CN112941636A

CN112941636A - 一种适用于简化转录组测序的文库构建方法及配套试剂盒

Info

Publication number: CN112941636A
Application number: CN202110359574.8A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Wuhan Boyue Zhihe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Boyue Zhihe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-04-02
Filing date: 2021-04-02
Publication date: 2021-06-11

Abstract

本发明提供了一种适用于简化转录组测序的文库构建方法及配套试剂盒，包括以下步骤：步骤A：总RNA提取与质量控制，进行RNA标记，反转录成cDNA；步骤B：对cDNA进行片段化文库的构建，从而得到简化转录组测序文库。本发明与传统的转录组测序文库构建方法的不同在于：在文库准备过程中，将单个“条形码”序列添加到每个DNA片段中，以便在分析最终数据之前对每个片段进行识别和分类，从而显著提高转录组测序文库的产量，保证数据产出的稳定性。

Description

一种适用于简化转录组测序的文库构建方法及配套试剂盒

技术领域

本发明涉及高通量测序技术领域，具体涉及一种简化转录组测序文库的构建方法。

背景技术

转录组测序是一种通过观察基因表达来分析整个基因组的技术。如今，这种全基因组表达分析是基因组研究的标准工具，因为它们依赖于高通量技术，而这些技术本身已经变得广泛可用。尽管如此，转录组测序仍然是昂贵和费时的，因为它首先需要昂贵的准备一个完整的基因组库——由细胞RNA生成的DNA池——而数据本身也很难分析。所有这些都使得RNA测序难以运行，使得它的采用没有它可能的那么广泛。在单细胞转录组学的革命推动下，一些新的方法得到了帮助。单细胞转录组学使用所谓的“样本条形码”或“多路复用”。在这里，在库准备过程中，将单个“条形码”序列添加到每个DNA片段中，以便在分析最终数据之前对每个片段进行识别和分类，这意味着这种方法只需要一个包含多个不同样本或细胞的库。条形码既降低了成本，又缩短了时间，这可以扩展到大样本的批量转录组测序，但是在批量转录组样本的可靠和廉价分析的适应和验证技术方面仍然存在困难——这就是我们在分析细胞或组织的转录组时所面临的问题。

简化转录组测序是一种新的转录组测序方法，它的成本是传统的商业转录组测序技术成本的1/20。简化转录组是快速且保持了链的特异性，这是该领域的一个挑战，必须在正确的方向上转录DNA。因此，简化转录组提供了一种在数百个RNA样本上执行转录组学的低成本方法，这可以在一次运行中增加生物重复的数量。在性能方面，简化转录组可以在相同的测序深度检测到与该领域“金标准”相同数量的基因，并且该技术即使在低质量的RNA样本中也能产生可靠的数据。此外，它产生全基因组转录组数据的成本相当于使用实时荧光定量分析4个基因，而实时荧光定量目前是测量基因表达的标准但通量低的方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种用于简化转录组测序文库构建文库构建方法。本发明在文库准备过程中，将单个“条形码”序列添加到每个DNA片段中，以便在分析最终数据之前对每个片段进行识别和分类，从而显著提高转录组测序文库的产量，保证数据产出的稳定性。

本发明的技术方案如下：

本申请提供了一种简化转录组测序文库的构建方法，包括以下步骤：

1.一种简化转录组测序文库的构建方法，包括以下步骤：

步骤A：总RNA提取与质量控制，进行RNA标记，反转录成cDNA；

步骤B：对cDNA进行片段化文库的构建，从而得到简化转录组测序文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，所述步骤A包括：

步骤A-1：总RNA提取与质量控制；

步骤A-2：标记RNA，cDNA第一条链合成；

步骤A-3：样品混池；

步骤A-4：混池后进行柱纯化；

步骤A-5：cDNA第二条链合成；

步骤A-6：选用KAPA磁珠对合成产物进行纯化。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于步骤A-2：标记RNA，cDNA第一条链合成包括两个反应体系，反应体系一65℃孵育5分钟后立即至冰上，反应体系二42℃进行50分钟，70℃进行15分钟；步骤步骤A-4：cDNA第二条链合成包括16℃孵育2.5小时。

