CN112970588A - 一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，涉及植物繁殖技术领域，包括：取黄樟当年生半木质化茎枝，消毒，分成茎段，接种到培养基MS₀中培养；当茎段腋芽萌发成带叶小枝，剪切下萌发枝条，去叶将茎切成段，接入诱导培养基中诱导愈伤组织；选择淡黄色愈伤组织团转接到防褐化及不定芽分化培养基中，得丛生不定芽；挑选生长旺盛茎芽丛转接入壮苗培养基中培养，得到完整粗壮茎枝；挑选高大于3cm茎枝，接入生根培养基中诱导根系，获得再生植株。本发明的有益效果是采用茎器官诱导组织细胞，组织细胞发生脱分化产生不定芽，形成再生植株方法，繁殖系数比常规器官培养更高，具有取材少、再生率高、增殖速度快、重复性强、数量多等优点。

Description

一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法

技术领域

本发明涉及植物繁殖技术领域，具体讲是一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法。

背景技术

黄樟(Cinnamomum porrectum(Roxb.)Kosterm.)属于樟科樟属植物，主要分布于长江以南各省区，如广东、广西、江西、湖南、福建、云南、贵州等省、自治区。黄樟的根、茎、叶、枝均富含精油，是我国开发天然香料的重要木本精油植物资源之一。但黄樟结实少，种子成熟时间不一，多被鸟类啄食，极难获得种子，自然界中，黄樟呈小规模居群散生，可开发利用资源极少，短期内扦插繁殖难于成规模，优良种匮乏与培育技术滞后严重限制黄樟大部分化学类型资源开发利用。

黄樟不同个体间或同一个体不同部位，精油含量及成分都存在较大差异。根据叶精油主成分不同可划分为不同化学类型，文献中已报道的化学型有芳樟醇型、桉叶油素型、樟脑型、柠檬醛型、橙花叔醇型、萜品醇型等。自然界中，黄樟呈小规模居群散生，可开发利用资源极少，并且黄樟精油成分与化学型研究常基于单个种群甚或单株来源，不足以满足黄樟在香精香料精油产业发展。黄樟新的化学型或新的资源有待于被进一步挖掘开发，其发展前景广阔。

丰富的化学型赋予了黄樟精油极高的利用价值及开发潜力，倍受广大林农极大的关注，历史上一度被以“掘根截杆”方式开发，造成了一定程度的资源破坏。并且黄樟个体间或世代间精油性状显著变异，良种缺乏与培育技术滞后严重限制和制约黄樟大部分化学类型资源开发利用。因叶油出油率高且主成分含量突出的黄樟，已成为近年来天然香料产业的新力军，当中右旋芳樟醇型已规模产业化开发、切实地带动了部分地方林农脱贫致富，其它化学型黄樟还未广泛开发利用。随着可持续发展理念贯彻，筛选优树，创新高效繁育方法已成为当今黄樟天然香料产业发展的重中之重。

前期虽有关于黄樟组织培养的研究报道，因取材母本化学类型不确定，仅用茎段直接诱导腋芽方式繁殖，属单纯器官离体培养，增殖速度较慢，并未开展和深入组织细胞的离体培养。由于植物组织培养存在种属特异性，而黄樟是多化学类型树种，个体繁育难度、路径和方法差异很大，通过茎节间段诱导愈伤组织分离单细胞和细胞团发生脱分化，形成单细胞无性系获取再生植株方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，弥补当前黄樟传统繁育技术不足，提供一种黄樟愈伤组织诱导不定芽分化的繁育方法，特别是针对柠檬醛型黄樟的繁育方法。

本发明的技术解决方案如下：

一种黄樟愈伤组织诱导不定芽分化的繁育方法，包括以下步骤：

S1、取黄樟当年生半木质化茎枝作为外植体，将外植体消毒后，分成带腋芽茎段，接种到培养基MS₀中培养；

S2、当步骤S1中茎段腋芽鼓起萌发成带叶小枝，剪切下萌发枝条，去叶将茎切成不带芽小段，接入诱导培养基中进行诱导愈伤组织的培养，得到淡黄色、淡绿色及乳白色愈伤组织；

S3、挑选步骤S2中淡黄色愈伤组织团转接到防褐化及不定芽分化培养基中培养，得到丛生不定芽；

S4、挑选步骤S3中生长旺盛的密集丛芽团转接入壮苗培养基中继续培养25～30d，得到粗壮完整的茎枝；

S5、挑选步骤S4中茎杆高大于3cm带有3～4片叶的茎枝，接入生根培养基中进行根系诱导，培养时间15～20d，得到生根的再生植株。

本发明的一种具体实施方式中，所述步骤S1中，取柠檬醛型黄樟单株上当年生半木质化茎枝作为外植体。

本发明的一种具体实施方式中，所述步骤S2中，诱导培养基的成分包括：MS+6-BA1.0～2.0mg/L+2.4-D0.2～0.5mg/L。

本发明的一种具体实施方式中，所述步骤S3中，防褐化及不定芽分化培养基的成分包括：MS+BA0.5～1.0mg/L+TDZ0.8mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+V_C10～15mg/L+V_B15～20mg/L。

