CN112980903B - 一种微波辅助生物酶催化反应的验证方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微波辅助生物酶催化反应的验证方法，通过采用不同纳米金的粒径，使淀粉‑纳米金复合物和脂肪酶‑纳米金杂合物作为微波吸收体或透射体，将微波辐射分别以“致热效应”与“非热效应”强化脂肪酶催化反应，验证微波“致热效应”和“非热效应”对强化酶促反应的影响。最终揭示了微波辐射“非热效应”和“致热效应”与底物结构之间的强化作用关系以及对酶促反应的影响，从而阐明纳米金辅助微波强化脂肪酶催化反应的机理，进而达到了加速实现微波强化酶催化合成的工业化的技术效果。
Description
技术领域
本发明属于生物酶技术领域，具体地说涉及一种微波辅助生物酶催化反应的验证方法。
背景技术
酶催化是现代有机合成化学中一种强有力的催化手段，微波技术也已成功应用于强化多种有机化学反应，微波辅助强化有机合成反应不但可大幅提高反应的速率与产率，还很大程度上节约了能耗。随着化学研究的深入以及学科的交叉发展，将微波强化技术与酶催化技术结合起来共同促进有机反应，会产生单独应用时不能观察到的效果。从20世纪90年代起，研究人员已经将微波辐射应用于有机相酶催化反应中，并发现适当的微波辐射对反应的促进作用优于传统的加热方式，不仅可以提高酶催化反应的反应速率，还可以拓宽酶对底物的适应性，从而提高反应的表现平衡产率，甚至改善反应的立体选择性。但是目前尚无研究结果表明具体是何作用导致微波辐射改变了酶促化学反应的结果，对于这一点，学术界存在两种不同的观点，一种是“致热效应”，另一种是与温度无关的“非热效应”。微波辐射技术加快、改善酶催化反应的真正原理是什么，微波辐射技术在酶促反应过程中是否具有“非热效应”是备受争议的，因此当前亟待进一步深入具体的研究微波强化酶催化反应，明确微波辐射对酶促反应是否具有“非热效应”以及“非热效应”的存在是否具有普遍性，这对揭示微波辐射与酶催化反应之间的强化作用关系，阐明强化反应机理是至关重要的。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于目前尚无可明确微波辐射对生物酶催化反应促进作用原理的制备工艺，从而提出一种新型微波辅助生物酶催化反应的验证方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
本发明提供一种微波辅助生物酶催化反应的验证方法，其包括如下步骤：
S1、将淀粉与含Au(III)化合物或金粒子按照1:0.06-0.3的质量比混合制备淀粉-金粒子复合物；
S2、向氯金酸溶液中添加南极假丝酵母脂肪酶，反应制备脂肪酶-金粒子杂合物，所述氯金酸与所述南极假丝酵母脂肪酶的质量比为1:3-4.5；
S3、将步骤S1得到的淀粉-金粒子复合物与油酸混合，并向得到的混合物中加入所述脂肪酶-金粒子杂合物，所述油酸、淀粉-金粒子复合物、脂肪酶-金粒子杂合物的质量比为5-10:3:4.5，并在微波辅助的条件下进行酶催化反应，得到反应产物。
作为优选，所述淀粉与所述含Au(III)化合物或金粒子混合前，还包括将淀粉活化的步骤。
作为优选，所述淀粉与所述含Au(III)化合物或金粒子混合后，还包括淀粉活化的步骤。
作为优选，所述步骤S3后还包括：
S4、洗涤所述反应物，去除未反应的油酸；
S5、去除脂肪酶-金粒子杂合物，得到油酸淀粉酯产物。
