CN112957406A - 普洱熟茶水提物在制备增强机体免疫力和/或炎症水平的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了普洱熟茶水提物在制备增强机体免疫力和/或炎症水平的药物中的应用，属于生物药物技术领域。包括茶多酚、茶褐素、茶多糖和/或普洱熟茶的水提物在内的普洱熟茶的化学成分在制备诱导HSPA1A表达的药物中的应用。普洱熟茶的的化学成分不仅通过诱导HSPA1A表达促进巨噬细胞炎症水平，炎症因子将肿瘤细胞的刺激信号传递并激活巨噬细胞，启动机体免疫系统保护损伤细胞，而且通过抑制TLR4介导的MyD88/NF‑κB信号通路进而抑制JNK2和P38的表达维持巨噬细胞的免疫原性；普洱熟茶的化学成分还能增强eHSPA1A和巨噬细胞的结合。普洱熟茶的水提物作为调节HSPA1A表达的试剂在制备增强机体免疫力的药物中的应用。

Description

普洱熟茶水提物在制备增强机体免疫力和/或炎症水平的药 物中的应用

技术领域

本发明属于生物药物技术领域，具体涉及普洱熟茶水提物在制备增强机体免疫力和/或炎症水平的药物中的应用。

背景技术

茶在我国已经有多年的历史，它具有独特的香气，能够提神醒脑，同时又是一种天然的保健产品，深受国内外，乃至全世界人民的喜爱。茶有很多种类，包括普尔茶、红茶和绿茶等。普洱熟茶产自中国云南，经独特的加工工艺发酵而成，属于后发酵熟茶。其滋味醇厚，陈香显著。除此之外，普洱熟茶还具有多种功效，如抗氧化、抗菌、预防细胞癌变、降血脂、降血压和降胆固醇等。

许多研究表明，普洱熟茶除了能够预防癌症之外，还有明显的杀伤肿瘤的作用。例如，L Armstrong等发现普洱茶提取物对肿瘤细胞具有细胞毒性和抗增值的作用。赵航等、Zhao Xin等人也指出普洱茶能够抑制肿瘤细胞的增值和侵袭，同时通过上调Bax，下调Bcl-2来诱导其凋亡。

热休克蛋白1A(HSPA1A)，即hsp72，是由HSPA1A基因编码的蛋白质。作为hsp70家族成员之一，HSPA1A在翻译过程中起着重要的作用，并能够纠正错误折叠的蛋白，识别突变蛋白并使其降解。同时，HSPA1A还能促进DNA的修复，包括碱基切除修复(BER)和核苷酸切除修复(NER)，HSPA1A与细胞的信号转导、凋亡、蛋白质稳态、细胞的生长等息息相关。另外，HSPA1A还与癌症、神经退行性疾病、细胞衰老等有很大关联。据悉胞内和胞外HSPA1A都能调节抗肿瘤免疫，Yasuaki Tamura等指出HSPA1A成为连接先天免疫和获得性免疫的桥梁。此外，它还能够提高抗原的呈递作用，并与APC、巨噬细胞、树突细胞表面受体相互作用。

鉴于上述HSPA1A的诸多应用，然而现有技术中，关于如何诱导HSPA1A表达的增加的报道不多，这无疑阻碍了由HSPA1A参与的相关疾病的治疗的开展和研发。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种普洱熟茶水提物的新用途，即普洱熟茶水提物在制备诱导热休克蛋白1A表达的药物中的应用。