本发明的一种具体实施方式中，所述步骤S4中，壮苗培养基的成分包括：MS+6-BA0.2～0.5mg/L+NAA0～0.05mg/L+香蕉泥15～20g/L+AC0.2～0.3g/L。

本发明的一种具体实施方式中，所述步骤S5中，生根培养基的成分包括：MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+AC0.2～0.3g/L+香蕉泥8～12g/L。

本发明的一种具体实施方式中，所述步骤S1具体包括：在7月中旬～8月初，选择黄樟单株上当年生半木质化茎枝为外植体，外植体采回用剪刀去除叶片，剪成8～12cm小段，蘸取清洗液刷洗外植体表面污垢，后用清水洗去外植体表面清洁液，放入空瓶，瓶口用纱布包扎，置流水下冲洗1.5～2.5h，然后用体积分数75％酒精消毒40～50s，后用0.1％的氯化汞试剂处理5～7min，倒出，加入10％的盐酸溶液摇荡0.5～1.5min，倒出，加入无菌水摇动冲洗5～6次，消毒处理后的材料用镊子取出，放在消毒好托盘滤纸上吸干水，用镊子捏住茎段，并用消过毒的刀片切除茎段两端以及叶柄，分成带1～2个腋芽的小段，接种到培养基MS₀中培养，培养温度为25±2℃，光照强度2000～3000lx，光照时间12～16h/d。

本发明的一种具体实施方式中，所述步骤S2具体包括：茎段接种到培养基MS₀中培养12～18d后，当茎段腋芽鼓起萌发成带叶小枝，剪切下萌发枝条，去叶把茎切成0.4～0.6cm不带芽小段，接入诱导培养基中，培养温度为25±2℃，光照强度2000～3000lx，光照时间12～16h/d，并茎段平贴培养基表面，经诱导起初茎两端开始产生一个乳白色瘤状组织，后慢慢延续茎整体膨大形成淡黄色、淡绿色及乳白色愈伤组织。

本发明的一种具体实施方式中，所述步骤S3具体包括：挑选步骤S2中淡黄色愈伤组织团转接到防褐化及不定芽分化培养基中培养，培养温度为25±2℃，光照强度2000～3000lx，光照时间12～16h/d，并每隔30～35d进行转接新鲜培养基；培养18～22d后淡黄色愈伤组织细胞表面逐渐发生脱分化后形成白色乳状凸起物，细胞团也会出现原始白色胚状体或绿色小芽点，经培养后慢慢发育成绿色尖小芽点，小细胞团组织也同步扩大，继代培养3次后团状结构越来越大，慢慢出现丛状结构的丛生不定芽。

本发明的一种具体实施方式中，所述步骤S4中，当丛芽的叶包茎状转变顶芽下嫩叶展开，叶面光亮平滑，茎变粗壮，茎尖杆微发红状，茎杆高大于3cm以上完整单株，即可进行下一步生根培养。

本发明的一种具体实施方式中，所述步骤S5中，组培苗生根率达85％以上，单株有2～4条根系。

本发明使用的材料是选用黄樟优株，以茎段做外植体运用生物技术的方法建立离体快繁体系，最大限度的保持了母本的优良性状，使其优良特性得到最大能效的发挥，短期内快速无性繁殖，促使优良的自然资源达到合理的、充分的、长期的永续利用，可为建设规模化的香精香料原料林提供规格一致的优质种苗。

富含天然柠檬醛的植物虽然很多，但适合产业化大规模种植并能提取柠檬醛的植物资源稀少，本发明的申请人从大量黄樟野生资源中筛选了叶精油主成分柠檬醛的黄樟单株，通过柠檬醛型黄樟优良单株的茎器官诱导愈伤组织，组织脱分化形成器官再发育成植株，此方法具有取材少、再生率高、增殖速度快、重复性强、数量多等优点，还可为黄樟开展遗传转化及体细胞杂交研究奠定扎实基础。黄樟组织离体培养不仅是利用有限资源在短期内为大量繁育种苗的一种方法，也是对柠檬醛型黄樟种质资源保存和定向培育提供最有效途径，并有利促进柠檬醛型黄樟在香精香料产业得到快速发展。

