CN112961374A - 一种天然鱼鳔来源导电水凝胶的制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然鱼鳔来源导电水凝胶的制备与应用。该导电水凝胶的制备方法,包括如下步骤:(1)将鱼鳔与H2O2混合15min~16h,然后将鱼鳔与碱溶液混合4~8h,得到水凝胶;(2)将水凝胶与单体吡咯混合;然后将水凝胶与铁离子溶液混合,反应。本发明提供的制备方法得到的导电水凝胶展现出更好的力学性能;在不同方向展现出良好的各项异力学特性;经过50次的循环拉伸之后,应力能够保持相对稳定,同时,展现出良好的导电性能。该导电水凝胶制备得到的心肌补片对心肌梗死后心脏的重构具有良好的效果:心室壁的修复效果最好,左心室壁的厚度显著增加。
Description
技术领域
本发明属于医用材料技术领域,具体涉及一种天然鱼鳔来源导电水凝胶的制备与应用。
背景技术
心脏ECM是一种呈三维结构的纳米纤维网,纳米纤维主要成分为胶原蛋白和糖胺聚糖,纤维直径为50~500纳米。研究人员普遍认天然ECM支架材料是制备仿生心脏ECM纳米纤维组织的一条捷径。本质上说,生物支架应该能在分子水平上以精确和受控的方式与细胞相互作用,类似于细胞与天然ECM之间存在的自然相互作用。此外,作为一个理想的组织工程支架材料,材料本身及其降解产物必须是无毒且无免疫原性的,其降解速率应与新生组织形成的速率相匹配。相比较合成材料而言,天然ECM支架具有良好的生物相容性、生物易降解性、无免疫源性以及最接近天然的三维结构。因其具有仿心脏ECM成份、优异的三维空间结构以及高密度的细胞结合位点,天然ECM支架为种子细胞提供了有益的生化微环境和生命信号支持,调控细胞的滞留、迁移、增殖和分化等行为。这些仿ECM材料与种子细胞之间的相互作用和交流还可以介导组织的再生和修复过程。天然ECM支架常采用脱细胞的方法获得,保留了天然组织分泌生物因子的能力,能够为心肌细胞的存活提供良好的微环境。目前,各种形式的ECM(从小肠,皮肤,肝脏,胰腺和膀胱等组织中收获)已被用作生物支架,用于组织和器官的损伤后修复和重塑。
近年来,水产品(海洋或淡水)来源的天然生物材料由于原料丰富、低抗原性、低致敏性、以及没有传染病危险而受到学者们广泛的关注。由于具有良好的亲水性和生物相容性,其优异的天然结构能够模拟细胞所处微环境中的生化和机械特性,水生生物来源的天然ECM 支架可作为一种新兴的生物替代材料用于组织工程领域。淡水来源的新型材料鱼鳔,作为辅助鱼类呼吸的一种脏器,多数没有做到物尽其用,经常被当作下脚料而遭遗弃。有研究表明天然鱼鳔是由胶原纤维有序排列而成的膜状物质,具有良好的生物相容性,可提供与机体类似的基质成分。
发明内容
本发明的第一方面的目的,在于提供一种水凝胶的制备方法。
本发明的第二方面的目的,在于提供第一方面的制备方法得到的水凝胶。
本发明的第三方面的目的,在于提供一种导电水凝胶的制备方法。
本发明的第四方面的目的,在于提供第三方面的制备方法得到的导电水凝胶。
本发明的第五方面的目的,在于提供第二方面的水凝胶和/或第四方面的导电水凝胶在制备心肌补片中的应用。
本发明的第六方面的目的,在于提供一种心肌补片。
本发明的第七方面的目的,在于提供第六方面的心肌补片的制备方法。
本发明的第八方面的目的,在于提供第六方面的心肌补片在制备医疗器械中的应用。
为了实现上述目的,本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供一种水凝胶的制备方法,将鱼鳔与H2O2混合15min~16h;然后将鱼鳔与碱溶液混合6~15h。
优选的,所述H2O2的质量浓度为5~45%;进一步为15~30%。
优选的,所述碱为氢氧化钠、石灰、碳酸钠中的至少一种。
优选的,所述碱的浓度为0.1~1M;进一步为0.5~1M。
优选的,所述混合的条件为常温下震荡;进一步为25~35℃下震荡。