本发明提供了普洱熟茶的化学成分在制备诱导热休克蛋白1A表达的药物中的应用；所述普洱熟茶的化学成分包括茶多酚、茶褐素、茶多糖和/或普洱熟茶的水提物。

优选的，所述普洱熟茶水提物的制备方法，包括以下步骤：

将普洱熟茶茶粉用水提取后，分离水相，得到普洱熟茶水提物；

所述提取的温度为90～100℃；所述提取的时间为1～1.5h。

本发明提供了一种诱导热休克蛋白1A表达的试剂在制备上调机体炎症水平的药物中的应用。

优选的，所述热休克蛋白1A通过提高促炎因子水平、降低抑炎因子水平来达到上调机体炎症水平的目的；

所述促炎因子包括IL1α、IL1β、IL12α、IL12β和/或IL6；

所述抑炎因子包括IL13。

本发明提供了一种诱导热休克蛋白1A表达的试剂在制备提高机体免疫力的药物中的应用。

优选的，所述提高机体免疫力包括增强热休克蛋白1A与巨噬细胞结合，和维持巨噬细胞的免疫原性两个方面。

优选的，所述维持巨噬细胞的免疫原性是所述普洱熟茶的化学成分抑制TLR4介导的MyD88/NF-κB信号通路进而抑制下游JNK2和P38的表达实现。

本发明提供了一种诱导热休克蛋白1A表达的试剂在制备治疗胃癌的生物免疫药物中的应用。

优选的，所述生物免疫药物为在放疗或化疗后，用于辅助治疗胃癌的生物免疫药物。

优选的，所述诱导热休克蛋白1A表达的试剂包括普洱熟茶的化学成分；

所述普洱熟茶的化学成分包括茶多酚、茶褐素、茶多糖和/或普洱熟茶的水提物。

本发明提供了普洱熟茶的化学成分在制备诱导热休克蛋白1A表达的药物中的应用；所述普洱熟茶的化学成分包括茶多酚、茶褐素、茶多糖和/或普洱熟茶的水提物。实验表明，分别采用茶多酚粗提物、茶褐素粗提物、茶多糖粗提物和普洱熟茶的水提物处理转染有HSPA1A质粒的胃癌细胞，用荧光素强度表征HSPA1A的表达水平，结果表明，与对照相比，上述处理方案均能显著增强肿瘤细胞中HSPA1A的表达；同时用普洱熟茶的水提物处理胃癌细胞后检测细胞中蛋白和mRNA表达情况，结果进一步表明普洱熟茶的水提取能够上调肿瘤细胞中的HSPA1A水平。

本发明提供了一种诱导热休克蛋白1A表达的试剂在制备上调机体炎症水平的药物中的应用。本发明通过构建了高表达HSPA1A细胞模型以及低表达HSPA1A细胞模型，分别定量检测高表达HSPA1A细胞模型以及低表达HSPA1A细胞模型组的炎症因子，结果表明，随着HSPA1A表达水平的不断增加，促炎因子水平IL1α、IL1β、12α、12β、IL6也随之增加；抑炎因子IL13水平逐渐下降；而在加入HSPA1A抑制剂后，促炎因子表达开始下降。IL13表达量开始增加。这说明普洱熟茶能够上调巨噬细胞的炎症水平。

本发明提供了一种诱导热休克蛋白1A表达的试剂在制备提高机体免疫力的药物中的应用。实验证明，普洱熟茶的水提物能够通过调节HSPA1A的表达促进巨噬细胞炎症水平，这些炎症因子能够将肿瘤细胞的刺激信号传递并激活巨噬细胞，从而启动机体免疫系统来保护损伤细胞；普洱熟茶的水提物能够通过抑制TLR4介导的MyD88/NF-κB信号通路进而抑制下游JNK2和P38的表达，来维持巨噬细胞的免疫原性；同时普洱熟茶的水提物能够增强eHSPA1A和巨噬细胞的结合。综上，本发明证实采用能够诱导热休克蛋白1A表达的普洱熟茶化学成分，能够通过调节HSPA1A的表达来增强机体免疫力。

本发明提供了一种诱导热休克蛋白1A表达的试剂在制备治疗胃癌的生物免疫药物中的应用。鉴于高表达的热休克蛋白1A通过作用巨噬细胞增强机体免疫系统，提高机体的免疫力，从而提出一种新的胃癌的生物免疫疗法，通过恢复机体的免疫平衡，用于胃癌放疗或化疗后的辅助治疗。

附图说明

图1为pHSPA1A-Luc质粒测序结果与原始HSPA1A启动子序列比对结果；

图2为在普洱熟茶的水提物作用下，SGC7901细胞中HSPA1A蛋白及其mRNA水平表达量的变化，图2A表示蛋白水平，其中Control为空白对照组SGC7901，Tea为普洱熟茶加药组；图2B为mRNA水平；

图3为普洱熟茶的水提物作用于Jurkat细胞系后检测多个基因的表达情况；

图4为荧光素酶检测普洱熟茶作用下HSPA1A表达量的变化；

图5为普洱熟茶的水提物中三种活性成分对HSPA1A表达的影响；其中图5A为茶褐素对HSPA1A表达的影响，图5B为茶多酚对HSPA1A表达的影响，图5C为茶多糖对HSPA1A表达的影响。

图6为普洱熟茶通过HSPA1A对炎症因子的影响，其中图6A为普洱熟茶的水提物对促炎因子的影响；图6B为普洱熟茶的水提物对抑炎因子的影响；图6C为HSPA1A高表达和低表达模型以及空白对照组巨噬细胞中HSPA1A的表达量；

图7为普洱熟茶的水提物对与HSPA1A有关的信号通路的影响；

图8为巨噬细胞与eHSPA1A的结合情况.