本发明通过稀缺资源进行无性育苗，增加香精产业可用植物类型，对香精香料产业发展新品种和新业态具有推动作用。黄樟的离体繁体系一旦建立，可以克服不同外界环境和遗传因素所造成受精受阻的影响，短期内易形成规模化生产，可为建设香精香料原料林建设提供大量规格统一种苗，有力促进开发特殊化学型黄樟在香精香料产业上的应用，避免香精香料产业可用原料林化学型单一性，增强企业对市场的抗风险能力。

本发明发明充分践行了“良种良法”规则，深度挖掘自然资源潜力，筛选良种，从技术上创新繁育方法解决黄樟无性化、规模化育苗技术问题，夯实香精香料产业发展基础，为创制黄樟新品种及增强资源利用价值提供技术支撑和保障，是实现生态文明建设和“两山”转型的重要举措。

本发明至少具有以下有益效果之一：

本发明以黄樟半木质化茎段为外植体，在培养基中初代培养萌发获得无菌芽体，使用无菌芽体茎节间段为材料，诱导愈伤组织，愈伤组织经脱分化形成大量丛生不定芽，不定芽壮苗培养发育成无根植株，最后生根培养获得完整再生植株。本发明用茎器官诱导组织，再从组织发生脱分化形成器官获得再生植株方法，与一般器官培养路径不同，繁殖系数比常规器官培养更高，同时具有取材少、再生率高、增殖速度快、重复性强、数量多等优点。本发明通过茎节间在诱导培养基，能诱导大具有胚性的愈伤组织，此路径比常规器官培养增殖系数大，可提高生产效率和降低生产成本。本发明的愈伤组织诱导率90％、不定芽的分化率89.2％以上、不定芽的平均增殖倍数在10倍以上。

本发明的繁育方法不仅适用普通型的黄樟，而且适用于柠檬醛型黄樟的繁育，解决了黄樟特殊化学类型优良单株快速繁育的技术难题，为特殊化学型黄樟的产业化开发和利用奠定坚实物质基础。

本发明在诱导愈伤组织分化不定芽的培养基中，发现通过添加V_C和V_B不仅能产生大量不定芽，而且具有防止愈伤褐化的功效。

本发明首创将香蕉泥作为添加物在黄樟组培上运用，通过在培养基中添加香蕉泥，对黄樟不定芽生长和黄樟组培苗生根均有明显的促进作用，有利于促进不定芽高生长，同时解决了不定芽分化率低、不定芽细小、柠檬醛型黄樟组培苗难生根问题。

附图说明

图1为本发明实施例1茎段腋芽鼓起萌发成带叶小枝的形态图；

图2为本发明实施例1柠檬醛型黄樟茎节间段诱导愈伤组织的形态图；

图3为本发明实施例1愈伤组织开始分化不定芽的形态图；

图4为本发明实施例1愈伤组织高频分化不定芽的形态图；

图5为本发明实施例1不定芽壮苗培育的形态图；

图6为本发明实施例1生根黄樟组培苗的形态图；

图7为本发明实施例1黄樟组培移栽苗的形态图；

图8为本发明实施例2黄樟茎段腋芽鼓起萌发成带叶小枝的形态图；

图9为本发明实施例2黄樟茎节间段诱导愈伤组织的形态图；

图10为本发明实施例2愈伤组织开始分化不定芽的形态图；

图11为本发明实施例2愈伤组织高频分化不定芽的形态图；

图12为本发明实施例2不定芽壮苗培育的形态图；

图13为本发明实施例2生根黄樟组培苗的形态图；

图14为本发明实施例2黄樟组培移栽苗的形态图；

图15为本发明实施例3黄樟茎节间段诱导愈伤组织的形态图；

图16为本发明实施例3愈伤组织开始分化不定芽的形态图；

图17为本发明实施例3愈伤组织高频分化不定芽的形态图；

图18为本发明实施例3不定芽壮苗培育的形态图；

图19为本发明实施例3生根黄樟组培苗的形态图；

图20为本发明对比例1不定芽壮苗培育的形态图；

图21为本发明实施例1和对比例1不定芽壮苗培育的形态对比图，其中，左边的植株为实施例1中得到的黄樟不定芽，右边的的植株为对比例1得到的黄樟不定芽；

图22为本发明实施例1和对比例1生根黄樟组培苗的形态对比图，其中，左边的植株为实施例1中得到的生根黄樟组培苗，右边的的植株为对比例1得到的生根黄樟组培苗；

图23为本发明对比例2不定芽发生褐化形态图；

图24为本发明实施例1和对比例2黄樟不定芽发生褐化形态对比图，其中，左边的植株为对比例2中得到的黄樟不定芽，右边的的植株为实施例1得到的黄樟不定芽。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。