4.根据权利要求1所述的构建方法，所述步骤B包括：

步骤B-1：cDNA文库的片段化纯化，对纯化后的cDNA片进行段末端修复，得到平末端的DNA片段，将平末端的DNA片段连接上接头，得到加接头的DNA片段；

步骤B-2：样品混池后进行柱纯化；

步骤B-3：对加接头的DNA片段进行PCR扩增；

步骤B-4：选用KAPA磁珠对扩增产物进行纯化，片段筛选得到简化转录组测序文库。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述所述步骤B-1中采用一步法得到加接头DNA片段包括55℃孵育10分钟；

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述所述步骤B-3 PCR反应程序包括变性、退火、延伸步骤；变性步骤可在98℃进行0.2分钟；退火步骤可在63℃进行0.5分钟；延伸步骤可在72℃进行0.5分钟；由上述变性、退火、延伸步骤组成的循环可进行10个。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于所述PCR在温度循环步骤前的模板其特征在于所述PCR在温度循环步骤前的模板可在72℃进行3分钟和98℃进行0.5分钟的热处理。

8.一种用于按如权利要求2-7任一所述的方法构建简化转录组测序文库的配套试剂盒，其特征在于，该配套试剂盒包括：BU3_primers x96（10μM）（Microsynth）；dNTP(0.2mM)；TSO（10μM）；RT buffer；SuperScript™ II Reverse Transcriptase（Lifetech）；RNAse H（NEB）；Escherichia coli DNA ligase（NEB）；E. coli DNA Polymerase（NEB）；dNTP (0 .2mM)；5×Second Stand Buffer(100mM Tris-HCl (pH 6.9)；MgCl₂；KCl；β-NAD；(NH4)₂SO₄；0.6Xbeads（KAPA）；Tn5-B/B(11μM)；5XTAPS buffer（50mM TAPS）；MgCl₂；NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix（NEB）；P5_BRB primer(5μM)（Illumina）；oligobearing Illumina index（Illumina）；0.5Xbeads(KAPA)；0.7Xbeads（KAPA）。

本发明有益的技术效果在于：

本发明提供的简化转录测序方法比现有方法更为科学合理，能够显著提高简化测序文库的产量及纯度，从而保证数据产出的稳定性。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明进行详细说明。需说明的是，此处描述的实施例是对本发明的解释说明，而并非对本发明的限定。

关于下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规实验方法。关于下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径获取。

实施例采用本发明提供的文库构建方法构建简化转录组测序文库。

1、总RNA提取与质量控制

1.1总RNA提取

1）取 50~100 mg（新鲜或-70 ℃及液氮中保存的组织均可），液氮研磨，置2 mL离心管中，加入预冷的TRIzol 液1 mL于匀浆器中，充分混匀。在冰浴中迅速匀浆15-30s，以充分研碎组织。（样品体积不应超过TRIzol 体积的10 %）。

2）细胞悬浮液室温孵育5 min（使核酸蛋白复合物完全分离）。若样品蛋白质/脂肪/糖类含量较高，可10000 r/min 离心1 min，将上清液转移到一新的2 mL 离心管中。

3）加入200 μL氯仿/mL TRIzol，振荡15 s混匀后，室温孵育5 min。

4）4 ℃离心，12000 g 离心15 min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要分布于水相中，水相体积约为所用TRIzol 试剂的60%。

5）将上清液转移至另一干净的1.5 mL离心管中，加入500 μL（等体积）-20 ℃异丙醇/ mL TRIzol，将管中液体轻轻混匀，-20 ℃静置10 min（异丙醇沉淀水相中的RNA，异丙醇与样品体积等量）。

