CN112986587A - 血清脂质在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂、试剂盒方面的用途 - Google Patents

血清脂质在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂、试剂盒方面的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了血清脂质在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂、试剂盒方面的用途。本发明提供的血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)可以单独或任两个联合或三个联合诊断区分健康人和系统性红斑狼疮患者，诊断准确率高，因而具有开发制备成诊断系统性红斑狼疮的试剂或试剂盒的前景。

Description

血清脂质在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂、试剂盒方面的 用途
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及血清脂质在疾病诊断方面的应用，具体涉及血清脂质在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂、试剂盒方面的用途。
背景技术
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种跟遗传、性激素、感染等多种因素相关的系统性自身免疫病。其以全身多系统多脏器受累、反复的复发与缓解、体内存在大量自身抗体为主要临床特点，患者可表现为环形红斑、精神改变、贫血等症状。
在实际的临床实践中，被广泛用于SLE诊断或疾病活动性的少数标志物仍然局限于抗核抗体、补体、几种自身抗体。
更多的诊断标志物有待开发。近年来“组学”领域的生物标志物作为辅助手段用于预先、准确、灵敏地判断出疾病发生情况，取得了较好的效果。生物标志物诊断可以区分疾病的类型以及疾病所处的阶段，辅助临床治疗。而且以血清标志物为例，该方法具有简便、快速、经济且相对无创的优点而被广泛采用，对患者非常友好。
发明内容
本发明目的在于提供血清脂质在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂、试剂盒方面的用途。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
血清脂质在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂、试剂盒方面的用途，所述血清脂质为PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)中的一个，或任两个组合，或三个组合。
一种诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)或ACar(11:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:2)和LPE(18:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:2)和ACar(11:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质LPE(18:0)和ACar(11:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)的检测试剂。
血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)或ACar(11:0)用于制备反映系统性红斑狼疮的病情严重程度的试剂盒的用途。
有益效果：
1、本发明提供的诊断指标为血清脂质，只需要采取少量血液即可检测，基本无创；
2、本发明提供的血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)可以单独或任两个联合或三个联合诊断区分健康人和系统性红斑狼疮患者，诊断准确率高，因而具有开发制备成诊断系统性红斑狼疮的试剂或试剂盒的前景。
附图说明
图1为PE(16:0/18:2)在健康受试者和系统性红斑狼疮患者血清中的含量水平比较；
图2为LPE(18:0)在健康受试者和系统性红斑狼疮患者血清中的含量水平比较；
图3为ACar(11:0)在健康受试者和系统性红斑狼疮患者血清中的含量水平比较；
图4为PE(16:0/18:2)与SLEDAI评分的关联研究；
图5为LPE(18:0)与SLEDAI评分的关联研究；
图6为ACar(11:0)与SLEDAI评分的关联研究；
图7为PE(16:0/18:2)区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线；
图8为LPE(18:0)区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线；
图9为ACar(11:0)区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线；
图10为PE(16:0/18:2)和LPE(18:0)联合区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线；
图11为PE(16:0/18:2)和ACar(11:0)联合区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线；
图12为LPE(18:0)和ACar(11:0)联合区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线；
图13为PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)联合区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：血清脂质对系统性红斑狼疮的诊断效能
一、实验样本和试剂
收集江苏省中医院115例健康受试者和115例系统性红斑狼疮患者。健康受试者为体检健康的正常人，系统性红斑狼疮患者根据美国风湿病学会系统性红斑狼疮分类标准纳入。各组患者的年龄、性别和体重指数匹配，无显著性差异。按表1将各组受试者或患者随机分为训练集样本和验证集样本。
表1训练集样本和验证集样本样本数量
Figure BDA0002946558380000021
排除标准：①合并有其他风湿科疾病；②合并有心脑血管、肝、肾脏和造血系统等严重原发性疾病；③患有精神疾病不能合作者；④近1个月内参加其它临床试验者；⑤不愿接受本研究者。
主要实验试剂：乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚、异丙醇、甲酸、甲酸铵、甲苯。
二、实验方法
1、血清样本的采集及储存
采集健康受试者和系统性红斑狼疮患者清晨空腹外周血并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-60min，待血液凝固，以2000rpm速度离心10min，小心吸取上层清亮血清液体于无菌冻干管中，标记后放入-80℃冰箱储存备用。