实施例1

本实施例提供一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，包括以下步骤：

S1、外植体采集和预处理

在7月底，选择黄樟叶精油主成分柠檬醛单株上当年生半木质化茎枝为初始试材，材料采回用剪刀去除叶片，剪成10cm左右小段，先用毛笔蘸清洗液刷洗表面污垢，后用清水洗去清洁液，放入空瓶，瓶口用纱布包扎，置流水下冲洗2h左右，拿超净工作台上用体积分数75％酒精消毒45s，后用0.1％的氯化汞试剂处理6min，倒出，加入10％的盐酸溶液摇荡1min，倒出，加入无菌水摇动冲洗5～6次，消毒处理后的材料用镊子取出，放在消毒好托盘滤纸上吸干水，一手用镊子捏着住茎段，一手用消过毒的刀片切除茎段两端以及叶柄，分成带1～2个腋芽的小段，接种到培养基MS₀中。每升培养基MS₀含有以下成分：硝酸钾1900mg、硝酸铵1650mg、七水硫酸镁370mg、二水氯化钙440mg、磷酸二氢钾170mg、七水硫酸亚铁27.8mg、乙二胺四乙酸二钠37.3mg、碘化钾0.83mg，硼酸6.2mg、一水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、钼酸钠0.25mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、肌醇100mg、抗坏血酸10mg、盐酸硫胺素0.5mg、烟酸0.5mg、盐酸吡哆辛0.1mg、甘氨酸2mg；蔗糖30g，卡拉胶5.0g。

培养条件：培养基pH为5.6～5.8，培养温度为25℃，光照强度2500lx，光照时间14h/d。

S2、愈伤组织诱导

当茎段接种到培养基上离体培养15d后，茎段腋芽鼓起萌发成带叶小枝(如图1所示)，剪切下萌发枝条，去叶把茎切成0.5cm左右不带芽小段，接入诱导培养基中培养，其中，诱导培养基的成分为：MS+6-BA1.5mg/L+2.4-D0.35mg/L+30g/L蔗糖+5.0g/L卡拉胶，培养基pH为5.7，培养温度为25℃，光照强度2500lx，光照时间14h/d，并使茎段平贴培养基表面，经诱导起初茎两端开始产生一个乳白色瘤状组织，后慢慢延续茎整体膨大形成淡黄色、淡绿色及乳白色愈伤组织。其中松散透明状乳白及淡绿色组织是无效组织，继代后发生褐黑状或呈水渍状，只有淡黄色松散组织愈伤组织可以在此培养基上通过继代无限制地进行细胞分裂和维持不分化状态，愈伤组织诱导率90％以上，也能长期保存，图2为诱导后的淡黄色愈伤组织的形态图。

S3、愈伤组织诱导不定芽

取步骤S2中挑选淡黄愈伤组织团转接到防褐化及不定芽分化培养基，其中，防褐化及不定芽分化培养基的成分为：MS+BA0.75mg/L+TDZ0.8mg/L+NAA0.15mg/L+V_C10mg/L+V_B15mg/L+30g/L蔗糖+5.0g/L卡拉胶上培养，培养基pH为5.7，培养温度为25℃，光照强度2500lx，光照时间14h/d，并每隔30d进行转接新鲜培养基；培养20d后淡黄色愈伤组织细胞表面逐渐发生脱分化后形成白色乳状凸起物，细胞团也会出现原始白色胚状体或绿色小芽点，经培养后慢慢发育成绿色尖小芽点，如图3所示，然后小细胞团组织也同步扩大，团状结构也来越大，慢慢出现丛状结构的丛生不定芽，如图4所示；组织通过此培养基3次以上继代，愈伤组织的诱导不定芽率达89.2％，单个继代周期不定芽的增殖系数可达10倍以上速度扩增，并能防止愈伤组织褐化现象的发生，能快速形成规模化育苗。

每隔30d进行转接新鲜培养基对保持愈伤组织的形态去除发褐无效愈伤组织很重要，褐色愈伤培养时间长发黑褐色易影响不定芽形成，愈伤组织颜色由黄-白色-淡绿-绿色尖点-带叶小芽转变，形态先出现胚状体后发育成完整小芽，生长出带叶植株。

S4、不定芽的壮苗培养

愈伤诱导的不定芽生长密集、数量多、个体小，需转换培养基进行壮苗培养，从中挑出生长旺盛、带有完整茎芽丛转接入壮苗培养基继续培养，其中壮苗培养基的成分为：MS+6-BA0.35 mg/L+NAA0.025mg/L+15g/L香蕉泥+0.25g/L AC+30g/L蔗糖+5.0g/L卡拉胶，培养基pH为5.7，培养温度为25℃，光照强度2500lx，光照时间16h/d；15d后，由丛芽的叶包茎状转变顶芽下嫩叶展开，叶面光亮平滑，茎变粗壮，茎尖杆微发红状，枝高大于3cm以上完整单株，即可进行下一步生根培养，如图5所示。