优选的,所述混合后还包括如下步骤:清洗鱼鳔。
优选的,所述鱼鳔与H2O2混合前还包括如下步骤:将鱼鳔与NaCl混合10~16h。
优选的,所述NaCl的质量浓度为2~2.5%。
优选的,所述混合后还包括如下步骤:清洗鱼鳔。
优选的,所述鱼鳔为去除表面脂肪和血管的鱼鳔。
优选的,所述鱼鳔取自硬骨鱼;硬骨鱼包括鲫鱼、胖头鱼(鳙鱼)。
本发明的第二个方面,提供一种水凝胶,通过第一方面的制备方法得到。
优选的,所述水凝胶的最大断裂应力为200~500kPa;进一步为236.63kPa。
优选的,所述水凝胶的弹性模量为200~500kPa;进一步为225kPa。
本发明的第三个方面,提供一种导电水凝胶的制备方法,将第一方面的制备方法得到水凝胶或第二方面的水凝胶与单体吡咯混合;然后将水凝胶与铁离子溶液混合,反应。
优选的,所述单体吡咯与铁离子的摩尔比为1:(1~3)。
优选的,所述单体吡咯的浓度为0.5~1mg/mL;进一步为0.5mg/mL。
优选的,所述铁离子的浓度为3.63~7.25mg/mL;进一步为3.63mg/mL。
优选的,所述水凝胶与单体吡咯混合的时间为0.5~3h。
优选的,所述反应的时间为4~8h。
优选的,所述铁离子溶液为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、氧化铁和高氯酸铁中的至少一种。
本发明的第四个方面,提供一种导电水凝胶,通过第三方面的制备方法得到。
优选的,所述导电水凝胶的平行于胶原纤维方向的最大断裂应力为496.26~615.53kPa;进一步为496.26kPa。
优选的,所述导电水凝胶的垂直于胶原纤维方向的最大断裂应力为196.24~276.67kPa;进一步为196.24kPa。
优选的,所述导电水凝胶的平行于胶原纤维方向的弹性模量为485~597kPa;进一步为 485kPa。
优选的,所述导电水凝胶的垂直于胶原纤维方向的弹性模量为171~400kPa;进一步为 171.25kPa。
优选的,所述导电水凝胶的平行于胶原纤维方向的电流密度为0.00544~0.00651A/cm2;进一步为0.00651A/cm2。
优选的,所述导电水凝胶的垂直于胶原纤维方向的电流密度为0.00189~0.00411A/cm2;进一步为0.0019A/cm2。
优选的,所述导电水凝胶的平行于胶原纤维方向的电导率为0.82~1.5S/cm;进一步为 0.82S/cm。
优选的,所述导电水凝胶的垂直于胶原纤维方向的电导率为0.71~1.37S/cm;进一步为 0.71S/cm。
本发明的第五个方面,提供第二方面的水凝胶和/或第四方面的导电水凝胶在制备心肌补片中的应用。
本发明的第六个方面,提供一种心肌补片,包含第三方面的制备方法得到的导电水凝胶和/或第四方面的导电水凝胶。
优选的,所述心肌补片还包含心肌细胞。
本发明的第七个方面,提供第六方面的心肌补片的制备方法,将心肌细胞接种至第四方面的导电水凝胶上培养。
优选的,所述心肌细胞的接种密度为2~10x 105个/mm2。
优选的,所述培养的条件为常温下培养5~10天;进一步为25~35℃下培养7~10天。
本发明第八个方面,提供第六方面的心肌补片在制备医疗器械中的应用。
优选的,所述医疗器械用于治疗缺血性心脏疾病;进一步的,所述医疗器械用于治疗心肌梗死。
本发明的有益效果是:
本发明提供的制备方法得到的水凝胶能产生198.21%的形变量,最高应力达236.63kPa;相比未处理的鱼鳔(形变量达到89.19%,最高应力达到1981.1kPa),形变量增加了2.65倍,最高应力降低了88.06%,且弹性模量与天然心肌组织匹配(20~500kPa),同时,透明度、柔韧度增加。
本发明提供的制备方法得到的导电水凝胶展现出更好的力学性能,在平行于鱼鳔纤维方向时,能够产生约3倍的形变,在垂直方向时能够产生1.5倍的形变量;在不同方向展现出良好的各项异力学特性;经过50次的循环拉伸之后,应力能够保持相对稳定,同时,展现出良好的导电性能。该导电水凝胶制备得到的心肌补片对心肌梗死后心脏的重构具有良好的效果:心室壁的修复效果最好,左心室壁的厚度显著增加。
