CN112945946A - 一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，属于化学检测及药物分析技术领域，包括如下步骤：(1)使用透明质酸酶对透明质酸凝胶进行酶降解处理；(2)取等量经步骤(1)酶降解获得的样品，分为降解组和总糖组，降解组加入分离剂，总糖组加入与所述分离剂等量的水，两组各自混合均匀后离心，取上清，用水稀释后待检测；(3)通过咔唑显色反应测定步骤(2)降解组和总糖组待检测样品葡萄糖醛酸的吸光度值，降解组吸光度值与总糖组吸光度值的比值即为透明质酸凝胶的体外降解率。本发明方法操作简单、快速、成本低，适用于交联透明质酸凝胶和未交联透明质酸凝胶的体外降解率测定。

Description

一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法
技术领域
本发明属于化学检测及药物分析技术领域，具体涉及一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法。
背景技术
透明质酸由(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接组成，是一种链状聚阴离子黏多糖；透明质酸及其盐是人和动物皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分，参与多种细胞活动和组织过程。基于透明质酸良好的生物相容性，其已被广泛应用于食品、日化和医药领域；而高纯度的医用级透明质酸已被制成注射剂，用于眼科、骨科、预防术后粘连、治疗骨性关节炎、类风湿性关节炎以及美容填充。
将透明质酸及其盐应用于上述领域时，通常需要进行透明质酸凝胶的体外降解试验研究，高效液相色谱法(HPLC)和水相凝胶渗透色谱(GPC)是较为常见的检测方法，然而其操作繁琐、设备成本高，不适于推广应用。
因此，亟待提供一种简便、快速、成本低的测定透明质酸凝胶体外酶降解的方法。
发明内容
本发明公开了一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，其操作简单、快速、成本低，适用于交联透明质酸凝胶和未交联透明质酸凝胶的体外降解率测定。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，包括如下步骤：
(1)使用透明质酸酶对透明质酸凝胶进行酶降解处理；
(2)取等量经步骤(1)酶降解获得的样品，分为降解组和总糖组，降解组加入分离剂，总糖组加入与所述分离剂等量的水，两组各自混合均匀后离心，取上清，用水稀释后待检测；
(3)通过咔唑显色反应测定步骤(2)降解组和总糖组待检测样品中葡萄糖醛酸的吸光度值，降解组吸光度值与总糖组吸光度值的比值即为透明质酸凝胶的体外降解率。
本发明中透明质酸凝胶经过透明质酸酶处理，糖苷键断裂，逐渐降解为单糖；降解组通过添加分离剂可使未降解的透明质酸凝胶沉出，离心取上清液，得到已降解的单糖，通过咔唑显色反应，测得已降解葡萄糖醛酸对应的吸光度值(Abs1)；而总糖组测得是总的葡萄糖醛酸所对应的吸光度值(Abs)，进而根据Abs1/Abs即计算得到凝胶降解率。
本发明采用分离剂对降解和未降解透明质酸凝胶进行有效分离，通过葡萄糖醛酸的吸光度值即可计算体外降解率，无需将吸光度转化为具体的葡萄糖醛酸含量，计算简便，结果准确；酶降解后无需进行酶的灭活，酶的存在对于测定并无影响；且该方法对交联透明质酸凝胶和未交联透明质酸凝胶的体外降解均适用，不会因样品为双相体系造成干扰。
优选地，步骤(1)中，透明质酸酶配置成浓度为2-15U/mL的溶液进行酶降解处理。
进一步优选地，透明质酸酶溶液溶度为5-10U/mL。
优选地，步骤(1)中，取透明质酸凝胶，加入磷酸盐缓冲液和透明质酸酶溶液，37℃恒温振荡酶降解；
磷酸盐缓冲液用量为2-5mL/0.1-0.5g透明质酸凝胶；
透明质酸酶溶液用量为1-5mL/0.1-0.5g透明质酸凝胶；
酶降解时间为2-8h。
优选地，磷酸盐缓冲液浓度0.1M，pH6.8-7.5。
优选地，37℃恒温振荡速度为200-300rpm。
优选地，步骤(2)中，分离剂为无水乙醇、氯代十六烷基吡啶、丙酮、正丁醇或乙醚。
优选地，步骤(2)中，分离剂用量为样品体积的4-10倍。
进一步优选地，步骤(2)中样本用量0.5-1mL，分离剂用量4-5mL。