S5、再生植株生根

从壮苗培育的瓶苗中选择大于3cm完整枝条，接入生根培养基中进行生根培养，其中，生根培养基的成分为：MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+AC0.25g/L+10g/L香蕉泥++30g/L蔗糖+5.0g/L卡拉胶，pH为5.7，培养温度为25℃，光照强度2500lx，光照时间14h/d，培养时间18d，得到生根的组培苗，单株有2～4条根系，生根率达85％，如图6所示；

剩下小芽、弱芽放入新的壮苗培养基继续培养，此环节可周期循环操作利用。

将生根的组培苗进行移栽，得到移栽苗，如图7所示。

实施例2

本实施例提供一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，包括以下步骤：

S1、外植体采集和预处理

在7月中旬，选择黄樟叶精油主成分柠檬醛单株上当年生半木质化茎枝为初始试材，材料采回用剪刀去除叶片，剪成8cm左右小段，先用毛笔蘸清洗液刷洗表面污垢，后用清水洗去清洁液，放入空瓶，瓶口用纱布包扎，置流水下冲洗1.5h左右，拿超净工作台上用体积分数75％酒精消毒40s，后用0.1％的氯化汞试剂处理5min，倒出，加入10％的盐酸溶液摇荡0.5min，倒出，加入无菌水摇动冲洗5～6次，消毒处理后的材料用镊子取出，放在消毒好托盘滤纸上吸干水，一手用镊子捏着住茎段，一手用消过毒的刀片切除茎段两端以及叶柄，分成带1～2个腋芽的小段，接种到培养基MS₀中。每升培养基MS₀含有以下成分：硝酸钾1900mg、硝酸铵1650mg、七水硫酸镁370mg、二水氯化钙440mg、磷酸二氢钾170mg、七水硫酸亚铁27.8mg、乙二胺四乙酸二钠37.3mg、碘化钾0.83mg，硼酸6.2mg、一水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、钼酸钠0.25mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、肌醇100mg、抗坏血酸10mg、盐酸硫胺素0.5mg、烟酸0.5mg、盐酸吡哆辛0.1mg、甘氨酸2mg；蔗糖30g，卡拉胶5.0g。

培养条件：培养基pH为5.6～5.8，培养温度为23℃，光照强度2000lx,光照时间16h/d。

S2、愈伤组织诱导

当茎段接种到培养基上离体培养12d后，茎段腋芽鼓起萌发成带叶小枝(如图8所示)，剪切下萌发枝条，去叶把茎切成0.4cm左右不带芽小段，接入诱导培养基中培养，其中，诱导培养基的成分为：MS+6-BA1.0mg/L+2.4-D0.2mg/L+30g/L蔗糖+5.0g/L卡拉胶，培养基pH为5.6，培养温度为23℃，光照强度2000lx，光照时间16h/d，并使茎段平贴培养基表面，经诱导起初茎两端开始产生一个乳白色瘤状组织，后慢慢延续茎整体膨大形成淡黄色、淡绿色及乳白色愈伤组织。其中松散透明状乳白及淡绿色组织是无效组织，继代后发生褐黑状或呈水渍状，只有淡黄色松散组织愈伤组织可以在此培养基上通过继代无限制地进行细胞分裂和维持不分化状态，愈伤组织诱导率90％以上，也能长期保存，图9为诱导后的淡黄色愈伤组织的形态图。

S3、愈伤组织诱导不定芽

取步骤S2中挑选淡黄愈伤组织团转接到防褐化及不定芽分化培养基，其中，防褐化及不定芽分化培养基的成分为：MS+BA0.5mg/L+TDZ0.8mg/L+NAA0.1mg/L+V_C12mg/L+V_B18mg/L+30g/L蔗糖+5.0g/L卡拉胶上培养，培养基pH为5.6，培养温度为23℃，光照强度2000lx，光照时间16h/d，并每隔32d进行转接新鲜培养基；培养18d后淡黄色愈伤组织细胞表面逐渐发生脱分化后形成白色乳状凸起物，细胞团也会出现原始白色胚状体或绿色小芽点，经培养后慢慢发育成绿色尖小芽点，如图10所示，然后小细胞团组织也同步扩大，团状结构越来越大，慢慢出现丛状结构的丛生不定芽，如图11所示；组织通过此培养基3次以上继代，愈伤组织的诱导不定芽率达89.2％，单个继代周期不定芽的增殖系数可达10倍以上速度扩增，并能防止愈伤组织褐化现象的发生，能快速形成规模化育苗。

