶液在模拟太阳光条件下，进行光催化降解。光催化降解反应1～10小时，在降解过程中边光照边搅拌待降解溶液，以保证催化剂均匀的分布于该溶液中。光催化降解反应完成后溶液为降解后溶液。
S3、将S2中的降解后溶液于4000～10000rpm下离心5～10min，取上清液，根据需要，可将所述上清液使用300～1000Da的透析袋流水透析4～5天，去离子水透析3～4天，得到透析后上清液。
S4、将S3中的上清液或透析后上清液干燥即得降解后低分子量粉末(岩藻寡糖的粉末)。
实施例1
一种光催化降解岩藻多糖的方法，包括步骤：
S1、将岩藻多糖溶于水中，配制岩藻多糖溶液，溶液浓度为5mg/ml。取200ml岩藻多糖溶液加入0.2g、粒径为25nm的光催化反应催化剂TiO2。在加入TiO2时边搅拌岩藻多糖溶液，以保证催化剂在岩藻多糖溶液中均匀分布。
S2、将步骤S1中的待降解溶液在模拟太阳光(500W氙灯)下，进行光催化降解。光催化降解反应6小时，在降解过程中边光照边搅拌待降解溶液，以保证催化剂均匀的分布于该溶液中。光催化降解反应完成后溶液为降解后溶液。
S3、将降解后溶液于8000rpm下离心10min，取上清液。将所述上清液使用1000Da的透析袋流水透析4天，去离子水透析3天，得到透析后上清液。
S4、将步骤S3中的透析后上清液在50℃下旋转蒸发，至其体积减小到原体积的1/5，得浓缩液，再将旋转蒸发后浓缩液在冻干箱压力15Pa、物料厚度10mm、冷阱温度-45℃的条件下进行真空冷冻干燥至水分质量百分含量低于1％，得到低分子量岩藻多糖粉末。
如附图1所示，加入0.2g光催化反应催化剂TiO2光催化反应3小时后得到的岩藻多糖其主要组分的相对分子质量为150kDa。加入0.2g光催化反应催化剂TiO2光催化反应6小时后得到的低分子量岩藻多糖干燥后的粉末检测结果如下：硫酸基含量为30％，总糖含量为60％，其主要组分的相对分子质量为17kDa。
实施例2：
一种降解岩藻多糖的方法，包括步骤：
S1、将岩藻多糖溶于水中，配制岩藻多糖溶液，溶液浓度为5mg/ml。取200ml岩藻多糖溶液加入1g、粒径为25nm的光催化反应催化剂TiO2。再加入TiO2时边搅拌岩藻多糖溶液，以保证催化剂在岩藻多糖溶液中均匀分布。
S2、将步骤S1中的待降解溶液在模拟太阳光条件下(500W氙灯)，进行光催化降解。光催化降解反应9小时，在降解过程中边光照边搅拌待降解溶液，以保证催化剂均匀的分布于该溶液中。光催化降解反应完成后溶液为降解后溶液。
S3、将步骤S2中的降解后溶液于8000rpm下离心10min，取上清液。将所述上清液使用1000Da的透析袋流水透析4天，去离子水透析3天，得到透析后上清液。
S4、将步骤S3中的透析后上清液在50℃旋转蒸发，至其体积减小到原体积的1/5，得浓缩液，再将旋转蒸发后浓缩液在冻干箱压力15Pa、物料厚度10mm、冷阱温度-45℃的条件下进行真空冷冻干燥至水分质量百分含量低于1％，得到低分子量岩藻多糖粉末。
如附图2所示，加入1g光催化反应催化剂TiO2光催化反应3小时后得到的岩藻多糖其主要组分的相对分子质量为112kDa。加入1g光催化反应催化剂TiO2光催化反应9小时后得到的低分子量岩藻多糖干燥后的粉末检测结果如下：硫酸基含量为27％，总糖含量为57％，主要组分的相对分子质量为5.1kDa，3.3kDa。
实施例3
一种降解岩藻多糖的方法，包括步骤：
S1、将岩藻多糖溶于水中，配制岩藻多糖溶液，溶液浓度为5mg/ml，取200ml岩藻多糖溶液加入1g、粒径为25nm的光催化反应催化剂TiO2，再加入6.4ml的H2O2以提高光催化反应效率。边加入TiO2、H2O2时边搅拌岩藻多糖溶液，以保证催化剂在岩藻多糖溶液中均匀分布。