具体实施方式

本发明提供了普洱熟茶的化学成分在制备诱导热休克蛋白1A表达的药物中的应用；所述普洱熟茶的化学成分包括茶多酚、茶褐素、茶多糖和/或普洱熟茶的水提物。

在本发明中，所述普洱熟茶水提物的制备方法，优选包括以下步骤：将普洱熟茶茶粉用水提取后，分离水相，得到普洱熟茶水提物。所述提取的温度为90～100℃，更优选为100℃。所述提取的时间优选为1～1.5h，更优选为1.2h。所述提取时，所述普洱熟茶茶粉和水的质量比优选为1:20～30，更优选为1:23～27，最优选为1:25。在提取过程中，由于水受热挥发，需不断补充水至体系中。所述提取的次数优选为3～4次。所述分离水相的方法优选采用离心进行。所述离心的转速优选为10000～13000rpm，更优选为11000～12000rpm，最优选为12000rpm；所述离心的时间优选为5～25min，更优选为10～20min，最优选为15min。所述水相优选进行过滤。所述过滤用滤膜的孔径优选为0.22μm。

在本发明中，茶多酚、茶褐素、茶多糖的来源均从制备的普洱熟茶的水提物中萃取得到。所述茶多酚的萃取方法优选依次用氯仿和乙酸乙酯对普洱熟茶的水提物进行萃取，静置分层，得到乙酸乙酯层和水层，收集乙酸乙酯层，去除乙酸乙酯后，冷冻干燥得到茶多酚粗提物。所述茶多酚的萃取方法参考现有技术得到([1]彭映林,谢丹,李媛,张劲.黑茶中茶多酚的提取及其含量测定方法的研究进展[J].广东化工,2019,46(19):110-111+138.[2]罗学平,李丽霞,成洲,李清,李丹,敬廷桃.茶多酚氧化产物制备方法研究进展[J].南方农业,2017,11(22):96-99.)。所述萃取的次数优选包括3～4次。所述去除乙酸乙酯的方法优选采用减压干燥的方法；所述减压干燥的温度优选为-50℃，更优选为-80℃。所述冷冻干燥的参数优选如下：真空度50Pa，温度-80℃。

在本发明中，所述茶褐素和茶多糖的萃取方法优选如下：将萃取茶多酚时得到的乙酸乙酯水层用正丁醇进行萃取，分别收集正丁醇层和水层，将正丁醇层去除正丁醇后进行冷冻干燥，得到茶多糖粗品。水层用无水乙醇沉淀，取水层；将水层冷冻干燥后得到茶褐素粗品。所述茶褐素的萃取方法参考现有技术得到([1]樊蓉.普洱茶多酚氧化产物的提取分离、成分分析及活性评价[D].武汉:华中农业大学,2007.[2]李连喜.不同制法普洱茶茶褐素及其在贮存中变化的研究[D].重庆:西南大学。[3]云南普洱茶茶褐素主要化学成分的分离及结构鉴定[D].云南农业大学,2011.)。所述茶褐素的萃取方法参考现有技术得到(黄业伟,朱强强,向泽敏,张冬英.普洱熟茶主要成分检测和分离的研究进展与展望[J].中国茶叶加工,2019(01):59-63.)。

在本发明中，采用普洱熟茶的水提物处理胃癌细胞，分别检测所述细胞中热休克蛋白1A的蛋白表达以及mRNA表达情况，与未作任何处理的对照组胃癌细胞相比，普洱熟茶的水提物作用下胃癌细胞中热休克蛋白1A蛋白和mRNA水平的HSPA1A显著上调。这表明普洱熟茶能够上调肿瘤细胞中的HSPA1A水平。

在本发明中，通过构建含热休克蛋白1A启动子的重组质粒pHSPA1A-Luc，将所述重组质粒pHSPA1A-Luc转染至胃癌细胞中，分别采用茶多酚(100～600μg茶多酚粗品/ml)、茶褐素(100～1000μg茶褐素粗品/ml)、茶多糖(100～1000μg茶多糖粗品/ml)和普洱熟茶的水提物(220μg粗品/ml)处理所述细胞，以荧光素酶活性表征热休克蛋白1A的表达情况，结果表明HSPA1A实验组能检测到较高强度的荧光素信号，而空转和阴性对照组均未检测到的荧光素强度，这表明茶多酚、茶褐素、茶多糖和普洱熟茶的水提物均能够增强HSPA1A的表达。同时，与茶褐素、茶多糖相比，茶多酚在较低浓度下(100～200μg粗品/ml)达到较高的HSPA1A诱导表达的效果。

本发明提供了一种诱导热休克蛋白1A表达的试剂在制备上调机体炎症水平的药物中的应用。

在本发明中，所述诱导热休克蛋白1A表达的试剂优选包括普洱熟茶的化学成分；所述普洱熟茶的化学成分优选包括茶多酚、茶褐素、茶多糖和/或普洱熟茶的水提物。所述热休克蛋白1A优选通过提高促炎因子水平、降低抑炎因子水平达到上调机体炎症水平的目的。所述促炎因子优选包括IL1α、IL1β、IL12α、IL12β和/或IL6；所述抑炎因子优选包括IL13。随着HSPA1A表达水平的不断增加，促炎因子水平IL1α、IL1β、IL12α、IL12β、IL6也随之增加；抑炎因子IL13水平逐渐下降；而在加入HSPA1A抑制剂后，促炎因子表达开始下降，IL13表达量开始增加。这说明普洱熟茶能够上调巨噬细胞的炎症水平。