本发明提供了一种新颖的、弹性较好的天然鱼鳔来源仿细胞外基质的导电水凝胶,并在缺血性心脏疾病治疗中展现出良好的应用潜能。
本发明利用水产品加工过程中产生的副产物鱼鳔材料,深度挖掘其利用价值,具有重要的社会和经济效益。
附图说明
图1是实施例2、4制备得到的水凝胶与未处理的鱼鳔的扫描电镜图:其中,A为未处理的鱼鳔的扫描电镜图;B为实施例4制备得到的水凝胶的扫描电镜图;C为实施例2制备得到的水凝胶的扫描电镜图。
图2是实施例2制备得到的水凝胶与未处理的鱼鳔的柔韧性示意图:其中,A为未处理的鱼鳔的柔韧性示意图;B为实施例2制备得到的水凝胶的柔韧性示意图。
图3是实施例2、4制备得到的水凝胶与未处理的鱼鳔的透明度示意图:其中,A为未处理的鱼鳔的透明度示意图;B为实施例4制备得到的水凝胶的透明度示意图;C为实施例2制备得到的水凝胶的透明度示意图。
图4是实施例2制备得到的水凝胶与未处理的鱼鳔的拉伸强度示意图:其中,A为未处理的鱼鳔的拉伸强度示意图;B为实施例2制备得到的水凝胶的拉伸强度示意图。
图5是实施例2制备得到的水凝胶与未处理的鱼鳔的力学性能图:其中,A为实施例2 制备得到的水凝胶与未处理的鱼鳔的拉伸应力-应变曲线图;B为实施例2制备得到的水凝胶与未处理的鱼鳔的弹性模量图,其中,***表示差异极显著(p<0.001)。
图6是实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶的扫描电镜图:Heart表示正常心脏组织的截面形貌图;NaCl/NaOH表示实施例4制备得到的水凝胶;NaCl/NaOH/H2O2表示实施例2 制备得到的水凝胶;NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5表示实施例5制备得到的水凝胶;NaCl/NaOH/H2O2/pPy1表示实施例6制备得到的导电水凝胶。
图7是实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶的力学性能图:其中,A为横截面(平行于鱼鳔纤维方向)的断裂拉伸分析图;B为纵截面(垂直于鱼鳔纤维方向)的断裂拉伸分析图;C为横截面、纵截面上的弹性模量图。
图8是实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶的力学稳定性图:其中,A为实施例4制备得到的水凝胶的最大断裂应力-时间曲线图;B为实施例2制备得到的水凝胶的最大断裂应力 -时间曲线图;C为实施例5制备得到的水凝胶的最大断裂应力-时间曲线图;D为实施例6制备得到的水凝胶的最大断裂应力-时间曲线图。
图9是实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶的导电性能图:其中,A为实施例5制备得到的水凝胶的电流-电压曲线图;B为实施例6制备得到的水凝胶的电流-电压曲线图;C为实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶的导电率比较分析图。
图10是实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶上心肌细胞的发育、成熟状况图。