每隔32d进行转接新鲜培养基对保持愈伤组织的形态去除发褐无效愈伤组织很重要，褐色愈伤培养时间长发黑褐色易影响不定芽形成，愈伤组织颜色由黄-白色-淡绿-绿色尖点-带叶小芽转变，形态先出现胚状体后发育成完整小芽，生长出带叶植株。

S4、不定芽的壮苗培养

愈伤诱导的不定芽生长密集、数量多、个体小，需转换培养基进行壮苗培养，从中挑出生长旺盛、带有完整茎芽丛转接入壮苗培养基继续培养，其中壮苗培养基的成分为：MS+6-BA0.2 mg/L+NAA0.01mg/L+17g/L香蕉泥+0.2g/L AC+30g/L蔗糖+5.0g/L卡拉胶，培养基pH为5.6，培养温度为23℃，光照强度2000lx，光照时间16h/d，，12d后，由丛芽的叶包茎状转变顶芽下嫩叶展开，叶面光亮平滑，茎变粗壮，茎尖杆微发红状，枝高大于3cm以上完整单株，即可进行下一步生根培养，如图12所示。

S5、再生植株生根

从壮苗培育的瓶苗中选择大于3cm完整枝条，接入生根培养基中进行生根培养，其中，生根培养基的成分为：MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+AC0.2g/L+8g/L香蕉泥+30g/L蔗糖+5.0g/L卡拉胶，pH为5.6，培养温度为23℃，光照强度2000lx，光照时间16h/d，培养时间20d，得到生根的组培苗，单株有2～4条根系，生根率达86％，如图13所示；

剩下小芽、弱芽放入新的壮苗培养基继续培养，此环节可周期循环操作利用。

将生根的组培苗进行移栽，得到移栽苗，如图14所示。

实施例3

本实施例提供一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，包括以下步骤：

S1、外植体采集和预处理

在8月初，选择黄樟叶精油主成分柠檬醛单株上当年生半木质化茎枝为初始试材，材料采回用剪刀去除叶片，剪成12cm左右小段，先用毛笔蘸清洗液刷洗表面污垢，后用清水洗去清洁液，放入空瓶，瓶口用纱布包扎，置流水下冲洗2.5h左右，拿超净工作台上用体积分数75％酒精消毒50s，后用0.1％的氯化汞试剂处理7min，倒出，加入10％的盐酸溶液摇荡1.5min，倒出，加入无菌水摇动冲洗5～6次，消毒处理后的材料用镊子取出，放在消毒好托盘滤纸上吸干水，一手用镊子捏着住茎段，一手用消过毒的刀片切除茎段两端以及叶柄，分成带1～2个腋芽的小段，接种到培养基MS₀中。每升培养基MS₀含有以下成分：硝酸钾1900mg、硝酸铵1650mg、七水硫酸镁370mg、二水氯化钙440mg、磷酸二氢钾170mg、七水硫酸亚铁27.8mg、乙二胺四乙酸二钠37.3mg、碘化钾0.83mg，硼酸6.2mg、一水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、钼酸钠0.25mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、肌醇100mg、抗坏血酸10mg、盐酸硫胺素0.5mg、烟酸0.5mg、盐酸吡哆辛0.1mg、甘氨酸2mg；蔗糖30g，卡拉胶5.0g。培养条件：培养基pH为5.8，培养温度为27℃，光照强度3000lx，光照时间12h/d。

S2、愈伤组织诱导

当茎段接种到培养基上离体培养18d后，茎段腋芽鼓起萌发成带叶小枝，剪切下萌发枝条，去叶把茎切成0.5cm左右不带芽小段，接入诱导培养基中培养，其中，诱导培养基的成分为：MS+6-BA2.0mg/L+2.4-D0.5mg/L+30g/L蔗糖+5.0g/L卡拉胶，培养基pH为5.8，培养温度为27℃，光照强度3000lx，光照时间12h/d，并使茎段平贴培养基表面，经诱导起初茎两端开始产生一个乳白色瘤状组织，后慢慢延续茎整体膨大形成淡黄色、淡绿色及乳白色愈伤组织。其中松散透明状乳白及淡绿色组织是无效组织，继代后发生褐黑状或呈水渍状，只有淡黄色松散组织愈伤组织可以在此培养基上通过继代无限制地进行细胞分裂和维持不分化状态，愈伤组织诱导率91％以上，也能长期保存，图15为诱导后的淡黄色愈伤组织的形态图。