本发明提供了一种诱导热休克蛋白1A表达的试剂在制备提高机体免疫力的药物中的应用。

在本发明中，所述诱导热休克蛋白1A表达的试剂优选包括普洱熟茶的化学成分；所述普洱熟茶的化学成分优选包括茶多酚、茶褐素、茶多糖和/或普洱熟茶的水提物。所述提高机体免疫力优选包括增强热休克蛋白1A与巨噬细胞结合和维持巨噬细胞的免疫原性。

在本发明中，所述维持巨噬细胞的免疫原性优选是所述普洱熟茶的化学成分抑制TLR4介导的MyD88/NF-κB信号通路进而抑制下游JNK2和P38的表达实现。实验证明，肿瘤细胞刺激和普洱熟茶的化学成分的作用下，MyD88/NF-κB信号通路中关键因子水平IκB、MyD88以及NF-κB的表达量大幅度下调，而当HSPA1A被抑制后，IκB、MyD88、NF-κB的表达量开始上调，表明所述关键因子的下调主要是普洱熟茶的化学成分通过调控HSPA1A起作用。

本发明提供了一种诱导热休克蛋白1A表达的试剂在制备治疗胃癌的生物免疫药物中的应用。

在本发明中，所述诱导热休克蛋白1A表达的试剂优选包括普洱熟茶的化学成分；所述普洱熟茶的化学成分优选包括茶多酚、茶褐素、茶多糖和/或普洱熟茶的水提物。针对胃癌，常规的治疗手段包括手术切除，化疗，放疗再辅助一些药物，但是仍存在癌症复发率高、周期长、成本高的问题，通过提高人体自身免疫系统的免疫强度可调动机体的抗癌能力，恢复机体免疫平衡。所述生物免疫药物优选为在放疗或化疗后，用于辅助治疗胃癌的生物免疫药物。

下面结合实施例对本发明提供的普洱熟茶水提物在制备增强机体免疫力和/或炎症水平的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

普洱熟茶的水提物(AEP)的制备方法

将普洱熟茶按照1：25(w:v)的比例加入去离子水，在100℃条件下混合均匀，常规条件超声助溶。在12000rpm离心15min后收集上清液，弃残渣。经所述上清液在无菌条件下经0.22μm滤膜过滤后保存为普洱熟茶母液，在-20℃冷冻备用。

实施例2

茶多酚(TP)、茶褐素(TB)和茶多糖(TPS)的萃取方法

茶多酚的萃取方法：将实施例1制备的普洱熟茶的水提物依次用氯仿和乙酸乙酯分别萃取3次，静置分层，得到乙酸乙酯层和水层；将所述乙酸乙酯层进行在-80℃减压干燥去除乙酸乙酯，在真空度为50Pa条件下进行冷冻干燥，得到茶多酚粗品。

茶褐素和茶多糖的萃取方法：将上述萃取茶多酚时得到的水层与等体积的正丁醇萃取，萃取3次后，得到正丁醇层和水层，取水层，用无水乙醇沉淀，得到水层，经冷冻干燥后，得到茶褐素粗品；得到的正丁醇层减压干燥去除正丁醇后，进行冷冻干燥，得到茶多糖粗品。

实施例3

pHSPA1A-Luc质粒的构建方法

1.设计HSPA1A的启动子序列(SEQ ID NO:1，CAGCCAACGCCCACATACCTCAGGCTTAAACCAACTAGGGAACTTTCCAGTACTTTCCCAAACAAGGACCTACTGAGCCTTTCAGGTTCACAATCAATCAGATCCCTACTGGCTCACCTAGTCTCCCGACGCCTTCGCTTCAGTTTGGAAACGTCCAGATTACGCAGCCCCAGCGAGTAGGTGGGGGCTCCCTCAATATCAAACTGCACAACCGGGGTCCCCCCACCCCCCACCCCGTCCCTCCCTGCAAATTTGAGACGGCTCCAACTCAGTAATCTTTTTCCAAACTGGCCCATGAGGTCAGAGACAGTATCTCCATTGTAACGTGGCCGGGCGGTGTCAACACAAACGCCCCCACCCTCCCCTGGACGCGCGTAACCCGCTCCCCGCACCAGCCCCCTGCCCACAACTGCGCAGGCCCAGCAAGCCCCCACAATTAAAAGCCCAGCGCCGACCCTTCCTGTCAATTAGGCGCTGAAGCGCAGGCGGTCAGCATCGCCATGGAGACCAACACCCTTCCCACCGCCACTCCCCCTTCCTCTCAGGGTCCCTGTCCCCTCCAGTGAATCCCAGAAGACTCTGGAGAGTTCTGAGCAGGGGGCGGCACTCTGGCCTCTGATTGGTCCAAGGAAGGCTGGGGGGCAGGACGGGAGGCGAAAACCCTGGAATATTCCCGACCTGGCAGCCTCATCGAGCTCGGTGATTGGCTCAGAAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTGACGACTTATAAAAGCCCAGGGGCAAGCGGTCCGGATAACGGCTAGCCTGAGGAGCTGCTGCGACAGTCCACTACCTTTTTCGAGAGTGACTCCCGTTGTCCCAAGGCTTCCCAGAGCGAACCTGTGCGGCTGCAGGCACCGGCGCGTCGAGTTTCCGGCGTCCGGAAGGACCGAGCTCTTCTCGCGGATCCAGTGTTCCGTTTCCAGCCCCCAATCTCAGAGCGGAGCCGACAGAGAGCAGGGAACCGGCA)，送公司合成引物，序列如下：