S2、将步骤S1中的待降解溶液在模拟太阳光条件下(500W氙灯)，进行光催化降解。光催化降解反应3小时，在降解过程中边光照边搅拌待降解溶液，以保证催化剂均匀的分布于该溶液中。光催化降解反应完成后溶液为降解后溶液。
S3、将步骤S2中的降解后溶液于8000rpm下离心10min，取上清液。将所述上清液使用300Da的透析袋流水透析4天，去离子水透析3天，得到透析后上清液。
S4、将步骤S3中的透析后上清液在50℃下旋转蒸发，至其体积减小到原体积的1/5，得浓缩液，再将旋转蒸发后浓缩液在冻干箱压力15Pa、物料厚度10mm、冷阱温度-45℃的条件下进行真空冷冻干燥至水分质量百分含量低于1％，得到低分子量岩藻多糖粉末。
如附图3所示，加入1g光催化反应催化剂TiO2、6.4ml的H2O2进行光催化反应1小时后得到的岩藻多糖其主要组分的相对分子质量为68kDa。加入1g光催化反应催化剂TiO2、6.4ml的H2O2进行光催化反应3小时后得到的低分子量岩藻多糖干燥后的粉末检测结果如下：硫酸基含量为28％，总糖含量为59％，主要组分的相对分子质量为3.3kDa。
实施例4：光催化降解后岩藻多糖基本指标的测定
1、光催化降解后岩藻多糖相对分子质量的测定
在光催化反应进行时取样品1.5ml待测。将待测样在8000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm水系膜备用。采用高效凝胶渗透色谱法测定光催化降解后岩藻多糖的相对分子质量，选择的凝胶色谱柱是TSK-gel G4000PWxl(7.5mm×30.0cm)，配合示差折光检测器，检测器和柱箱的温度均为30℃。流动相为乙酸铵缓冲液(0.1mol/L，pH 6.0)，流速为0.4mL/min。以葡聚糖(相对分子质量分别为5、12、25、50、150、410和670kDa)为标准，溶于流动相中，进样10μL。以标准曲线计算光催化降解后岩藻多糖样品的相对分子质量。
2、光催化降解后岩藻多糖总糖含量的测定
(1)试剂准备：配置100μg/mL岩藻糖标准溶液：精确称取0.01g干燥后的岩藻糖标准品于100mL容量瓶中，加水定容到其刻度；质量分数为6％的苯酚溶液：将苯酚于60℃水浴加热溶解，取6g苯酚加水至溶液质量为100g，搅拌混匀，现用现配。
(2)岩藻糖含量标准曲线的制备：分别吸取岩藻糖标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，加水定容至1mL，然后分别加入0.5mL、6％苯酚溶液，混合均匀后快速加入2.5mL、质量分数95％的浓硫酸，静置10min，摇匀，室温放置20min后，在490nm下测定其吸光度。以1.0mL去离子水作为空白对照，以岩藻糖含量为横坐标，490nm下的吸光度为纵坐标，绘制岩藻糖含量标准曲线。
(3)样品含量的测定：吸取待测样液1.0mL，加入0.5mL、浓度为6％的苯酚溶液，混合均匀后快速加入2.5mL、质量分数95％的浓硫酸，静置10min，摇匀，室温放置20min后，测定其490nm处的吸光度值，以标准曲线计算样品的多糖含量。每组样品进行两组平行实验。
3、光催化降解后岩藻多糖硫酸基含量的测定
(1)试剂准备：将K2SO4置于105℃烘箱中干燥至恒重，精确称取108.75mg，用1M的HCl定容至100ml容量瓶中，摇匀，得K2SO4标准溶液，即硫酸基的浓度为0.6mg/ml。
(2)标准曲线的制备；分别吸取0.00、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20ml标准溶液于10ml玻璃试管中，用1M的HCl将各管补足至0.2ml，再向每管加入三氯乙酸3.8ml。取0.5g明胶和1.0g的BaCl2溶解在100ml去离子水中，得到BaCl2-明胶比浊液，在360nm处测定其吸光度值，其测得的吸光度值为A1。再向每管加入1.0ml的明胶溶液代替比浊液，测得的吸光度值为A2。重复3次，将得到的结果制作标准曲线，横坐标为硫酸基团毫克数，纵坐标为A＝A1-A2，得到线性回归方程。
