CN112979522A - 一种雨生红球藻中虾青素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溶剂浸提法提取雨生红球藻中虾青素的方法，首先利用超声波细胞破碎仪可以有效的对雨生红球藻细胞壁进行破除，再利用有机溶剂对虾青素进行提取，通过针对性调整改进提取溶剂、提取时间、提取温度、提取次数、料液比等，使虾青素的提取效率显著提高，综合效益比强，本发明相较现有制备方法具有稳定性好、操作简单、制备时间短，提取效率高、可避免虾青素被氧化降解等优点，在工业生产中易于实现，值得推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体的为一种雨生红球藻中虾青素的提取方法。
背景技术
虾青素(C40H52O4，3,3'-二羟基-β，β-胡萝卜素-4,4'-二酮)是一种脂溶性酮式类胡萝卜素，属于萜烯类化合物。虾青素是一种暗红色结晶固体，沸点为774℃，熔点为216℃，相对分子量为596.84，不溶于水，可溶于大多数有机溶剂。虾青素的骨架是通过八个异戊二烯分子的连续缩合形成的，并包含11个共轭双键。作为一种强抗氧化剂，比辅酶Q10或维生素E强，活性比维生素C高65倍。虾青素具有很多功能，在很多方面拥有广阔的应用市场，目前已被应用于水产养殖，营养保健和化妆品工业以及食品补充剂。开发增强免疫系统功能、抗癌、抗炎等高级保健食品和药品的产品，作为水产养殖的着色剂和营养物质(饲料添加剂)，作为蛋禽和家畜的饲料添加剂的优势越来越明显，需求也越来越高。雨生红球藻(Haematococcuspluvias)是一种单细胞绿色淡水藻，属绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。
藻类中制备虾青素存在成本高、杂质多、提取困难等问题。目前，天然虾青素的提取方法主要有有机溶剂浸提法、微波辅助萃取法、超临界CO2萃取法、酶解法、碱提法等。工业上主要采取有机溶剂提取法，具有操作简单、成本低、溶剂易回收等优点。然而，这些有机溶剂固有的毒性也给这种方法带来了不利的影响，溶剂在萃取物中过多的残留会产生食用安全问题。单一的有机溶剂萃取法效率低，萃取时间长，通常会结合其它萃取方法。如何降低萃取物中的溶剂残留并保持良好的萃取效果是目前这种方法面临的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种雨生红球藻中虾青素的提取方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种雨生红球藻中虾青素的提取方法，包括以下提取步骤：
S1：通过超声波细破碎仪对雨生红球藻进行超声破碎，超声波细破碎仪的功率为500-700W，破碎时间为10-30min，得到藻液；
S2：移取藻液，加入提取溶剂，升温提取，提取完成后将藻液进行离心，收集上清液；
S3：通过紫外分光光度计于检测波长490nm，测定上清液中虾青素的含量。
作为本发明进一步优选，步骤S2中提取虾青素时藻液与提取溶剂的取用体积比为1:7。
作为本发明进一步优选，步骤S2中所用的提取溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、正丁醇、二甲亚砜中的一种及混合溶液。
作为本发明进一步优选，步骤S2中所用的混合溶剂为正丁醇与丙酮的混合溶液，其中，正丁醇与丙酮的体积比为1-7:1-5。
作为本发明进一步优选，步骤S2中提取虾青素的温度为35-75℃。
作为本发明进一步优选，步骤S2中提取虾青素的时间为25-65min。
作为本发明进一步优选，步骤S2中提取虾青素的次数为1-4次。
作为本发明进一步优选，步骤S2虾青素提取全过程以氮气保护方式进行提取，防止虾青素的氧化。
本发明的有益效果在于：本发明以合适体积比的正丁醇与丙酮的混合溶液作为提取试剂，针对性优化提取溶剂、提取时间、提取温度、提取次数、料液比等，大大提高了雨生红球藻中虾青素的提取效率，整个制备方法具有稳定性好、操作简单、制备时间短，提取效率高、可避免虾青素被氧化降解等优点，在工业生产中易于实现，值得推广应用。
附图说明
图1为小鼠肝脏中超氧化物歧化酶的含量；
图2为小鼠肝脏中丙二醛的含量；
图3为小鼠肝脏中谷胱甘肽的含量；
图4为小鼠肝脏中过氧化氢酶的含量。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
实验材料：雨生红球藻来自于中源盛生物科技研究院有限公司，虾青素标准品采购于上海源叶生物科技有限公司，丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯等，均为分析纯，采购于天津大茂化学试剂厂。