Sense:5’-CCGCTCGAGGCCTTTCAGGTTCACAATCAATC-3’(SEQ ID NO:2)；

Anti-Sense:5’-CCCAAGCTTGCCGGTTCCCTGCTCTCTGT-3’(SEQ ID NO:3)。

2.PCR扩增

利用试剂盒提取SGC细胞基因组DNA，以提取的DNA作为模板，用上述设计的引物进行PCR，PCR反应体系见表1。

表1PCR反应体系

PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，30s；65℃退火，30s；72℃延伸，1min30s；40个循环；72℃，10min；4℃，保存。

3.琼脂糖凝胶电泳成像，由电泳图可知，目的条带为900bp左右，说明PCR扩增成功。

4.胶回收，利用试剂盒

5.酶切：KPNI/HindⅢ双酶切上步回收的PCR产物和PGL-3-basic载体，体系分别如下：在37℃条件下处理4h。

表2PCR产物酶切反应体系

表3载体酶切反应体系

6.琼脂糖凝胶电泳成像，显示酶切的PCR回收产物，条带在900bp附近，载体条带在2000bp左右。证明酶切成功，然后胶回收。

7.连接：将上步回收的载体和模板DNA连接，在25℃条件下连接5h。体系见表4。

表4连接体系

8.转化：将上述10μl连接体系加入1管DH5а中(50μl)，再取另一管DH5а做对照，冰上孵育30min在42℃下热激90s在冰浴2min条件下吸取400μl的液体LB培养基分别加入上述两管DH5а中，在120rpm、37℃下摇床1.5h，在400g离心5min，吸出400μl的液体LB，用剩余液体重悬沉淀，涂平板，在37℃下培养12～16h。

9.摇菌：第二天观察到平板中有单菌落长出，挑3个单菌落，转移至试管中(5ml LB液体培养基)→摇床220rpm,37℃,14-16h。

10质粒提取：利用试剂盒提取质粒

11.质粒测序：送公司测序，跟原始设计的引物序列对此，一致，说明质粒构建成功。

pHSPA1A-Luc质粒测序结果与原始HSPA1A启动子比对结果见图1。测序结果与原始HSPA1A启动子序列对比完全一致，说明质粒构建正确。

实施例4

普洱熟茶的水提物处理胃癌细胞对HSPA1A蛋白及其mRNA的影响将220μg/ml浓度的普洱熟茶的水提物加入SGC7901胃癌细胞中孵育24h后，分别提取对照组和实验组胃癌细胞中的蛋白质和RNA，进行Western blotting和qPCR实验，从蛋白和mRNA水平表征加药组HSPA1A基因的表达变化。

1.Westernblotting法检测胃癌细胞中蛋白含量

1)提取处理后的SGC7901胃癌细胞蛋白：使用RIPA(鼎国，WB-0071，北京)，裂解并提取蛋白。

2)BCA蛋白定量法测蛋白浓度

配制SDS-PAGE凝胶：配制10mL 10％分离胶和5mL的浓缩胶煮样：100℃金属浴，煮样10min，12000rpm离心10min后取上清

电泳：配制电泳缓冲液(现用现配)，具体配制方法如上。将缓冲液倒入电泳槽，设置蛋白浓度梯度(30μg、50μg、100μg、120μg)上样，电压80V电泳2h左右，待目的蛋白泳动至胶下缘1cm以上结束。

转膜：设置恒压100V，在冰浴条件下，电转1.5h。

封闭：将PVDF膜取出，置于PBST中，漂洗30min(每10min换液)后，蛋白面朝上，置于封闭液中摇床上封闭1h。

孵育一抗：将PVDF膜取出，用PBST漂洗30min(每10min换液一次)；按照比例用PBST稀释抗体(HSPA1A兔抗)；将滤膜和抗体共同置于塑料薄膜中，封口后；置于摇床上，4℃孵育二抗：按照同样的方法孵育β-actin内参。

显影。

2.qPCR法检测胃癌细胞中HSPA1A的mRNA表达水平

2.1提取处理后的胃癌细胞的RNA。

2.2去除基因组DNA反应：采用<TB Green qPCR>法，于冰上配制反应液，反转录反应：将反应液置于PCR扩增仪中，设置程序37℃45min，85℃5s，4℃终止并保存。

2.3Real Time PCR反应(应用AppliedBiosystems 7300/7500)：将反应液放入qPCR仪器，设置程序：95℃预变性10min；95℃变性10s；60℃退火20s；72℃延伸15s，进行40个循环。