S3、愈伤组织诱导不定芽

取步骤S2中挑选淡黄愈伤组织团转接到防褐化及不定芽分化培养基，其中，防褐化及不定芽分化培养基的成分为：MS+BA1.0mg/L+TDZ0.8mg/L+NAA0.2mg/L+V_C15mg/L+V_B20mg/L+30g/L蔗糖+5.0g/L卡拉胶上培养，培养基pH为5.8，培养温度为27℃，光照强度3000lx，光照时间12h/d，并每隔35d进行转接新鲜培养基；培养22d后淡黄色愈伤组织细胞表面逐渐发生脱分化后形成白色乳状凸起物，细胞团也会出现原始白色胚状体或绿色小芽点，经培养后慢慢发育成绿色尖小芽点，如图16所示，然后小细胞团组织也同步扩大，团状结构越来越大，慢慢出现丛状结构的丛生不定芽，如图17所示；组织通过此培养基3次以上继代，愈伤组织的诱导不定芽率达89.2％，单个继代周期不定芽的增殖系数可达10倍以上速度扩增，并能防止愈伤组织褐化现象的发生，能快速形成规模化育苗。

每隔35d进行转接新鲜培养基对保持愈伤组织的形态去除发褐无效愈伤组织很重要，褐色愈伤培养时间长发黑褐色易影响不定芽形成，愈伤组织颜色由黄-白色-淡绿-绿色尖点-带叶小芽转变，形态先出现胚状体后发育成完整小芽，生长出带叶植株。

S4、不定芽的壮苗培养

愈伤诱导的不定芽生长密集、数量多、个体小，需转换培养基进行壮苗培养，从中挑出生长旺盛、带有完整茎芽丛转接入壮苗培养基继续培养，其中壮苗培养基的成分为：MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05mg/L+20g/L香蕉泥+0.3g/L AC+0.2g/L活性炭+30g/L蔗糖+5.0g/L卡拉胶，培养基pH为5.8，培养温度为27℃，光照强度3000lx，光照时间12h/d，18d后，由丛芽的叶包茎状转变顶芽下嫩叶展开，叶面光亮平滑，茎变粗壮，茎尖杆微发红状，枝高大于3cm以上完整单株，即可进行下一步生根培养，如图18所示。

S5、再生植株生根

从壮苗培育的瓶苗中选择大于3cm完整枝条，接入生根培养基中进行生根培养，其中，生根培养基的成分为：MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+AC0.3g/L+12g/L香蕉泥+0.2g/L活性炭+30g/L蔗糖+5.0g/L卡拉胶，pH为5.8，培养温度为27℃，光照强度3000lx，光照时间12h/d，培养时间15d，得到生根的组培苗，单株有2～4条根系，生根率达87％，如图19所示；

剩下小芽、弱芽放入新的壮苗培养基继续培养，此环节可周期循环操作利用。

将生根的组培苗进行移栽，得到移栽苗。

对比例1

与实施例1的区别在于：壮苗培养基和生根培养基中均不加香蕉泥，其他同实施例。

经过实验发现，对比例1中的黄樟不定芽苗细小，生长速度慢，叶片不展开，叶小，叶色淡绿，如图20所示。黄樟组培苗不生根，如图22中右边的的植株所示。

图21为实施例1和对比例1得到的黄樟不定芽对比图，其中，左边的植株为实施例1中得到的黄樟不定芽，右边的的植株为对比例1得到的黄樟不定芽，根据图21可以看出，实施例1中的不定芽生长速度快，苗粗壮，叶片展开，叶色嫩绿；而对比例1中的苗细小，生长速度慢，叶片不展开，叶小，叶色淡绿；由此说明，本发明通过在壮苗培养基中添加香蕉泥，对于不定芽生长有促进作用。

图22为实施例1和对比例1得到的黄樟组培苗对比图，其中，左边的植株为实施例1中得到的黄樟组培苗，右边的的植株为对比例1得到的黄樟组培苗，根据图22可以看出，实施例1中的黄樟组培苗已经生根，而对比例1中的黄樟组培苗并未生根，只有根原基。由此说明，本发明通过在生根培养基中添加香蕉泥，对于黄樟组培苗生根具有促进作用。

对比例2

与实施例1的区别在于：防褐化及不定芽分化培养基中不添加V_C和V_B，其他同实施例。

经过实验发现，对比例2中黄樟不定芽愈伤褐化严重，如图23所示；

图24为实施例1和对比例2得到的黄樟不定芽发生褐化形态对比图，其中，左边的植株为对比例2中得到的黄樟不定芽，右边的的植株为实施例1得到的黄樟不定芽，根据图24可以看出，实施例1中的不定芽愈伤褐化现象轻微，芽密集幼嫩；而对比例2中的不定芽愈伤组织发黑，芽少且小；由此说明，本发明通过在防褐化及不定芽分化培养基添加V_C和V_B，能够起到防止愈伤褐化的功效。