实验方法：准确称取一定量的雨生红球藻，通过超声波细破碎仪(600W、25min)对雨生红球藻进行超声破碎，得到藻液；移取适量藻液，加入提取溶剂，在一定温度下对虾青素进行提取，提取完成后将提取液进行离心，收集上清液；通过紫外分光光度计测定上清液中虾青素的含量。且，整个提取过程处于氮气氛围下操作，防止氧化。
按以下公式计算虾青素含量：
C(g/kg)＝(A490nm×K)/(160×M0)
其中，A490nm是虾青素在490nm波长处的吸光度值，K是稀释倍数，M0是称取的雨生红球藻的质量。
实施例2：
在实施例1的基础之上，移取适量藻液，加入一定量不同的提取溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇以及正丁醇与丙酮的体积比为5:1的混合溶剂)，使得藻液与提取溶剂的体积比为1:5，在55℃的条件下提取45min，提取次数为3次，同时进行三组平行试验，结束后测定490nm处的吸光度。溶剂对虾青素提取量的影响见表1：
表1
由表1可以看出不同的溶剂对虾青素提取量的影响明显不同，其中正丁醇与丙酮的混合溶剂可以显著提高虾青素的提取量，提取量可以达到38.6mg/g。
实施例3：
在实施例1与实施例2的基础之上，移取适量藻液，加入一定量不同比例的混合溶剂(正丁醇与丙酮的体积比7:1，5:1，3:1，1:1，1:3，1:5和1:7)，使得藻液与提取溶剂的体积比为1:5，在55℃的条件下提取45min，提取次数为3次，同时进行三组平行试验，结束后测定490nm处的吸光度。混合溶剂的比例对虾青素提取量的影响见表2：
表2
由表2可以看出，正丁醇与丙酮的体积比对虾青素的提取有着重要作用，正丁醇与丙酮的体积比过高或过低时都不利于虾青素的提取，当正丁醇与丙酮的体积比为5:1时，此时虾青素的提取量达到最大值，为37.8mg/g。
实施例4：
在实施例1的基础之上，移取适量藻液，加入一定量正丁醇与丙酮的体积比为5:1的混合溶剂，使得藻液与提取溶剂的体积比分别比为1:1，1:3，1:5和1:7，在55℃的条件下提取45min，提取次数为3次，同时进行三组平行试验，结束后测定490nm处的吸光度。料液比对虾青素提取量的影响见表3：
表3
由表3可以看出，随着提取溶剂的倍数增加，虾青素的提取率也相应的提高，当提取溶剂添加量为5倍时，也就是料液比＝1:5时，虾青素的提取率达到最大，再提高溶剂的倍数，虾青素的提取效果明显变化不大，从浸提效果，试剂节约，操作过程和降低浓缩负荷的方面加以考虑，溶剂用量不宜过大，选用1:5的料液比最为合适。
实施例5：
在实施例1的基础之上，移取适量藻液，加入一定量正丁醇与丙酮的体积比为5:1的混合溶剂，使得藻液与提取溶剂的体积比为1:5，在不同的温度条件下(35℃，45℃，55℃，65℃和75℃)提取45min，提取次数为3次，同时进行三组平行试验，结束后测定490nm处的吸光度。提取温度对虾青素提取量的影响见表4：
表4
虾青素的提取对温度有一定的要求，60℃以上虾青素开始受热破坏。由表4可以看出，在60℃以下温度对虾青素的提取影响不大，对其提取量普遍在30mg/g以上，55℃时达到最大值35.7mg/g，温度继续提高，提取量逐渐下降。因此，55℃时是虾青素提取的最佳温度。
实施例6：
在实施例1的基础之上，移取适量藻液，加入一定量正丁醇与丙酮的体积比为5:1的混合溶剂，使得藻液与提取溶剂的体积比为1:5，在55℃条件下提取不同的时间(25min，35min，45min，55min和65min)，提取次数为3次，同时进行三组平行试验，结束后测定490nm处的吸光度。提取时间对虾青素提取量的影响见表5：
表5
由表5可以看出，随提取时间的增加虾青素提取量随之增大，在提取时间达到45min后，虾青素的提取量增势大幅放缓。对比45min的提取量，55min和65min的提取量增加不明显，综合考虑时间和提取成本，选择提取45min为最佳雨生红球藻虾青素提取时间。
实施例7：
在实施例1的基础之上，移取适量藻液，加入一定量正丁醇与丙酮的体积比为5:1的混合溶剂，使得藻液与提取溶剂的体积比为1:5，在55℃条件下提取45min，提取不同次数(分别为1、2、3、4次)，同时进行三组平行试验，结束后测定490nm处的吸光度。提取次数对虾青素提取量的影响见表6：
表6