图11是心肌梗死大鼠移植实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶制备得到的心肌补片后左心室功能及结构的改变图:其中,A为心肌梗死大鼠移植实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶制备得到的心肌补片4周后的超声心动图;B为心肌梗死大鼠移植实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶制备得到的心肌补片4周后的左心室收缩期内径(LVIDs)图;C为心肌梗死大鼠移植实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶制备得到的心肌补片4周后的左心室舒张期内径(LVIDd)图;D为心肌梗死大鼠移植实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶制备得到的心肌补片4周后的短轴缩短率(FS)图;E为心肌梗死大鼠移植实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶制备得到的心肌补片4周后的射血分数(EF)图。
图12是心肌梗死大鼠移植实施例2、4、5、6制备得到的水凝胶制备得到的心肌补片4 周后心脏组织Masson染色图:其中,A为心肌梗死大鼠的心脏组织Masson染色图;B为心肌梗死大鼠移植实施例4制备得到的水凝胶制备得到的心肌补片4周后心脏组织Masson染色图;C为心肌梗死大鼠移植实施例2制备得到的水凝胶制备得到的心肌补片4周后心脏组织Masson染色图;D为心肌梗死大鼠移植实施例5制备得到的水凝胶制备得到的心肌补片4 周后心脏组织Masson染色图;E为心肌梗死大鼠移植实施例6制备得到的水凝胶制备得到的心肌补片4周后心脏组织Masson染色图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所使用的材料、试剂等,如无特别说明,为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1水凝胶的制备
在无菌条件下,剪取鲫鱼鱼鳔,去除表面的脂肪和血管后,用无菌PBS溶液冲洗5次;沿鱼鳔周向和纵向切成20×20mm2的小块,用无菌PBS漂洗5次;将剪切后的鱼鳔置于2wt% NaCl溶液中4℃处理10h后,在无菌PBS中漂洗5次;然后转移到5wt%H2O2中,常温(25~ 32℃)下震荡处理15min,在无菌PBS中漂洗5次;接着转移至0.1M NaOH溶液中,常温(25~ 32℃)下震荡处理6h,在无菌PBS中漂洗5次,得到水凝胶。
实施例2水凝胶的制备
在无菌条件下,剪取鲫鱼鱼鳔,去除表面的脂肪和血管后,用无菌PBS溶液冲洗5次;沿鱼鳔周向和纵向切成20×20mm2的小块,用无菌PBS漂洗5次;将剪切后的鱼鳔置于2.5wt% NaCl溶液中4℃处理12h后,在无菌PBS中漂洗5次;然后转移到30wt%H2O2中,常温(25~ 32℃)下震荡处理14h,在无菌PBS中漂洗5次;接着转移至0.5M NaOH溶液中,常温(25~ 32℃)下震荡处理12h,在无菌PBS中漂洗5次,得到水凝胶。
实施例3水凝胶的制备
在无菌条件下,剪取鲫鱼鱼鳔,去除表面的脂肪和血管后,用无菌PBS溶液冲洗5次;沿鱼鳔周向和纵向切成20×20mm2的小块,用无菌PBS漂洗5次;将剪切后的鱼鳔置于2.5wt% NaCl溶液中4℃处理16h后,在无菌PBS中漂洗5次;然后转移到45wt%H2O2中,常温(25~ 32℃)下震荡处理16h,在无菌PBS中漂洗5次;接着转移至1M NaOH溶液中,常温(25~32℃)下震荡处理15h,在无菌PBS中漂洗5次,得到水凝胶。
实施例4水凝胶的制备
本实施例中水凝胶的制备方法与实施例2一致,区别仅在于未进行H2O2处理,即NaCl 处理、漂洗后转移至NaOH溶液中处理、漂洗。
实施例5导电水凝胶的制备
取实施例2制备得到的水凝胶浸泡在10mL0.5 mg/mL单体吡咯(Py)溶液中1h,然后在 10mL 3.63mg/mL FeCl3水溶液中浸泡反应6小时(吡咯单体与FeCl3与的摩尔比为1:3);pPy 在水凝胶原位聚合成pPy,得到导电水凝胶。
实施例6导电水凝胶的制备