优选地，步骤(2)中，离心参数为：8000-12000rpm离心10-15min。
优选地，步骤(3)具体为：
1)取降解组及总糖组待检测样品分别置于冰水浴中，缓慢加入四硼酸钠硫酸，混匀；
2)将步骤1)混匀体系置于沸水浴中，加热12-18min，取出后冰水浴冷却；
3)各组加入咔唑乙醇溶液，混匀后沸水浴加热12-18min，取出后冷却至室温；
4)测定降解组及总糖组530nm处吸光度；降解组吸光度值与总糖组吸光度值的比值即为透明质酸凝胶的体外降解率。
优选地，还包括设置对照组，对照组取与透明质酸凝胶等量的水，加入磷酸盐缓冲液，37℃水浴槽中恒温振荡，取出后加分离剂，混合，离心，取上清液，用水稀释后进行咔唑显色反应，用于吸光度测定调零。
一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的试剂盒，包括透明质酸酶，分离剂和磷酸盐缓冲液。
综上，本发明方法操作简单、快速、成本低，适用于交联透明质酸凝胶和未交联透明质酸凝胶的体外降解率测定，应用广泛。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.称取0.2g未交联透明质酸凝胶，置于试管中；
2.称取透明质酸酶(市售，提取于羊睾丸)置于容量瓶中，配置成浓度为5U/mL的透明质酸酶溶液。
3.向装有透明质酸凝胶的试管中加入4mL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.0)和4mL透明质酸酶溶液，37℃水浴槽中250rpm恒温振荡酶降解；
4.分别于酶降解不同时间点取出0.5mL样品2份，1份为降解组，加入4.5mL分离剂，另一份为总糖组，加入4.5mL水，两组分别混合均匀后10000rpm离心15min，取上清液，用水稀释25倍备用，待检测；
5.设置对照组：取0.2g水置于试管中，向试管中加入8mL磷酸盐缓冲液，37℃水浴槽中250rpm恒温振荡，处理一定时间后取出0.5mL，加4.5mL分离剂氯代十六烷基吡啶，混合均匀后10000rpm离心15min，取上清液，用水稀释25倍备用，计为0号管；
6.降解组、总糖组待检测样品以及0号管分别取1mL于试管中，置于冰水浴；缓慢地向每管中加入0.025mol/L四硼酸钠硫酸5mL(使用前在4℃冰箱中贮存至少2h)，混匀；置于沸水浴中加热15min后取出，冰水浴中冷却；各试管内均加入0.125％的咔唑乙醇溶液0.2mL，充分摇匀后，沸水浴中加热15min，冰水浴中冷却至室温；以0号管作为对照，用分光光度计测定530nm处降解组和总糖组的吸光度，降解组吸光度值与总糖组吸光度值的比值即为透明质酸凝胶的体外降解率。结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002919841790000051
表中“+”表示添加对应项下的物质；“-”表示未添加对应项下的物质，而是由水代替；“/”表示无需计算；本发明中其余表格内容均按此方法表示。
实施例2
调节透明质酸酶溶液浓度为2U/mL，以乙醇为分离剂，对未交联透明质酸凝胶体外降解率进行测定；测定方法其余步骤同实施例1，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002919841790000061
实施例3
调节透明质酸酶溶液浓度为10U/mL，以乙醇为分离剂，对未交联透明质酸凝胶体外降解率进行测定；测定方法其余步骤同实施例1，结果如表3所示。
表3
Figure BDA0002919841790000062
实施例4
调节样品用量为0.1g，以乙醇为分离剂，对未交联透明质酸凝胶体外降解率进行测定；测定方法其余步骤同实施例1，结果如表4所示。
表4
Figure BDA0002919841790000071
实施例5
调节样品用量为0.5g，以乙醇为分离剂，对未交联透明质酸凝胶体外降解率进行测定；测定方法其余步骤同实施例1，结果如表5所示。
表5
Figure BDA0002919841790000072
Figure BDA0002919841790000081
实施例6
以丙酮为分离剂，对交联单相透明质酸凝胶体外降解率进行测定；测定方法其余步骤同实施例1，结果如表6所示。
表6
Figure BDA0002919841790000082
实施例7
以正丁醇为分离剂，对双相交联透明质酸凝胶体外降解率进行测定；测定方法其余步骤同实施例1，结果如表7所示。