对于不同提取次数对虾青素提取的影响是以提取量作为衡量标准，由表6可以看出利用提取溶剂提取3次以后，虾青素的提取量就达到了38.6mg/g。第4次的提取量为38.9mg/g，第5次的提取量为39.2mg/g，比较第4次与第5次的提取量，增长速度明显下降，所以从试剂节约和操作过程的方面加以考虑，将藻液提取3次就可以达到要求。
实施例8：
一种雨生红球藻中虾青素的提取方法，包括以下提取步骤：
S1：通过超声波细破碎仪对雨生红球藻进行超声破碎，超声波细破碎仪的功率为600W，破碎时间为25min，得到藻液；
S2：移取藻液，加入提取溶剂，提取溶剂选用正丁醇与丙酮的体积比为5:1的混合溶剂，且藻液与提取溶剂的体积比为1:5，也就是料液比＝1:5，然后升温至55℃提取45min，期间共提取3次，提取完成后将藻液进行离心，收集上清液；提取全过程以氮气保护方式进行提取，防止虾青素的氧化。
S3：通过紫外分光光度计于检测波长490nm，测定上清液中虾青素的含量。
实施例9：
提取的虾青素抗氧化活性研究：
实验材料：虾青素自制(实施例8制得)，昆明小白鼠，水超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，过氧化氢酶(CAT)试剂盒，谷胱甘肽(GSH)试剂盒，丙二醛(MDA)试剂盒。
实验方法：
昆明小鼠，购置于山东鲁抗医药股份有限公司，6周龄，体重约22g，购置后饲养于缓冲间，观察一周无异常转入SPF级饲养间进行饲养。饲养间温度控制在22℃左右，采用12h明暗交替照明，相对湿度控制在55％，饲料、鼠笼、垫料等喂养器具均无菌处理。
小鼠经过缓冲饲养后，建立小鼠衰老模型，对小鼠进行200mg/(kg·bw)计量的D-半乳糖溶液颈背部皮下注射，连续注射7d，每天注射一次。抽检小鼠衰老模型建立成功后，进行分组并灌胃。空白组和D-半乳糖组，虾青素组(8mg/kg)，虾青素+D-半乳糖组(8mg/kg)。
小鼠处死后快速解剖，打开胸腔并取出完整肝脏，使用生理盐水冲洗干净，速冻，整理后转入超低温冰箱保存备用。
肝脏中SOD、GSH、MDA和CAT水平的检测根据商业说明书进行：
D-半乳糖对大鼠会造成免疫系统及肝脏等器官的不可逆伤害。氧化应激是导致肝脏损伤的重要原因，衰老导致肝脏当中氧化应激水平失衡加重肝脏的损伤。我们检测肝脏中SOD、GSH、MDA、CAT的含量，如图(1-4)所示，发现D-半乳糖可以显著提高肝脏中的MDA含量，而SOD、GSH、CAT的含量明显下降，肝脏中氧化应激水平明显上升。虾青素治疗的小鼠中，这些氧化应激的指标的表达水平有所降低，说明虾青素可以有效降低肝脏中的氧化应激。这一结果说明虾青素可以降低由衰老所导致的氧化应激水平的升高，起到抗氧化的作用。
另外，以本发明提取方法与现有传统方法进行对比，制取虾青素，数据如下：
由上述表格数据对比可知，本申请整个制备方法具有稳定性好、操作简单、制备时间短，提取效率高、可避免虾青素被氧化降解等优点，在工业生产中易于实现，值得推广应用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种雨生红球藻中虾青素的提取方法，其特征在于：包括以下提取步骤：
S1：通过超声波细破碎仪对雨生红球藻进行超声破碎，超声波细破碎仪的功率为500-700W，破碎时间为10-30min，得到藻液；
S2：移取藻液，加入提取溶剂，升温提取，提取完成后将藻液进行离心，收集上清液；
S3：通过紫外分光光度计于检测波长490nm，测定上清液中虾青素的含量。
2.根据权利要求1所述的雨生红球藻中虾青素的提取方法，其特征在于：步骤S2中提取虾青素时藻液与提取溶剂的取用体积比为1:7。
3.根据权利要求1所述的雨生红球藻中虾青素的提取方法，其特征在于：步骤S2中所用的提取溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、正丁醇、二甲亚砜中的一种及混合溶液。
4.根据权利要求3所述的雨生红球藻中虾青素的提取方法，其特征在于：步骤S2中所用的混合溶剂为正丁醇与丙酮的混合溶液，其中，正丁醇与丙酮的体积比为1-7:1-5。
5.根据权利要求1所述的雨生红球藻中虾青素的提取方法，其特征在于：步骤S2中提取虾青素的温度为35-75℃。
6.根据权利要求1所述的雨生红球藻中虾青素的提取方法，其特征在于：步骤S2中提取虾青素的时间为25-65min。
7.根据权利要求1所述的雨生红球藻中虾青素的提取方法，其特征在于：步骤S2中提取虾青素的次数为1-4次。
8.根据权利要求1所述的雨生红球藻中虾青素的提取方法，其特征在于：步骤S2虾青素提取全过程以氮气保护方式进行提取，防止虾青素的氧化。
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