取实施例2制备得到的水凝胶浸泡在10mL 1mg/mL单体吡咯(Py)溶液中1h,然后在10mL 7.25mg/mL FeCl3水溶液中浸泡反应6小时(吡咯单体与FeCl3与的摩尔比为1:3),使Py在水凝胶原位聚合成pPy,得到导电水凝胶。
效果实施例
1.水凝胶的形貌和拉伸性能
分别取实施例2、4制备得到的水凝胶与未处理(在无菌条件下,剪取鲫鱼鱼鳔,去除表面的脂肪和血管后,用无菌PBS溶液冲洗5次;沿鱼鳔周向和纵向切成20×20mm2的小块,用无菌PBS漂洗5次;将剪切后的鱼鳔置于2.5wt%NaCl溶液中4℃处理14h后,在无菌PBS中漂洗5次)的鱼鳔放入冻干机中真空冷冻干燥2天(-50℃),用扫描电镜观察其形貌,结果如图1所示:实施例2制备得到的水凝胶(经过NaCl/NaOH/H2O2处理))纵截面展现出有序的结构;实施例4制备得到的水凝胶(经过NaCl/NaOH处理)纵截面结构相对松散,但有序结构不明显;未处理的鱼鳔则相对致密。
分别取实施例2制备得到的水凝胶与未处理的鱼鳔观察其柔韧性,结果如图2所示:实施例2制备得到的水凝胶柔韧性更好。分别取实施例2、4制备得到的水凝胶与未处理的鱼鳔观察其透明度,结果如图3所示:实施例2制备得到的水凝胶的透明度>实施例4制备得到的水凝胶的透明度>未处理的鱼鳔的透明度。分别取实施例2制备得到的水凝胶与未处理的鱼鳔观察其拉伸性能,结果如图4所示:实施例2制备得到的水凝胶易拉伸,拉伸性能优异。
2.水凝胶的力学性能
取实施例2制备得到的水凝胶和未处理的鱼鳔进行力学性能测试,具体如下:通过Electro Force试验机(~50N)检测实施例2制备的水凝胶和未处理的鱼鳔薄膜的力学性能,拉伸速率为0.02mm/s,测试三次;处理数据后作应力-应变曲线,并计算弹性模量,结果如图5所示:图5中A显示:相比较于未处理鱼鳔(形变量达到89.19%,最高应力1981.1kpa),处理后的鱼鳔能够产生198.21%的形变量,最高应力达236.63kpa,处理后的鱼鳔增加了2.65倍的形变;图5中B显示实施例2制备的水凝胶其弹性模量和天然心肌组织匹配(20~500kpa)。
3.导电水凝胶的形貌、机械性能及导电性能
分别取(Heart组,即正常大鼠心脏组织)、实施例2(NaCl/NaOH/H2O2组)、实施例4(NaCl/NaOH组)、实施例5(NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5)、实施例6(NaCl/NaOH/H2O2/pPy1) 制备得到的水凝胶进行SEM表征,结果如图6所示:实施例2制备的水凝胶展现出有序排列的胶原纤维,接枝有聚吡咯的导电水凝胶(实施例5、6)中导电颗粒分布均匀,组装成排列整齐的导电胶原纳米纤维,而实施例4制备的水凝胶未显露出明显的鱼鳔纤维,表明 NaCl/NaOH/H2O2经过导电聚吡咯修饰的导电水凝胶展现出和心肌类似的有序纤维结构,这有利于其在心肌组织工程中的进一步应用。
分别取实施例2(NaCl/NaOH/H2O2组)、实施例4(NaCl/NaOH组)、实施例5 (NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5)、实施例6(NaCl/NaOH/H2O2/pPy1)制备得到的水凝胶,通过生物力学分析仪(~50N)检测其机械性能,结果如图7所示:图7中A显示不同材料横截面(平行于鱼鳔胶原纤维方向)的应力-应变曲线图;此时NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5产生的最大应力为496.26kPa,NaCl/NaOH/H2O2/pPy1产生的最大应力为615.53kPa;图7中B显示不同材料横截面(垂直于鱼鳔胶原纤维方向)的应力-应变曲线图;此时NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5产生的最大应力为196.24kPa,NaCl/NaOH/H2O2/pPy1产生的最大应力为276.67kPa;修饰了导电聚吡咯的鱼鳔水凝胶(经过NaCl/NaOH/H2O2处理),尤其是0.5mg/ml