(3)样品硫酸基含量的测定：称取4.0mg样品放入盛有2.0ml、1mol/l的HCl的具塞试管中，密封于110℃下水解8h，冷却至室温，8000rpm下离心10min，摇匀，吸取各样品溶液0.2ml，按以上操作方法测定其吸光度值。根据标准曲线计算出各个样品中的硫酸基含量。
实施例5：光催化降解岩藻多糖的产物的抑菌作用
评价实施例3获得的光催化降解岩藻多糖的产物的抑菌作用，并与过氧化氢/铜离子制备的低分子量岩藻多糖相比较。
1光催化降解岩藻多糖：
S1、将岩藻多糖溶于水中，配制岩藻多糖溶液，溶液浓度为5mg/ml。取200ml岩藻多糖溶液加入1g，粒径为25nm的光催化反应催化剂TiO2，再加入6.4ml的H2O2以提高光催化反应效率。一边加入TiO2、H2O2一边搅拌岩藻多糖溶液，以保证催化剂在岩藻多糖溶液中均匀分布。
S2、将步骤S1中的待降解溶液在模拟太阳光条件下(500W氙灯)，进行光催化降解。光催化降解反应3小时，在降解过程中边光照边搅拌待降解溶液，以保证催化剂均匀的分布于该溶液中。光催化降解反应完成后溶液为降解后溶液。
S3、将步骤S2中的降解后溶液于8000rpm下离心10min，取上清液。
S4、将步骤S3中的透析后上清液在50℃下旋转蒸发，至其体积减小到原体积的1/5，得浓缩液，再将旋转蒸发后浓缩液在冻干箱压力15Pa、物料厚度10mm、冷阱温度-45℃的条件下进行真空冷冻干燥至水分质量百分含量低于1％，得到低分子量岩藻多糖粉末。
2过氧化氢/铜离子制备的低分子量岩藻多糖：
S1、称取5g岩藻多糖，溶于125mL蒸馏水，并添加400mg乙酸铜单水合物，待完全溶解后，进行下一步。
S2、利用蠕动泵向步骤1溶液中以4mL/h的流速滴加30％的H2O2溶液，连续滴加4h。采用1M的NaOH溶液控制反应体系的pH值在7.3～7.5，反应温度控制在35℃。
S3、将步骤S2中的降解后溶液反应结束，以8000g离心20min，取上清液，沉淀继续洗涤离心1～2次后，收集所有上清液。
S4、将步骤S3中的上清液用截流分子量为500Da的透析袋透析72h后冻干，得到低分子量岩藻多糖。
3抑菌实验：
1.实验步骤
1.1培养基的配置
LB肉汤培养基(g/L)：蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，NaCl 10g/L，充分溶解，121℃高压灭菌15min。
LB琼脂培养基(g/L)：蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，充分溶解，121℃高压灭菌15min。
MH肉汤培养基(g/L)：牛肉粉2g/L，可溶性淀粉1.5g/L，酸水解酪蛋白17.5g/L，充分溶解，121℃高压灭菌15min。
1.2菌种活化
将革兰氏阴性菌(大肠杆菌)及革兰氏阳性菌(金黄葡萄球菌，单增李斯特菌)接种到LB肉汤中进行复苏，37℃、200r/min培养12h。将复苏好的菌液划线到LB琼脂上，37℃培养24h。挑取单菌落接种到LB肉汤中，37℃、200r/min培养12h，得到菌液稀释至约为1×107CFU/mL备用。
1.3抑菌活性
在含5mg/mL的H2O2/铜离子降解的低分子量岩藻多糖或光催化降解的低分子量岩藻多糖的MH肉汤中，加入稀释好的菌液，使菌液的终浓度约为1×106CFU/mL，糖的终浓度为4.5mg/mL，37℃、200r/min培养24h。测定0h和24h的OD600值，计算培养24h后吸光值变化。以MH肉汤为空白对照，每组三平行。