作为优选，所述步骤S3中，所述微波辅助的条件为：功率200-400W，温度55℃，反应时间为30min。
作为优选，所述含Au(III)化合物为氯金酸，所述氯金酸的质量浓度为0.001％-0.01％；所述金粒子的平均粒径为1nm-10μm。
作为优选，所述步骤S1中，所述淀粉与加热至沸腾的氯金酸反应，制备淀粉-金粒子复合物。
作为优选，所述步骤S4中，采用温度为65℃的乙醇洗涤所述反应物，去除未反应的油酸。
作为优选，所述步骤S5中，采用80目筛过滤去除所述脂肪酶-金粒子杂合物。
作为优选，所述步骤S2中，氯金酸与南极假丝酵母脂肪酶混合后，在35℃下，恒温振荡反应36h。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明所述的微波辅助生物酶催化反应的验证方法，通过采用不同金粒子的粒径，使淀粉-金粒子复合物和脂肪酶-金粒子杂合物作为微波吸收体或微波透射体，将微波辐射分别以“致热效应”与“非热效应”强化脂肪酶催化反应验证微波“致热效应”和“非热效应”对强化酶促反应的影响。并分别从微波辐射“非热效应”和“致热效应”强化的角度建立脂肪酶结构与其催化活性的关系，说明微波辐射“非热效应”和“致热效应”对底物和产物结构的影响、揭示微波辐射“非热效应”和“致热效应”与底物结构之间的强化作用关系以及对酶促反应的影响，从而阐明金粒子辅助微波强化脂肪酶催化反应的机理，通过探讨反应体系中金粒子在淀粉分子螺旋结构和脂肪酶分子结构或分子间的分布位置及均匀性、微波功率及作用方式对脂肪酶高级结构、底物分子结构及分子间作用力和产物立体结构的影响，结合酶促反应的宏观表现，建立微波辐射“致热效应”和“非热效应”与底物之间、与产物之间和与脂肪酶之间的相互作用关系。进而可加速实现微波强化酶催化合成的工业化，为有机合成、立体异构拆分以及不对称合成等提供一种符合“绿色化学”和环境友好型发展方向的研究和合成工具。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例所采用的玉米淀粉的核磁共振氢谱图；
图2是本发明实施例1制得的油酸淀粉酯的核磁共振氢谱图；
图3是本发明实施例所述的油酸淀粉酯的生成原理图；
图4是本发明常规油浴条件下生成的油酸淀粉酯与全透射油酸淀粉酯、全吸收油酸淀粉酯的红外光谱图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种微波辅助生物酶催化反应的验证方法，该方法用于揭示微波辐射在酶促催化反应中的作用，确定微波辐射改善酶催化反应的原理。
本实施例提供的微波辅助生物酶催化反应的验证方法包括如下步骤：
S1、将玉米淀粉与不同浓度的加热至沸腾的氯金酸按照1:0.06的质量比混合，所述氯金酸的质量浓度为0.001％-0.01％，反应15s后制得淀粉-金粒子复合物，制得的金粒子平均粒径为1nm-10μm。
S2、向质量浓度为0.01％的氯金酸溶液中加入南极假丝酵母脂肪酶，在恒温振荡器中于35℃反应36h，其中，氯金酸与南极假丝酵母脂肪酶的质量比为1:3，得到脂肪酶-金粒子杂合物，杂合物中，金粒子的平均粒径为1nm-10μm。
S3、将步骤S1得到的淀粉-金粒子复合物与油酸混合，并向得到的混合物中加入步骤S2得到的脂肪酶-金粒子杂合物，其中，油酸与淀粉-金粒子复合物、脂肪酶-金粒子杂合物的质量比为5:3:4.5，在功率为200W、温度为55℃的条件下反应30min，进行酶催化反应，得到酶催化反应产物。