pPy接枝组,展现出更好的力学性能,在平行于鱼鳔纤维方向时,能够产生约3倍的形变,在垂直方向时能够产生 1.5倍的形变量;图7中C显示不同材料在横纵截面的弹性模量比较图;修饰了导电聚吡咯的鱼鳔水凝胶(经过NaCl/NaOH/H2O2处理),尤其是0.5mg/mLpPy接枝组在不同方向展现出良好的各项异力学特性。进一步通过Electro Force试验机(~50N)检测各组水凝胶的力学稳定性能,压缩速率为0.02mm/s,循环拉伸50次,拉伸形变为50%,测试三次,结果如图 8所示:经过50次的循环拉伸之后,NaCl/NaOH/H2O2组和NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5的应力在一定形变范围内,具有良好的力学稳定性。
分别取实施例2(NaCl/NaOH/H2O2组)、实施例4(NaCl/NaOH组)、实施例5 (NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5)、实施例6(NaCl/NaOH/H2O2/pPy1)制备得到的水凝胶,按照四探针法检测其导电性能,结果如图9所示:图9中A显示实施例5制备得到的导电水凝胶 NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5在不同方向的导电率具有差异,在平行于胶原纤维方向上的导电率更高;图9中B显示实施例6制备得到的导电水凝胶NaCl/NaOH/H2O2/pPy1在电压低于1.0v时,垂直于胶原纤维方向上的导电率更高,1.0v时出现交叉,高于1.0v时,平行于胶原纤维方向上的导电率更高;图9中C显示四种材料在不同方向的导电率,表明这两种导电水凝胶具有优异的导电率,并呈现各向异性,以NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5尤为显著。
4.导电水凝胶上心肌细胞的发育、成熟状况
(1)分别取实施例2(NaCl/NaOH/H2O2组)、实施例4(NaCl/NaOH组)、实施例5 (NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5)、实施例6(NaCl/NaOH/H2O2/pPy1)制备得到的水凝胶,分别加入原代SD乳鼠心肌细胞(SD乳鼠购自南方医科大学动物实验中心)培养7天,然后于PBS 缓冲液润洗3次后,室温固定在4%多聚甲醛液中20分钟;
(2)弃多聚甲醛液后在PBS中润洗3次,用30%蔗糖溶液脱水1天;
(3)置于含有15%蔗糖的50%冰冻切片包埋剂(OCT)中4小时,然后置于100%OCT4 小时;
(4)冷冻样品,用莱卡CMl950冰冻切片机将样品切片,厚约20微米;
(5)将切片置于聚-乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)中,室温下透化45分钟;
(6)滴加封闭液(2%BSA),室温孵育30min后倒掉液体;
(7)滴加一抗(CX-43:1:100,α-actinin:1:100),封闭液稀释,4℃孵育过夜;
(8)PBS洗4次,5min/次;
(9)滴加二抗,488驴抗兔IgG(1:500)和568驴抗小鼠IgG(1:500),常温避光孵育1.5h;
(10)PBS洗4次,5min/次;
(11)滴加含DAPI的封片剂进行封片,免疫荧光显微镜观察并拍照。
结果如图10所示:在第7天,所有组的心肌细胞,尤其是导电水凝胶心肌补片中,大部分区域覆盖有α-actinin和CX-43蛋白,并呈现规则排列;表明导电水凝胶心肌补片促进心肌细胞的成熟以及定向排列。