2、UPLC-QE/MS技术测定血清中目标脂质的含量水平
检测仪器：Dionex UltiMate 3000Ultra-Performance Liquid Chromatography(UPLC)system(Santa Clara,CA,USA)，Q Exactive mass spectrometer(Thermo FisherScientific,USA)；
色谱条件：反向Waters Acquity UPLC CSH C18 column(100mm×2.1mm,1.7μm)。柱温为60℃，流速为0.3ml/min。注射体积为1μl。流动相的组成有两个溶剂:A相含5mM甲酸铵和0.1％甲酸的60％ACN-水溶液，B相含5mM甲酸铵和0.1％甲酸的异丙醇：ACN(9：1)。梯度洗脱：0～4.0min，15％B；4.0～5.0min，15～48％B；5.0～22.0min，48～82％B；22.0～23.0min，82～99％B；23.0～24.0min，99％B；24.0～24.2min，99～15％B；24.2～30.0min，15％B；
质谱条件：所有的质谱实验都是使用加热的ESI源在正离子模式和负离子模式下进行的。采用的源和离子转移参数如下：喷雾电压3kV(正极)。鞘气、辅助气体、毛细管温度和加热器温度分别保持在45、10、300℃和306℃。S-Lens射频电平设置为50。Orbitrap质谱仪在全扫描模式(扫描范围：150-2000m/z；自动增益控制(AGC)目标：1E6)下以35,000的分辨率运行，在前10个数据依赖的MS2模式(阶跃归一化碰撞能量：20、40和60；进样时间：50ms；隔离窗口：1.5m/z；AGC目标：1E5)下以8.0秒的动态排除设置以175.00的分辨率运行。
样本处理：将40μl血清与225μl冰甲醇混合。然后将每个样品涡旋10秒后加入750μl的冷MTBE，将混合物涡流10秒，在4℃轨道混合器中振荡10分钟。加入室温LC/MS级水188μl，涡旋20秒后4℃，14000rcf离心2min。上层液体被转移到干净管子，真空离心机中干燥。110mol/L甲醇：甲苯(9：1)重组上相脂质进行超高效液相色谱-定量电喷雾电离质谱(UPLCQE MS)分析。以各样本中目标血清脂质的检测峰面积代表其含量水平。
3、数据处理方法
训练集中，运用Logistic回归建立目标血清脂质回归方程，产生一组新变量logit[P]，对该新变量进行ROC曲线分析，并根据ROC曲线得到最佳cut-off值；验证集中，根据SPSS 25.0软件给出的预测概率计算目标血清脂质的诊断准确率。
三、实验结果
1、目标血清脂质在健康受试者和系统性红斑狼疮患者血清中含量水平的差异
训练集中，脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)、ACar(11:0)在健康受试者和系统性红斑狼疮患者血清中的含量水平存在明显差异，分别如图1～3所示。
2、目标血清脂质与系统性红斑狼疮临床诊断的关联研究
将PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)、ACar(11:0)含量水平与系统性红斑狼疮疾病活动性指数(SLEDAI)评分进行spearman关联分析(分别如图4～6所示)，结果差异非常显著(P<0.0001)，说明目标脂质的含量水平可反映SLE病情的严重程度。
3、目标血清脂质对健康受试者和系统性红斑狼疮的诊断区分效能
3.1训练集构建逻辑回归方程
(1)PE(16:0/18:2)独立诊断
在训练集中，以各样本的血清脂质PE(16:0/18:2)含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝0.004+2.432X1，其中：X1为PE(16:0/18:2)的含量水平。
(2)LPE(18:0)独立诊断
在训练集中，以各样本的血清脂质LPE(18:0)含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.052+2.573X1，其中：X1为LPE(18:0)的含量水平。
(3)ACar(11:0)独立诊断
在训练集中，以各样本的血清脂质ACar(11:0)含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.01-0.864X1，其中：X1为ACar(11:0)的含量水平。
(4)PE(16:0/18:2)和LPE(18:0)联合诊断
在训练集中，以各样本的血清脂质PE(16:0/18:2)和LPE(18:0)含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝0.03+2.031X1+1.432X2，其中：X1为PE(16:0/18:2)的含量水平，X2为LPE(18:0)的含量水平。
(5)PE(16:0/18:2)和ACar(11:0)联合诊断
在训练集中，以各样本的血清脂质PE(16:0/18:2)和ACar(11:0)含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.006+2.481X1-0.956X2，其中：X1为PE(16:0/18:2)含量水平，X2为ACar(11:0)的含量水平。
(6)LPE(18:0)和ACar(11:0)联合诊断
在训练集中，以各样本的血清脂质LPE(18:0)和ACar(11:0)含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝-0.073+2.45X1-0.715X2，其中：X1为LPE(18:0)的含量水平，X2为ACar(11:0)的含量水平。
(7)PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)联合诊断
在训练集中，以各样本的血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)含量水平为自变量，以组别(健康受试者、系统性红斑狼疮)为应变量，构建得到回归方程logit[p]＝0.013+2.119X1+1.249X2-0.826X3，其中：X1为PE(16:0/18:2)的含量水平，X2为LPE(18:0)的含量水平，X3为ACar(11:0)的含量水平。
3.2训练集确定最佳鉴别阈值
(1)PE(16:0/18:2)独立诊断
在训练集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/18:2)的含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图7所示)，AUC可达0.826，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.569。
(2)LPE(18:0)独立诊断
在训练集中，将各样本的血清脂质LPE(18:0)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图8所示)，AUC可达0.825，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.532。
(3)ACar(11:0)独立诊断