S4、用65℃的热乙醇洗涤酶催化反应产物，去除未反应的油酸，干燥至恒重。
S5、采用80目筛过滤去除脂肪酶-金粒子杂合物，得到油酸淀粉酯。
实施例2
本实施例提供一种微波辅助生物酶催化反应的验证方法，其包括如下步骤：
S1、将玉米淀粉与不同浓度的加热至沸腾的氯金酸按照1:0.3的质量比混合，所述氯金酸的质量浓度为0.001％-0.01％，反应15s后制得淀粉-金粒子复合物，制得的金粒子平均粒径为1nm-10μm。
S2、向质量浓度为0.01％的氯金酸溶液中加入南极假丝酵母脂肪酶，在恒温振荡器中于35℃反应36h，其中，氯金酸与南极假丝酵母脂肪酶的质量比为1:4.5，得到脂肪酶-金粒子杂合物，杂合物中，金粒子的平均粒径为1nm-10μm。
S3、将步骤S1得到的淀粉-金粒子复合物与油酸混合，并向得到的混合物中加入步骤S2得到的脂肪酶-金粒子杂合物，其中，油酸与淀粉-金粒子复合物、脂肪酶-金粒子杂合物的质量比为10:3:4.5，在功率为400W、温度为55℃的条件下反应30min，进行酶催化反应，得到酶催化反应产物。
S4、用65℃的热乙醇洗涤酶催化反应产物，去除未反应的油酸，干燥至恒重。
S5、采用80目筛过滤去除脂肪酶-金粒子杂合物，得到油酸淀粉酯。
实施例3
本实施例提供一种微波辅助生物酶催化反应的验证方法，其包括如下步骤：
S1、将活化后的玉米淀粉与不同浓度的加热至沸腾的氯金酸按照1:0.15的质量比混合，所述氯金酸的质量浓度为0.001％-0.01％，反应15s后制得淀粉-金粒子复合物，制得的金粒子平均粒径为1nm-10μm。
S2、向质量浓度为0.01％的氯金酸溶液中加入南极假丝酵母脂肪酶，在恒温振荡器中于35℃反应36h，其中，氯金酸与南极假丝酵母脂肪酶的质量比为1:4，得到脂肪酶-金粒子杂合物，杂合物中，金粒子的平均粒径为1nm-10μm。
S3、将步骤S1得到的淀粉-金粒子复合物与油酸混合，并向得到的混合物中加入步骤S2得到的脂肪酶-金粒子杂合物，其中，油酸与淀粉-金粒子复合物、脂肪酶-金粒子杂合物的质量比为7:3:4.5，在功率为300W、温度为55℃的条件下反应30min，进行酶催化反应，得到酶催化反应产物。
S4、用65℃的热乙醇洗涤酶催化反应产物，去除未反应的油酸，干燥至恒重。
S5、采用80目筛过滤去除脂肪酶-金粒子杂合物，得到油酸淀粉酯。
实施例4
本实施例提供一种微波辅助生物酶催化反应的验证方法，其包括如下步骤：
S1、将活化后的玉米淀粉与不同浓度的加热至沸腾的氯金酸按照1:0.2的质量比混合，所述氯金酸的质量浓度为0.001％-0.01％，反应15s后制得淀粉-金粒子复合物，制得的金粒子平均粒径为1nm-10μm。
S2、向质量浓度为0.01％的氯金酸溶液中加入南极假丝酵母脂肪酶，在恒温振荡器中于35℃反应36h，其中，氯金酸与南极假丝酵母脂肪酶的质量比为1:3.8，得到脂肪酶-金粒子杂合物，杂合物中，金粒子的平均粒径为1nm-10μm。
S3、将步骤S1得到的淀粉-金粒子复合物与油酸混合，并向得到的混合物中加入步骤S2得到的脂肪酶-金粒子杂合物，其中，油酸与淀粉-金粒子复合物、脂肪酶-金粒子杂合物的质量比为8:3:4.5，在功率为350W、温度为55℃的条件下反应30min，进行酶催化反应，得到酶催化反应产物。
S4、用65℃的热乙醇洗涤酶催化反应产物，去除未反应的油酸，干燥至恒重。
S5、采用80目筛过滤去除脂肪酶-金粒子杂合物，得到油酸淀粉酯。
实施例5