5.大鼠心肌梗死模型建立及心肌补片移植
(1)模型构建
1)雄性SD大鼠(250g±20g)(购自南方医科大学动物实验中心),腹腔注射2%戊巴比妥钠(30mg/kg);麻醉满意后仰卧位固定于手术台上,剃去颈部及胸前区毛发,常规消毒皮肤;纵向切开颈部正中皮肤,切口约长lcm,暴露气管,在环状软骨下1个气管软骨环间横向剪开气管,插入直径为5mm的硅胶管,小动物呼吸机辅助呼吸(吸呼比为l:2,潮气量为3ml/100g,呼吸频率为50~70次/分),当大鼠胸廓起伏动度与呼吸机同步时表明气管插管成功;
2)胸骨左缘第四、五肋间横向切开皮肤,切口约长1.5cm,钝性分离皮下组织及肌层,剪开肋间肌,开睑器拉开肋间切口,钝性撕开心包,充分暴露心脏;撕开心包,6-0手术缝合线结扎冠脉左前降支,具体结扎位置为肺动脉圆锥与左心耳下缘1-2mm处连线中点,结扎深度约为2.0mm;同时观察左心室前壁心肌颜色是否改变;若左心室前壁颜色由红色迅速紫绀后变为紫白色,则冠脉结扎成功,心梗模型建立;
3)形成心肌梗死模型后14天,存活的大鼠接受了超声心动图检查。选择FS<30%的SD 大鼠进行实验,随机分为心肌梗死组(MI)、NaCl/NaOH组、NaCl/NaOH/H2O2组、 NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5组以及NaCl/NaOH/H2O2/pPy1组。
(2)细胞接种
1)将心肌细胞以2.04x 105个/mm2密度分别接种至大小为1.4mm x 1.4mm的实施例2 (NaCl/NaOH/H2O2组)、实施例4(NaCl/NaOH组)、实施例5(NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5)、实施例6(NaCl/NaOH/H2O2/pPy1)制备得到的水凝胶上,常温下培养7天;
2)开胸暴露大鼠心脏,将细胞-补片复合体移植到心肌梗死部位,用7-0缝线固定心肌补片。
(3)超声心动图检测
分别在心肌梗死后2周(即心肌补片移植前,pre)和心肌补片移植4周后(post),利用超声心动图对各组动物心脏功能进行检测,具体如下:大鼠以10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉,胸前区剃毛后仰卧位固定;左侧胸部涂透声胶,使用SEQUOIA 512彩超仪进行检测,14.0MHz 超声探头测试大鼠心脏功能,测量在舒张期和收缩期左心室内部尺寸(分别为LVIDd和 LVIDs),短轴缩短率(FS)和射血分数(EF);每只大鼠测试时取3-6个心动周期,记录平均值,结果如图11中A、B所示(Sham组为未进行任何处理的正常大鼠):图11中A显示导电水凝胶组(实施例5、实施例6)左心室游离壁厚度增加,收缩活性增强;图11中B显示相比较于MI组、非导电水凝胶组(NaCl/NaOH组、NaCl/NaOH/H2O2组),导电水凝胶组 (NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5、NaCl/NaOH/H2O2/pPy1)的心肌补片处理后舒张期和收缩期左心室内部尺寸(LVIDd、LVIDs)和短轴缩短率(FS)、射血分数(EF)均有显著改善。
(4)体内实验的组织学和免疫荧光
1)制片:在心肌补片移植4周后,将大鼠麻醉,处死,并收集心脏组织;用4%多聚甲醛固定30分钟,并切成3毫米的薄片;PBS洗涤后,将组织用30%的蔗糖脱水3天,然后用冰冻切片包埋剂在-20℃包埋;使用冰冻切片机将心脏组织切成4微米的冷冻切片,保存于 -20℃冰箱中;