2实验结果
如附图4所示，4.5mg/mL的H2O2/铜离子降解的低分子量岩藻多糖对三种菌均不具有抑菌作用，而4.5mg/mL光催化降解的低分子量岩藻多糖对三种菌均表现出了几乎完全抑制的作用，说明光催化降解岩藻多糖的产物的抑菌作用比过氧化氢/铜离子制备的低分子量岩藻多糖好。
对比例1：过氧化氢/铜离子氧化法制备低分子量岩藻多糖：
S1、称取5g岩藻多糖，溶于125mL蒸馏水，并添加400mg乙酸铜单水合物，待完全溶解后，进行下一步。
S2、利用蠕动泵向步骤1溶液中以4mL/h的流速滴加30％的H2O2溶液，连续滴加4h。采用1M的NaOH溶液控制反应体系的pH值在7.3～7.5，反应温度控制在35℃。
S3、将步骤S2中的降解后溶液反应结束，以8000g离心20min，取上清液，沉淀继续洗涤离心1～2次后，收集所有上清液。
S4、将步骤S3中的上清液用截流分子量为500Da的透析袋透析72h后冻干，得到低分子量岩藻多糖。
过氧化氢/铜离子制备的低分子量岩藻多糖干燥后的粉末检测结果如下：硫酸基含量为28.2％，主要组分的相对分子质量为19.6kDa。
对比例2：酸水解法制备低分子量岩藻多糖：
实验步骤：
S1、称取5g岩藻多糖样品于水解瓶中，加入150ml、0.2M的三氟乙酸，在110℃下水解2h。
S2、将步骤S1中所述水解液冷却至室温，于45℃条件下旋蒸至干燥，除去三氟乙酸。加入200ml去离子水将旋蒸后固体复溶，得复溶液。
S3、将步骤S2中所述复溶液用截留分子量为3500Da的透析袋透析72h后冻干，得到低分子量岩藻多糖。
酸水解法制备的低分子量岩藻多糖干燥后的粉末检测结果如下：硫酸基含量为3.0％，主要组分的相对分子质量为7.4kDa。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种光催化降解岩藻多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将岩藻多糖溶于水中，配制成浓度为0.5～10mg/ml的岩藻多糖溶液；然后边加入质量分数0.5～1％的TiO2、体积分数0～5％的H2O2边搅拌岩藻多糖溶液至均匀分布；
S2、在光条件下进行光催化降解1～10小时，在降解过程中边光照边搅拌，使催化剂均匀分布；
S3、于4000～10000rpm下离心5～10min，取上清液，进行透析操作得到透析后上清液；
S4、在30～60℃下蒸发至其体积减小到原体积的1/3～1/6，得浓缩液，再真空冷冻干燥至水分质量百分含量至0.1％～1％，得到低分子量岩藻多糖粉末。
2.根据权利要求1所述的降解岩藻多糖的方法，其特征在于，所述光催化反应催化剂TiO2的粒径包括10～100nm。
3.根据权利要求1所述的降解岩藻多糖的方法，其特征在于，步骤S2中所述光条件包括300～700W的氙灯。
4.根据权利要求1所述的降解岩藻多糖的方法，其特征在于，步骤S3中所述透析方法为用300～1000Da的透析袋流水透析4～5天，再用去离子水透析3～4天。
5.根据权利要求1所述的降解岩藻多糖的方法，其特征在于，步骤S4中所述真空冷冻干燥的条件包括压力10～20Pa、物料厚度5～10mm、冷阱温度-45～-80℃。
6.根据权利要求1所述的降解岩藻多糖的方法，其特征在于，步骤S4中所述蒸发方法包括旋转蒸发。
7.一种权利要求1所述方法制造的岩藻多糖的应用，用于抑制细菌的生长。
8.根据权利要求7所述岩藻多糖的应用，用于抑制的细菌包括大肠杆菌、金色葡萄球菌、李斯特菌。
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