在训练集中，将各样本的血清脂质ACar(11:0)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图9所示)，AUC可达0.628，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.494。
(4)PE(16:0/18:2)和LPE(18:0)联合诊断
在训练集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/18:2)和LPE(18:0)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图10所示)，AUC可达0.858，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.464。
(5)PE(16:0/18:2)和ACar(11:0)联合诊断
在训练集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/18:2)和ACar(11:0)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图11所示)，AUC可达0.852，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.560。
(6)LPE(18:0)和ACar(11:0)联合诊断
在训练集中，将各样本的血清脂质LPE(18:0)和ACar(11:0)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图12所示)，AUC可达0.841，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.498。
(7)PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)联合诊断
在训练集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)含量水平代入上述回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图12所示)，AUC可达0.869，具有较高的准确性。根据ROC曲线得到诊断区分健康受试者和系统性红斑狼疮的最佳cut-off值0.536。
3.3验证集验证诊断准确率
(1)PE(16:0/18:2)独立诊断
在验证集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/18:2)含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率94.8％(73/77)。
(2)LPE(18:0)独立诊断
在验证集中，将各样本的血清脂质LPE(18:0)含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率94.8％(73/77)。
(3)ACar(11:0)独立诊断
在验证集中，将各样本的血清脂质ACar(11:0)含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率96.1％(74/77)。
(4)PE(16:0/18:2)和LPE(18:0)联合诊断
在验证集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/18:2)和LPE(18:0)含量水平数据导入SPSS25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率97.4％(75/77)。
(5)PE(16:0/18:2)和ACar(11:0)联合诊断
在验证集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/18:2)和ACar(11:0)含量水平数据导入SPSS25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率97.4％(75/77)。
(6)LPE(18:0)和ACar(11:0)联合诊断
在验证集中，将各样本的血清脂质LPE(18:0)和ACar(11:0)含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率94.8％(73/77)。
(7)PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)联合诊断
在验证集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)含量水平数据导入SPSS 25.0软件，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并获得预测概率，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分健康受试者vs系统性红斑狼疮的准确率97.4％(75/77)。
实施例2：系统性红斑狼疮诊断试剂盒
一种诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)或ACar(11:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:2)和LPE(18:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:2)和ACar(11:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质LPE(18:0)和ACar(11:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)的检测试剂。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (3)

1.血清脂质在制备诊断系统性红斑狼疮的试剂、试剂盒方面的用途，其特征在于：所述血清脂质为PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)中的一个，或任两个组合，或三个组合。
2.一种诊断系统性红斑狼疮的试剂盒，其特征在于：含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)或ACar(11:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:2)和LPE(18:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:2)和ACar(11:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质LPE(18:0)和ACar(11:0)的检测试剂，或含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)和ACar(11:0)的检测试剂。
3.血清脂质PE(16:0/18:2)、LPE(18:0)或ACar(11:0)用于制备反映系统性红斑狼疮的病情严重程度的试剂盒的用途。
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