2)Masson染色:将切片从-20℃冰箱取出,置于37℃电热恒温干燥箱30min进行复温;用配制好的Weigert铁苏木素染色液染色10min;酸性乙醇分化液分化10s,水洗;Masson蓝化液返蓝4min,水洗;蒸馏水洗1min;丽春红品红染色液染色10min;在上述操作过程中按蒸馏水:冰醋酸溶液=2:1的体积比例配置弱酸工作液,用弱酸工作液洗1min;磷钼酸溶液洗2min;苯胺蓝染色液中染色2min;95%乙醇快速脱水;无水乙醇脱水3次,每次10s;二甲苯透明3次,每次2min;中性树胶封固;光学显微镜下观察并拍照。
结果如图12所示:MI组左心室存在严重纤维化的情况,室壁较薄,几乎被蓝色的胶原纤维完全覆盖;非导电水凝胶组(NaCl/NaOH组、NaCl/NaOH/H2O2组)心室壁较薄,且纤维结缔组织比较多,说明其修复效果并不理想;导电水凝胶组(NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5、 NaCl/NaOH/H2O2/pPy1)的纤维化区域明显缩小,心室壁增厚,修复效果好,尤其 NaCl/NaOH/H2O2/pPy0.5组对心室壁的修复效果最好,左心室壁的厚度从0.515mm(心肌补片移植后1周)增加到1.886mm(心肌补片后4周)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种水凝胶的制备方法,其特征在于:将鱼鳔与H2O2混合15min~16h;然后将鱼鳔与碱溶液混合6~15h。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述鱼鳔与H2O2混合前还包括如下步骤:将鱼鳔与NaCl混合10~16h。
3.一种水凝胶,通过权利要求1或2所述的制备方法得到;
优选的,所述水凝胶的最大断裂应力为200~500kPa;
优选的,所述水凝胶的弹性模量为200~500kPa。
4.一种导电水凝胶的制备方法,其特征在于:将权利要求1~2中任一项所述的制备方法得到水凝胶或权利要求3所述的水凝胶与单体吡咯混合;然后将水凝胶与铁离子溶液混合,反应。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:
所述水凝胶与单体吡咯混合的时间为0.5~3h;
所述反应的时间为4~8h;
优选的,所述铁离子溶液为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、氧化铁和高氯酸铁中的至少一种。
6.一种导电水凝胶,通过权利要求4或5所述的制备方法得到;
优选的,所述导电水凝胶的平行于胶原纤维方向的最大断裂应力为496.26~615.53kPa;
优选的,所述导电水凝胶的垂直于胶原纤维方向的最大断裂应力为196.24~276.67kPa;
优选的,所述导电水凝胶的平行于胶原纤维方向的弹性模量为485~597kPa;
优选的,所述导电水凝胶的垂直于胶原纤维方向的弹性模量为171~400kPa;
优选的,所述导电水凝胶的平行于胶原纤维方向的电流密度为0.00544~0.00651A/cm2;
优选的,所述导电水凝胶的垂直于胶原纤维方向的电流密度为0.00189~0.00411A/cm2;
优选的,所述导电水凝胶的平行于胶原纤维方向的电导率为0.82~1.5S/cm;
优选的,所述导电水凝胶的垂直于胶原纤维方向的电导率为0.71~1.37S/cm。
7.权利要求3所述的水凝胶和/或权利要求6所述的导电水凝胶在制备心肌补片中的应用。
8.一种心肌补片,其特征在于:含有权利要求4~5中任一项所述的制备方法得到的导电水凝胶和/或权利要求6所述的导电水凝胶;
优选的,所述心肌补片还包含心肌细胞。
9.一种心肌补片的制备方法,其特征在于:将心肌细胞接种至权利要求4~5中任一项所述的制备方法得到的导电水凝胶和/或权利要求6所述的导电水凝胶上培养。
10.权利要求8所述的心肌补片和/或权利要求9所述的制备方法得到的心肌补片在制备医疗器械中的应用。
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