CN112940998A

CN112940998A - 一种用于预防细菌性疾病的菌株及应用

Info

Publication number: CN112940998A
Application number: CN202110531670.6A
Authority: CN
Inventors: 杨顶珑; 吕成杰; 赵建民
Original assignee: Shandong Fishermen Hall Biotechnology Co ltd; Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Shandong Fishermen Hall Biotechnology Co ltd; Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2021-05-17
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2041-05-17
Also published as: CN112940998B

Abstract

本发明提供了一种用于预防细菌性疾病的菌株及应用；该菌株的分类命名为侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus，该菌株已于2020年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：中国北京，保藏编号为CGMCC NO.20038。将本发明中的益生菌添加到对虾饲料中，结果证实对虾感染副溶血弧菌和哈维氏弧菌后存活率提高，且对虾的生长速度和养殖水质均得到改善。

Description

一种用于预防细菌性疾病的菌株及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域；尤其涉及一种用于预防细菌性疾病的菌株及应用。

背景技术

随着世界经济的迅速发展，水产养殖业的规模不断扩大，然而高密度的养殖模式和养殖品种单一等现状导致养殖生态环境失调，各种病害频发，给养殖用户造成了巨大的经济损失。早期死亡综合征（EMS）、急性肝胰腺坏死病（AHPND）和急性肝胰腺坏死综合征（AHPNS）等是近年来影响对虾养殖最为严重的疾病之一，其中主要的病原体是副溶血弧菌。此外，在幼虾阶段，对虾易患荧光病，萤光病也会导致较高的致死率，并且防治困难。其中，主要的病原体是哈维氏弧菌。因此，预防细菌性疾病对于对虾养殖具有重要的意义。

目前在对虾疾病防治中广泛使用的是抗生素，但是抗生素的使用会干扰养殖水环境及对虾肠道中有益微生物菌群的正常生长和繁殖，增强对虾对病原微生物的易感性，还会在一定程度上导致病原菌的耐药性增强。另外抗生素的使用还会导致其在水生动物体内的残留、富集，最终将危害人类的健康。

生物拮抗是微生物群落内普遍存在的自然现象，在同一生态位中多种环境微生物之间通过营养或空间竞争、分泌抗生素或者细菌素等抑制其它微生物的生长。微生物控制技术便是应用该原理，将具有某种特异拮抗性的有益菌加入水体或者直接投喂养殖鱼对虾，杀死或抑制病原微生物，从而达到控制一些疾病的目的。益生菌的应用是一种对上述水产养殖业所面临问题十分有效的解决途径之一，它为解决当前水产养殖中各种病害大量传播、抗生素肆意滥用、养殖环境持续恶化、病原耐药性不断加强、养殖动物药物残留较为严重等问题奠定了一定的基础。

发明内容

本发明的目的是提供了一种用于预防细菌性疾病的菌株及应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种用于预防细菌性疾病的菌株，该菌株的分类命名为侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus，该菌株已于2020年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：中国北京，保藏编号为CGMCC NO.20038。

本发明所述的侧孢短芽孢杆菌是一种产生孢子的需氧革兰氏阳性细菌，适宜生长温度为30℃，所述侧孢短芽孢杆菌对包括暴露于紫外线、干燥和诸如过氧化氢的氧化剂存在的环境胁迫具有高抗性。

本发明所涉及的菌株LB26-6，其有效成分为侧孢短芽孢杆菌，其他成分包括其培养基、其浓缩物、或其干物质。

本发明所涉及的菌株LB26-6，具有抵抗副溶血弧菌（其引起对虾养殖过程问题的急性肝胰腺坏死病）和抵抗哈维氏弧菌（其引起荧光病）的抗菌活性；

另外，本发明所涉及的菌株LB26-6具有提高对虾肝胰腺的免疫力的效果，所述益生菌的活性成分为侧孢短芽孢杆菌（CGMCC NO. 20038）菌株，本发明所涉及的菌株LB26-6可用作对虾饲料添加剂。

优选地，该菌株的细菌计数为1×10⁷ CFU/g -1×10⁹CFU/g。

本发明还涉及前述用于预防细菌性疾病的菌株的应用，所述菌株LB26-6用于预防南美白对虾细菌性疾病。其中，包括侧孢短芽孢杆菌（CGMCC NO. 20038）益生菌制剂导致对虾肝胰腺坏死病或荧光病的症状抑制或延迟的任何行为。

经确认，相比于对照组，本发明所涉及的益生菌制剂添加组可提高对虾对副溶血弧菌和哈维氏弧菌的抗病性。

本发明通过对养殖水进行收集和分析，发现养殖水中弧菌数目低于对照组的菌数，从而证明菌株LB26-6可提高养殖对虾的养殖水质，特别是降低水体中的弧菌数量。

本发明所述的菌株LB26-6形成内生孢子，对热非常稳定。因此，菌株LB26-6优先被制备成干粉形式，作为饲料添加剂或水质改良剂。

本发明所涉及的菌株LB26-6为液体或干燥状态，优选干燥粉末的形式；其中，干燥过程可通过空气干燥、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等进行。