注：最后一个循环时，将温度从72℃提高到95℃以产生溶解曲线。

2.4数据处理：利用比较循环阈值法(2^-ΔΔCt)计算基因的相对表达量。

3.结果及分析

Westernblotting设置梯度上样量(30、50、100和120μg)，结果表明，30μg的蛋白量即可显示出明显条带，故将30μg选作最佳上样量应用于后续Westernblotting实验。蛋白水平结果如图2A所示，mRNA水平结果如图2B所示。与未作任何处理的对照组胃癌细胞相比，普洱熟茶的水提物作用下的加药组的HSPA1A蛋白和mRNA水平均显著上调。这表明普洱熟茶的水提物能够上调肿瘤细胞中的HSPA1A水平，且与本实验室前期得到的实验基础相一致(图3)。

实施例5

荧光素酶检测实验

将实施例3构建的pHSPA1A-Luc质粒转染到SGC胃癌细胞中，同时转染PEI(线性聚乙烯亚胺瞬时转染试剂)和pGL3-Basic质粒(不含任何启动子)作为阴性对照，加入220μg/ml浓度的AEP作用24h后，利用多功能酶标仪和荧光素酶检测试剂盒检测各孔的荧光素酶强度。

检测结果见表图4。除HSPA1A实验组外，空转和阴性对照组均未达到可检测到的荧光素强度水平，证明了普洱熟茶的水提物能够增强HSPA1A的表达。

实施例6

将实施例3构建的pHSPA1A-Luc质粒转染到SGC胃癌细胞中，将实施例2萃取得到的茶多酚粗品、茶多糖粗品以及茶褐素粗品做梯度浓度稀释(0～1000μg/ml)，将各浓度的茶多酚粗品、茶多糖粗品以及茶褐素粗品分别处理转染后的胃癌细胞，然后置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育12h后，检测荧光素酶强度。

结果见图5。

从图5中可以看出，三种成分均对HSPA1A具有上调作用，其中茶多酚的作用最为明显。同时这一结果也表明，普洱熟茶对HSPA1A的作用是通过多种组分共同发挥作用的。

实施例7

7.1HSPA1A高表达模型的建立

为了验证普洱熟茶的水提物对巨噬细胞免疫系统的影响，将处于应激状态的4T1细胞的上清液加入到raw264.7中作用12h；将220μg/mL的普洱熟茶加入到4T1小鼠乳腺癌细胞中作用24h后，取其上清液加入到raw264.7细胞中继续作用12h，将4T1细胞中高表达的HSPA1A作用于巨噬细胞，通过qPCR实验检验HSPA1A表达水平的变化。

表5qPCR扩增反应体系

扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性10s；60℃退火20s；72℃延伸15s，进行40个循环。

HSPA1A的扩增用引物序列为成品，正向反向引物混合在一起。购买厂家：GeneCopoeia(MD,USA)；人HSPA1A(product code HQP100430)和小鼠HSPA1A(product codeMQP 029410)。

7.2HSPA1A低表达模型的建立

将220μg/mL普洱熟茶的水提物和10nM的HSPA1A抑制剂(CCT251236)同时加入4T1细胞中作用24h，抑制4T1细胞中HSPA1A的表达；取其上清液加入到raw264.7细胞中继续作用12h，然后通过qPCR实验检验HSPA1A表达水平的变化。

结果见图6C。由图6C可知，RAW+4T1+Tea组为HSPA1A高表达组。与对照组相比，普洱熟茶的水提物能诱导HSPA1A高表达，且呈显著性差异，说明成功构建了HSPA1A高表达模型。RAW+4T1+Tea+HSPA1A^Inh组为HSPA1A低表达组。与对照组相比，HSPA1A抑制剂的添加使普洱熟茶的水提物原本诱导高表达的HSPA1A也显著降低，说明成功构建了HSPA1A低表达模型。

实施例8

qPCR实验检测炎症因子的水平

设置了raw264.7细胞空白对照组(RAW)，HSPA1A高表达组(RAW+4T1组和RAW+4T1+Tea组)以及HSPA1A低表达组(RAW+4T1+Tea+HSPA1A^Inh组)。提取对照组和实验组细胞中的RNA，依次进行反转录和qPCR实验，检测巨噬细胞中促炎因子IL1α、IL1β、TNF-α、12α、12β、IL6以及抑炎因子IL13的水平变化(具体方法参见实施例7)。各炎症因子扩增用引物购买自GeneCopoeia(MD,USA)；货号：IL1α(Product code MQP029459)IL1β(product codeMQP092978)，IL6(product code MQP088500),IL12α(product code MQP092959),IL12β(product code MQP080106),IL13(product code MQP092962)。

普洱熟茶能够促进巨噬细胞的炎症水平的结果见图6。如图6C所示，4T1单独作用和AEP+4T1共同作用下的巨噬细胞中的HSPA1A明显升高，其中在普洱熟茶存在的情况下，HSPA1A水平最高，说明HSPA1A高表达模型构建成功；相反，在有抑制剂CCT251236存在的情况下，HSPA1A被显著抑制，显著低于对照组，说明HSPA1A低表达模型构建成功。