表7
Figure BDA0002919841790000083
Figure BDA0002919841790000091
对比试验1
验证酶的存在以及分离剂的存在对于吸光度测定的影响，以乙醇为分离剂，以未交联透明质酸凝胶为样品；测定方法其余步骤同实施例1，结果如表8所示。
表8
Figure BDA0002919841790000092
对比试验2
验证酶的存在对于吸光度测定的影响，以乙醇为分离剂，以未交联透明质酸凝胶为样品；测定方法其余步骤同实施例1，结果如表9所示。
表9
Figure BDA0002919841790000101
对比试验3
验证酶的灭活对于吸光度测定的影响，以乙醇为分离剂，以未交联透明质酸凝胶为样品；灭活指酶降解处理后沸水浴处理10min，测定方法其余步骤同实施例1，结果如表10所示。
表10
Figure BDA0002919841790000102
Figure BDA0002919841790000111
由上可知，酶降解处理后样品的吸光度准确度较低，可能是由于灭活过程沸水浴使透明质酸发生了热降解，从而使降解前期吸光度较大，而降解后期时降解率较低。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)使用透明质酸酶对透明质酸凝胶进行酶降解处理；
(2)取等量经步骤(1)酶降解获得的样品，分为降解组和总糖组，降解组加入分离剂，总糖组加入与所述分离剂等量的水，两组各自混合均匀后离心，取上清，用水稀释后待检测；
(3)通过咔唑显色反应测定步骤(2)降解组和总糖组待检测样品中葡萄糖醛酸的吸光度值，降解组吸光度值与总糖组吸光度值的比值即为透明质酸凝胶的体外降解率。
2.根据权利要求1所述的一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，其特征在于，
步骤(1)中，透明质酸酶配置成浓度为2-15U/mL的溶液进行酶降解处理。
3.根据权利要求2所述的一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，其特征在于，
步骤(1)中，取透明质酸凝胶，加入磷酸盐缓冲液和透明质酸酶溶液，37℃恒温振荡酶降解；
所述磷酸盐缓冲液用量为2-5mL/0.1-0.5g透明质酸凝胶；
所述透明质酸酶溶液用量为1-5mL/0.1-0.5g透明质酸凝胶；
酶降解时间为2-8h。
4.根据权利要求1所述的一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，其特征在于，
步骤(2)中，分离剂为无水乙醇、氯代十六烷基吡啶、丙酮、正丁醇或乙醚。
5.根据权利要求1所述的一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，其特征在于，
步骤(2)中，分离剂用量为样品体积的4-10倍。
6.根据权利要求1所述的一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，其特征在于，
步骤(2)中，离心参数为：8000-12000rpm离心10-15min。
7.根据权利要求1所述的一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，其特征在于，
步骤(3)具体为：
1)取降解组及总糖组待检测样品分别置于冰水浴中，缓慢加入四硼酸钠硫酸，混匀；
2)将步骤1)混匀体系置于沸水浴中，加热12-18min，取出后冰水浴冷却；
3)各组加入咔唑乙醇溶液，混匀后沸水浴加热12-18min，取出后冷却至室温；
4)测定降解组及总糖组530nm处吸光度；降解组吸光度值与总糖组吸光度值的比值即为透明质酸凝胶的体外降解率。
8.根据权利要求7所述的一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的方法，其特征在于，
还包括设置对照组，所述对照组以水代替透明质酸凝胶，加入磷酸盐缓冲液，37℃水浴槽中恒温振荡，取出后加分离剂，混合，离心，取上清液，用水稀释后进行咔唑显色反应，用于吸光度测定调零。
9.一种测定透明质酸凝胶体外酶降解率的试剂盒，其特征在于，
包括透明质酸酶，分离剂和磷酸盐缓冲液。
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