6）4 ℃离心，12000 g 离心10 min，弃上清。（离心前看不出RNA 沉淀，离心后在管侧和底部出现胶状沉淀。）

7）加入4 ℃预冷的75％的乙醇1 mL，轻轻洗涤 RNA沉淀（轻弹管底，使沉淀漂浮）。

8）4 ℃ 7500 g离心5 min，弃上清，重复洗涤1-2次。室温干燥5-10 min（注意不要过分干燥，否则会降低RNA的溶解度）

9）向干燥过的沉淀中加入 50 μL DPEC处理的无菌水溶解沉淀。

10）于-80 ℃保存备用。

1.2 总RNA质检

1）从步骤1.1提取的总RNA 1 µL，用Qubit 3.0检测RNA的总量。

2）吸取3 µL提取的总RNA，用Labchip 2200高灵敏DNA芯片检测RNA的质量与纯度。

3）吸取1 µL提取的总RNA，用NanoDrop200检测RNA浓度。

4）吸取2 µL提取的总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

2.样本标记

2.1一链cDNA的合成

1）一链反应体系成分如表1

2）混匀离心， 65 °C孵育 5 min，立即放冰上；

3）体系成分如表2

4）42℃ 50 min，70℃ 15min，4℃保存；

5）样品混池；

6）混池后进行柱纯化，回溶22 µL。

2.2 cDNA第二条链合成

1）二链反应体系成分如表3

2）16℃，孵育2.5 h；

2.3 cDNA双链纯化。

1）0.6×beads纯化回溶22 µL取20µL。

3. 简化转录组测序文库制备

3.1 简化转录组测序文库制备

1）cDNA片段化、末端修平、3'末端加A、加adaptor接头及片段化选择、PCR扩增及纯化，反应体系成分如表4

2）55 ℃，孵育10min；

3）样品混池后进行纯化，回溶22 µL；

4）PCR反应体系如表5

5）PCR反应程序为72 ℃ 3 min，98 ℃ 30 s; 98 ℃ 10 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30s，共10个循环；72 ℃ 5 min；

6）用0.5×beads以及0.7×beads进行纯化以及片段筛选，回溶17 µL样品。

3.2 测序文库质检

1）用4 µL样品进行文库检测，检测结果如表6

2）从步骤3.1纯化得到的测序文库中吸取1 µL，用Qubit 3.0检测测序文库的总产量;

3）吸取3 µL测序文库，用Labchip 2200高灵敏DNA芯片检测测序文库的浓度与纯度;

4）吸取1µL测序文物，用qPCR检测测序文库摩尔浓度。

附图说明

图1示出了根据本发明一种简化转录组测序文库构建的流程示意图。

图2示出了根据本发明构建的文库Labchip 2200高灵敏DNA芯片检测结果图。

序列表

<110> 武汉博越致和生物科技有限公司

<120> 一种适用于简化转录组测序的文库构建方法及配套试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 78

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag agtacctgaa cnnnnnnnnn nvvvvvtttt tttttttttt 60

tttttttttt ttttttvn 78

<210> 2

<211> 66

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cctgtccgcg gaagcagtgg tatcaacgca 60

gagtac 66

<210> 3

<211> 47

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagcagaag acggcatacg agatctgtcc gcgtctcgtg ggctcgg 47

Claims

1.一种简化转录组测序文库的构建方法，包括以下步骤：

步骤A：总RNA提取与质量控制，进行RNA标记，反转录成cDNA；

2.根据权利要求1所述的构建方法，所述步骤A包括：

步骤A-1：总RNA提取与质量控制；

步骤A-2：标记RNA，cDNA第一条链合成；

步骤A-3：样品混池；

步骤A-4：混池后进行柱纯化；

步骤A-5：cDNA第二条链合成；

步骤A-6：选用KAPA磁珠对合成产物进行纯化。

4.根据权利要求1所述的构建方法，所述步骤B包括：

步骤B-2：样品混池后进行柱纯化；

步骤B-3：对加接头的DNA片段进行PCR扩增；

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤B-1中采用一步法得到加接头DNA片段包括55℃孵育10分钟。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤B-3 PCR反应程序包括变性、退火、延伸步骤；变性步骤可在98℃进行0.2分钟；退火步骤可在63℃进行0.5分钟；延伸步骤可在72℃进行0.5分钟；由上述变性、退火、延伸步骤组成的循环可进行10个。

8.一种用于按如权利要求2-7任一所述的方法构建简化转录组测序文库的配套试剂盒，其特征在于，该配套试剂盒包括：BU3_primers x96（10μM）（Microsynth）；dNTP(0.2mM)；TSO（10μM）；RT buffer；SuperScript™ II Reverse Transcriptase（Lifetech）；RNAse H（NEB）；Escherichia coli DNA ligase（NEB）；E. coli DNA Polymerase（NEB）；dNTP (0.2mM)；5XSecond Stand Buffer(100mM Tris-HCl (pH 6.9)；MgCl₂；KCl；β-NAD；(NH4)₂SO₄；0.6Xbeads（KAPA）；Tn5-B/B(11μM)；5XTAPS buffer（50mM TAPS）；MgCl₂；NEB Next High-Fidelity 2X PCR Master Mix（NEB）；P5_BRB primer(5μM)（Illumina）；oligo bearingIllumina index（Illumina）；0.5Xbeads(KAPA)；0.7Xbeads（KAPA）。