如图6A和图6B所示，随着HSPA1A表达水平的不断增加，促炎因子水平IL1α、IL1β、IL12α、IL12β、IL6也随之增加；抑炎因子IL13水平逐渐下降；而在加入HSPA1A抑制剂后，促炎因子表达开始下降。IL13表达量开始增加。这说明普洱熟茶能够上调巨噬细胞的炎症水平。

IL1α表现出强大的促炎因子活性，在细胞遭受损伤时发出警报信号，提醒免疫系统。由单核或巨噬细胞产生的IL1β能够激活中性粒和巨噬细胞吞噬病原体，在免疫过程中发挥重要作用。IL12是连接先天性和抗原特异性适应性免疫的桥梁，而IL6能够促进T细胞和巨噬细胞的分化和激活。IL1α和IL1β的大幅度上调可能是因为普洱熟茶通过HSPA1A，激活toll/IL-1信号通路来启动免疫并促炎。总而言之，这些促炎因子的上调可能是因为在肿瘤细胞的刺激下，机体发出警报，激活巨噬细胞，启动免疫系统来保护损伤细胞。

实施例9

普洱熟茶的水提物能够抑制TLR4介导的MyD88/NF-κB信号通路

利用qPCR检测raw264.7细胞空白对照组，HSPA1A高表达组以及HSPA1A低表达组中MyD88/NF-κB信号通路中的关键因子水平，如MyD88,NF-κB,IκB,ERK1(MAPK3)ERK2(MAPK1),JNK1(MAPK8)JNK2(MAP K9)和P38(MAPK14)，具体参见实施例7记载方法。各关键因子扩增用引物购买自GeneCopoeia(MD,USA)；货号：IκB(product code MQP092949),NFκB(productcode MQP027731)，MAPK8(product code MQP099059),MyD88(product code MQP093744)、MAPK1(product code MQP025165)、MAPK3(product code MQP030696)、MAPK9(productcode MQP099061)、MAPK14(product code MQP099055)。

如图7A可知，在肿瘤细胞刺激和普洱熟茶作用下均能够抑制IκB、MyD88、NF-κB的水平，加入HSPA1A抑制剂后，IκB、MyD88、NF-κB开始上调，说明这种下调主要是普洱熟茶通过调节HSPA1A实现的。

实施例10

普洱熟茶的水提物通过HSPA1A抑制JNK2和P38的表达

利用qPCR检测raw264.7细胞空白对照组，HSPA1A高表达组以及HSPA1A低表达组中ERK、JNK和P38水平(参照实施例9记载的方法进行)。

如图7B，在普洱熟茶的水提物作用下，ERK、JNK和P38水平皆下降，其中JNK2(MAPK9)、P38(MAPK14)下降趋势最为明显。肿瘤细胞和巨噬细胞共培养时，机体为了自我保护，诱导HSPA1A的生成；而在加入普洱熟茶的水提物作用后，又大幅度上调HSPA1A，导致其过度表达。JNK2和P38的下调可能是因为HSPA1A为了保证活化的巨噬细胞的免疫原性，通过抑制JNK2和P38，进而抑制下游P53启动的细胞凋亡。加入了HSPA1A抑制剂后，JNK2(MAPK9)、P38(MAPK14)上调，这也证实了我们推测的合理性。toll样受体和NF-κB能够影响下游的MAPK信号通路中ERK、JNK和P38的活化。MyD88/NF-kB通路被抑制后，下游ERK,JNK和P38也随之被抑制，上面已经证明普洱熟茶能够抑制MyD88/NF-kB信号通路，这证实了我们猜想的可靠性。

实施例11

普洱熟茶通过增强巨噬细胞与eHSPA1A的结合来增强机体免疫力具体方法如下：

1.将raw264.7细胞铺设六孔板(2×10⁵个细胞/孔)，分别设置raw264.7空白对照组、HSPA1A高表达组和低表达组(详情见实施例8)，每孔设置3个复孔；

2.取出六孔板，收集各组细胞后，用冰的PBS清洗一次，离心弃上清；

3.用冰的PBS、10％FCS、1％叠氮化钠配制缓冲液，将该缓冲液与1μg/mL的HSPA1A抗体(abcam,ab61907,UK,Cambridge)混匀后重悬上步细胞沉淀；

4.在4℃下避光培养30min；

5.用PBS清洗细胞三次，1200rpm离心5min，然后重悬于500μL冰冷的PBS、10％FCS及1％叠氮化钠缓冲液中；然后尽快上机检测。

结果见图8。与对照组巨噬细胞相比，所有加药组(4T1和普洱熟茶作用下)的eHSPA1A和巨噬细胞结合均加强。其中4T1和raw264.7巨噬细胞共培养时，eHSPA1A与巨噬细胞结合最强；而当有普洱熟茶存在时，这种结合反而减弱，但总体来说还是强于对照组。这说明普洱熟茶作用下，增强了巨噬细胞与eHSPA1A的结合。