以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取黄樟当年生半木质化茎枝作为外植体，将外植体消毒后，分成带腋芽茎段，接种到培养基MS₀中培养；

S2、当步骤S1中茎段腋芽鼓起萌发成带叶小枝，剪切下萌发枝条，去叶将茎切成不带芽小段，接入诱导培养基中进行诱导愈伤组织的培养，得到淡黄色、淡绿色及乳白色愈伤组织；

S3、挑选步骤S2中淡黄色愈伤组织团转接到防褐化及不定芽分化培养基中培养，得到丛生不定芽；

S4、挑选步骤S3中生长旺盛的密集丛芽团转接入壮苗培养基中继续培养25～30d，得到粗壮完整的茎枝；

S5、挑选步骤S4中茎杆高大于3cm带有3～4片叶的茎枝，接入生根培养基中进行根系诱导，培养时间15～20d，得到生根的再生植株。

2.根据权利要求1所述的一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，其特征在于，所述步骤S1中，取柠檬醛型黄樟单株上当年生半木质化茎枝作为外植体。

3.根据权利要求1所述的一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，其特征在于，所述步骤S2中，诱导培养基的成分包括：MS+6-BA1.0～2.0mg/L+2.4-D0.2～0.5mg/L。

4.根据权利要求1所述的一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，其特征在于，所述步骤S3中，防褐化及不定芽分化培养基的成分包括：MS+BA0.5～1.0mg/L+TDZ0.8mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+V_C10～15mg/L+V_B15～20mg/L。

5.根据权利要求1所述的一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，其特征在于，所述步骤S4中，壮苗培养基的成分包括：MS+6-BA0.2～0.5mg/L+NAA0～0.05mg/L+香蕉泥15～20g/L+AC0.2～0.3g/L。

6.根据权利要求1所述的一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，其特征在于，所述步骤S5中，生根培养基的成分包括：MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+AC0.2～0.3g/L+香蕉泥8～12g/L。

7.根据权利要求1所述的一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：在7月中旬～8月初，选择黄樟当年生半木质化茎枝为外植体，外植体采回用剪刀去除叶片，剪成8～12cm小段，蘸取清洗液刷洗外植体表面污垢，后用清水洗去外植体表面清洁液，放入空瓶，瓶口用纱布包扎，置流水下冲洗1.5～2.5h，然后用体积分数75％酒精消毒40～50s，后用0.1％的氯化汞试剂处理5～7min，倒出，加入10％的盐酸溶液摇荡0.5～1.5min，倒出，加入无菌水摇动冲洗5～6次，消毒处理后的材料用镊子取出，放在消毒好托盘滤纸上吸干水，用镊子捏住茎段，并用消过毒的刀片切除茎段两端以及叶柄，分成带1～2个腋芽的小段，接种到培养基MS₀中培养，培养温度为25±2℃，光照强度2000～3000lx，光照时间12～16h/d。

8.根据权利要求1所述的一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：茎段接种到培养基MS₀中培养12～18d后，当茎段腋芽鼓起萌发成带叶小枝，剪切下萌发枝条，去叶把茎切成0.4～0.6cm不带芽小段，接入诱导培养基中，培养温度为25±2℃，光照强度2000～3000lx，光照时间12～16h/d，并茎段平贴培养基表面，经诱导起初茎两端开始产生一个乳白色瘤状组织，后慢慢延续茎整体膨大形成淡黄色、淡绿色及乳白色愈伤组织。

9.根据权利要求1所述的一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：挑选步骤S2中淡黄色愈伤组织团转接到防褐化及不定芽分化培养基中培养，培养温度为25±2℃，光照强度2000～3000lx，光照时间12～16h/d，并每隔30～35d进行转接新鲜培养基；培养18～22d后淡黄色愈伤组织细胞表面逐渐发生脱分化后形成白色乳状凸起物，细胞团也会出现原始白色胚状体或绿色小芽点，经培养后慢慢发育成绿色尖小芽点，小细胞团组织也同步扩大，随继代培养3次后团状结构越来越大，慢慢出现丛状结构的丛生不定芽。

10.根据权利要求1所述的一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法，其特征在于，

所述步骤S4中，当丛芽的叶包茎不定芽状转变顶芽下嫩叶展开，叶面光亮平滑，茎变粗壮，茎尖杆微发红状，茎杆高大于3cm以上完整单株，即可进行下一步生根培养；

所述步骤S5中，组培苗生根率达85％以上，单株有2～4条根系。

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