本实施例提供一种微波辅助生物酶催化反应的验证方法，其包括如下步骤：
S1、将活化后的玉米淀粉与金粒子溶液按照1:0.06的质量比混合，制得淀粉-金粒子复合物，金粒子溶液中所述金粒子的平均粒径为1nm-10μm。
S2、向质量浓度为0.01％的氯金酸溶液中加入南极假丝酵母脂肪酶，在恒温振荡器中于35℃反应36h，其中，氯金酸与南极假丝酵母脂肪酶的质量比为1:3，得到脂肪酶-金粒子杂合物，杂合物中，金粒子的平均粒径为1nm-10μm。
S3、将步骤S1得到的淀粉-金粒子复合物与油酸混合，并向得到的混合物中加入步骤S2得到的脂肪酶-金粒子杂合物，其中，油酸与淀粉-金粒子复合物、脂肪酶-金粒子杂合物的质量比为5:3:4.5，在功率为200W、温度为55℃的条件下反应30min，进行酶催化反应，得到酶催化反应产物。
S4、用65℃的热乙醇洗涤酶催化反应产物，去除未反应的油酸，干燥至恒重。
S5、采用80目筛过滤去除脂肪酶-金粒子杂合物，得到油酸淀粉酯。
实施例6
本实施例提供一种微波辅助生物酶催化反应的验证方法，其包括如下步骤：
S1、将玉米淀粉与金粒子溶液按照1:0.3的质量比混合，制得淀粉-金粒子复合物，金粒子溶液中所述金粒子的平均粒径为1nm-10μm。
S2、向质量浓度为0.01％的氯金酸溶液中加入南极假丝酵母脂肪酶，在恒温振荡器中于35℃反应36h，其中，氯金酸与南极假丝酵母脂肪酶的质量比为1:4.5，得到脂肪酶-金粒子杂合物，杂合物中，金粒子的平均粒径为1nm-10μm。
S3、将步骤S1得到的淀粉-金粒子复合物与油酸混合，并向得到的混合物中加入步骤S2得到的脂肪酶-金粒子杂合物，其中，油酸与淀粉-金粒子复合物、脂肪酶-金粒子杂合物的质量比为10:3:4.5，在功率为400W、温度为55℃的条件下反应30min，进行酶催化反应，得到酶催化反应产物。
S4、用65℃的热乙醇洗涤酶催化反应产物，去除未反应的油酸，干燥至恒重。
S5、采用80目筛过滤去除脂肪酶-金粒子杂合物，得到油酸淀粉酯。
实施例7
本实施例提供一种微波辅助生物酶催化反应的验证方法，其包括如下步骤：
S1、将活化后的玉米淀粉与金粒子溶液按照1:0.3的质量比混合，制得淀粉-金粒子复合物，金粒子溶液中所述金粒子的平均粒径为1nm-10μm。
S2、向质量浓度为0.01％的氯金酸溶液中加入南极假丝酵母脂肪酶，在恒温振荡器中于35℃反应36h，其中，氯金酸与南极假丝酵母脂肪酶的质量比为1:4.5，得到脂肪酶-金粒子杂合物，杂合物中，金粒子的平均粒径为1nm-10μm。
S3、将步骤S1得到的淀粉-金粒子复合物与油酸混合，并向得到的混合物中加入步骤S2得到的脂肪酶-金粒子杂合物，其中，油酸与淀粉-金粒子复合物、脂肪酶-金粒子杂合物的质量比为10:3:4.5，在功率为400W、温度为55℃的条件下反应30min，进行酶催化反应，得到酶催化反应产物。
S4、用65℃的热乙醇洗涤酶催化反应产物，去除未反应的油酸，干燥至恒重。
S5、采用80目筛过滤去除脂肪酶-金粒子杂合物，得到油酸淀粉酯。
实验例
1、油酸淀粉酯的形成
图1为淀粉的核磁共振氢谱图，谱图中，δ3.3-5.6产生的吸收峰为淀粉分子中氢核的吸收峰。
图2为采用实施例1所述的方法制得的油酸淀粉酯的核磁共振氢谱图，图中，发生重叠的较宽的吸收峰为淀粉中氢核的吸收峰，δ0.5-2.3范围内的峰为油酸上氢原子的吸收峰。而在δ6以后没有出现吸收峰说明油酸淀粉酯中没有残留的油酸，这也进一步证明了用乙醇可以有效地除去未反应的油酸，生成了油酸淀粉酯。