TLR4介导的MyD88/NF-κB是eHSPA1A与免疫细胞发生信号转导的主要通路之一。据报道，天然多酚类化合物能够抑制TLR4的表达，进而抑制TLR4所介导的MyD88/NF-κB信号通路。因此，普洱熟茶提取物处理后巨噬细胞表面HSPA1A结合量的降低可能与其所含的多酚类物质具有密切的关系。另一方面，酚类成分还可以抑制溶酶体的酸化，从而导致肿瘤细胞HSPA1A向胞外的分泌减少；同时，其较强的抗氧化活性也是造成eHSPA1A减少的可能原因之一。但值得注意的是，普洱熟茶提取物处理组的巨噬细胞表面HSPA1A结合量仍然均显著高于对照组，HSPA1A抑制剂虽然能在减少eHSPA1A与巨噬细胞的结合，但其并未能改变这一趋势。这一结果进一步证明了普洱熟茶可以通过调节HSPA1A的表达来促进巨噬细胞的免疫反应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 普洱熟茶水提物在制备增强机体免疫力和/或炎症水平的药物中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 986

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagccaacgc ccacatacct caggcttaaa ccaactaggg aactttccag tactttccca 60

aacaaggacc tactgagcct ttcaggttca caatcaatca gatccctact ggctcaccta 120

gtctcccgac gccttcgctt cagtttggaa acgtccagat tacgcagccc cagcgagtag 180

gtgggggctc cctcaatatc aaactgcaca accggggtcc ccccaccccc caccccgtcc 240

ctccctgcaa atttgagacg gctccaactc agtaatcttt ttccaaactg gcccatgagg 300

tcagagacag tatctccatt gtaacgtggc cgggcggtgt caacacaaac gcccccaccc 360

tcccctggac gcgcgtaacc cgctccccgc accagccccc tgcccacaac tgcgcaggcc 420

cagcaagccc ccacaattaa aagcccagcg ccgacccttc ctgtcaatta ggcgctgaag 480

cgcaggcggt cagcatcgcc atggagacca acacccttcc caccgccact cccccttcct 540

ctcagggtcc ctgtcccctc cagtgaatcc cagaagactc tggagagttc tgagcagggg 600

gcggcactct ggcctctgat tggtccaagg aaggctgggg ggcaggacgg gaggcgaaaa 660

ccctggaata ttcccgacct ggcagcctca tcgagctcgg tgattggctc agaagggaaa 720

aggcgggtct ccgtgacgac ttataaaagc ccaggggcaa gcggtccgga taacggctag 780

cctgaggagc tgctgcgaca gtccactacc tttttcgaga gtgactcccg ttgtcccaag 840

gcttcccaga gcgaacctgt gcggctgcag gcaccggcgc gtcgagtttc cggcgtccgg 900

aaggaccgag ctcttctcgc ggatccagtg ttccgtttcc agcccccaat ctcagagcgg 960

agccgacaga gagcagggaa ccggca 986

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgctcgagg cctttcaggt tcacaatcaa tc 32

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccaagcttg ccggttccct gctctctgt 29

Claims (10)

1.普洱熟茶的化学成分在制备诱导热休克蛋白1A表达的药物中的应用；所述普洱熟茶的化学成分包括茶多酚、茶褐素、茶多糖和/或普洱熟茶的水提物。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述普洱熟茶水提物的制备方法，包括以下步骤：

将普洱熟茶茶粉用水提取后，分离水相，得到普洱熟茶水提物；

所述提取的温度为90～100℃；所述提取的时间为1～1.5h。

3.一种诱导热休克蛋白1A表达的试剂在制备上调机体炎症水平的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述热休克蛋白1A通过提高促炎因子水平、降低抑炎因子水平来达到上调机体炎症水平的目的；

所述促炎因子包括IL1α、IL1β、IL12α、IL12β和/或IL6；

所述抑炎因子包括IL13。

5.一种诱导热休克蛋白1A表达的试剂在制备提高机体免疫力的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述提高机体免疫力包括增强热休克蛋白1A与巨噬细胞结合和维持巨噬细胞的免疫原性。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述维持巨噬细胞的免疫原性是所述普洱熟茶的化学成分抑制TLR4介导的MyD88/NF-κB信号通路进而抑制下游JNK2和P38的表达实现。

8.一种诱导热休克蛋白1A表达的试剂在制备治疗胃癌的生物免疫药物中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述生物免疫药物为在放疗或化疗后，用于辅助治疗胃癌的生物免疫药物。

10.根据权利要求3、5和8任意一项所述应用，其特征在于，所述诱导热休克蛋白1A表达的试剂包括普洱熟茶的化学成分；

所述普洱熟茶的化学成分包括茶多酚、茶褐素、茶多糖和/或普洱熟茶的水提物。

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