2、微波辐射在酶催化反应中的作用机理验证
通过调节不同的氯金酸浓度以调节金粒子的粒径，或直接采用不同粒径的金粒子，形成淀粉-金粒子复合物和脂肪酶-金粒子杂合物，其中金粒子粒径大的(0.1μm-10μm)形成金粒子微波透射体，金粒子粒径较小的(1-100nm)形成金粒子微波吸收体，形成微波透射体与吸收体的原理如图3所示。微波辐射对微观尺度的金粒子具有选择性加热的特点，从而产生热点效应，热点效应的大小与金颗粒粒径大小有关，金颗粒在一定粒径范围内微波对其产生的热点效应与粒径大小呈正比。但金属颗粒进入纳米量级(1-100nm)时，才具备吸收微波的能力，且微波对金属的穿透深度一般为0.1-10μm。因此，当金粒子的粒径在接近微米级别时，定存在一个临界值或临界区域，此时金粒子不再吸收微波，微波可以几乎无损耗的穿透微金粒子，形成微波透射体。
测试常规通过油浴方式制备油酸淀粉酯和不同金粒子粒径的微波透射体和微波吸收体的红外光谱图，结果如图4所示，图中，曲线1代表通过常规油浴反应制备的油酸淀粉酯的红外光谱图，曲线2为大粒径金粒子形成的全透射淀粉-金粒子复合物和脂肪酶-金粒子杂合物制得的油酸淀粉酯的红外光谱图，曲线3为小金粒子粒径形成的全吸收淀粉金粒子复合物和脂肪酶-金粒子杂合物制得的油酸淀粉酯的红外光谱图，从图中可以看出，无论是油浴条件的制备方法，还是本发明通过制备不同粒径金粒子，从而形成微波全透射体和微波吸收体，进一步制备得到油酸淀粉酯都形成了酯键，说明本发明所述的方法是可行的，即：验证了微波可以通过“致热效应”和“非热效应”强化脂肪酶的催化反应，是一种新型探究微波生物学效应的方法。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (4)
1.一种微波辅助生物酶催化反应的验证方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将玉米淀粉与加热至沸腾的含Au(III)化合物按照1:0.06的质量比混合反应15s，制备淀粉-金粒子复合物，所述含Au(III)化合物为氯金酸，所述氯金酸的质量浓度为0.001％-0.01％；
S2、向质量浓度为0.01％的氯金酸溶液中添加南极假丝酵母脂肪酶，在35℃下，恒温振荡反应36h，反应制备脂肪酶-金粒子杂合物，所述氯金酸与所述南极假丝酵母脂肪酶的质量比为1:3；
S3、将步骤S1得到的淀粉-金粒子复合物与油酸混合，并向得到的混合物中加入所述脂肪酶-金粒子杂合物，所述油酸、淀粉-金粒子复合物、脂肪酶-金粒子杂合物的质量比为5-10:3:4.5，并在微波辅助的条件下进行酶催化反应，得到反应产物；其中，所述微波辅助的条件为：功率200W，温度55℃，反应时间为30min。
2.根据权利要求1所述的微波辅助生物酶催化反应的验证方法，其特征在于，所述步骤S3后还包括：
S4、洗涤所述反应产物，去除未反应的油酸；
S5、去除脂肪酶-金粒子杂合物，得到油酸淀粉酯产物。
3.根据权利要求2所述的微波辅助生物酶催化反应的验证方法，其特征在于，所述步骤S4中，采用温度为65℃的乙醇洗涤所述反应产物，去除未反应的油酸。
4.根据权利要求3所述的微波辅助生物酶催化反应的验证方法，其特征在于，所述步骤S5中，采用80目筛过滤去除所述脂肪酶-金粒子杂合物。
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