本发明所涉及的菌株LB26-6可以用于饲料中作为添加剂，其重量的占比按0.1％至1％的比例与饲料混合。

本发明所涉及的菌株LB26-6可以增强对虾的抗病性，提高对虾非特异性免疫活力。使用所述菌株，可以产生抵抗副溶血弧菌和哈维氏弧菌的益生效果，可更安全地养殖对虾。

本发明具有以下优点：

将本发明中的益生菌添加到对虾饲料中，结果证实对虾感染副溶血弧菌和哈维氏弧菌后存活率提高，且对虾的生长速度和养殖水质均得到改善。

附图说明

图1是副溶血弧菌侵染下对虾的存活曲线图；

图2是哈维氏弧菌侵染下对虾的存活曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。

实施例1

本实施例涉及一种用于预防细菌性疾病的菌株，该菌株的分类命名为侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus，该菌株已于2020年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：中国北京，保藏编号为CGMCC NO.20038。

（1）菌株的分离和纯化

实验所需凡纳滨对虾采集于山东省烟台市蓬莱海域野生对虾肠道。具体步骤为：将对虾置于冰盒中冷藏带回实验室，用75%乙醇进行体表消毒；无菌解剖取其中肠置于2 ml匀浆管，加入1 ml预冷的灭菌生理盐水和适量磁力匀浆珠，以5500次/min的频率充分匀浆2×20 s，中间间隔10 s。匀浆液经10倍系列稀释到10^-7，分别取10^-7、10^-6、10^-5、10^-4、10^-3这5个稀释度的样品各150μl，涂布到LB肉汤平板，每个稀释度接种3个平板，接种的平板于30℃恒温培养1-3 d。选择菌落清晰的平板上菌落形态不同的菌株进行分离，并通过多次划线纯化细菌，直至平板上菌落形态相同。共获得8株纯化菌株，命名为LB 26-1、LB 26-2、LB 26-3、LB 26-4、LB 26-5、LB 26-6、LB 26-7、LB 26-8。纯化后的菌株用30%甘油制成菌悬液，保藏于-80℃备用。

（2）具有抗菌活性的益生菌的选择、鉴定及保藏

为了选择具有副溶血弧菌和哈维氏弧菌抗菌活性的菌株，进行透明圈试验。将100μL的病原菌（副溶血弧菌和哈维氏弧菌）与100 mL 的2216E琼脂培养基混合，倾注培养皿中以制备病原菌平板。在病原菌平板上制备琼脂井，将待筛选菌株加入到琼脂井中，30℃下静置培养24 h，观察病原菌平板上是否产生透明圈。菌株的抗菌能力检测分析结果如表1所示。

表1

表1中，+++：强抑菌活性，+：存在抑菌活性，-：无抑菌活性

如表1中所示，菌株LB 26-6显示出对副溶血弧菌和哈维氏弧菌最优异的体外抗菌效果。

（3）LB 26-6菌株分子鉴定

采用PCR 扩增技术，扩增菌株16S rDNA区域。扩增完成后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳系统检测和回收。16S rDNA的长度为1500 bp左右，如PCR产物在相应分子量处出现明亮条带，说明16S rDNA扩增成功。回收胶电泳时使用新制的缓冲液，电场强度不超过20V，电泳温度低于30℃，避免出现条带模糊和条带不规则迁移。

扩增片段经北京睿博生物科技公司 Illumina Miseq PE300 测序平台进行测序。根据16S rDNA序列PCR扩增测序结果，在NCBI网站上进行BLAST比对，发现菌株LB 26-6与Brevibacillus laterosporus的同源性达到99%，结合形态特征和生理生化特性，将菌株LB26-6鉴定为侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus。

（4）菌株安全性评价

使用血平板划线法判断菌株安全性。评定依据为产生透明圈的为严重溶血-α溶血，产生草绿色溶血环的为轻微溶血-β溶血，没有溶血环产生的为不溶血-γ溶血。实验结果证明LB 26-6菌株为安全性菌株，可用于后续实验。

（5）药敏性检测

药敏实验采用纸片琼脂扩散法进行。取过夜培养的LB 26-6菌悬液100 μl涂布LB平板上，贴放抗菌药物纸片，预扩散30 min后，置于30℃下恒温培养18-24 h，培养结束后测量并记录抑菌圈直径。每种抗菌药物纸片均作三个重复。

根据 WHO 提供的 NCCLS 最新版本对敏感或耐药的判断标准，得出菌株 LB 26-6对8大类 16 种抗生素的药敏结果如表2所示。结果表明，菌株LB 26-6几乎对所用抗生素均敏感，表明LB 26-6可用于后续的实验以及开发应用。

表2

表2中：VS为超级敏感 (抑菌圈半径＞ 1 cm)；S为敏感(1 cm ＞抑菌圈半径＞0.5 cm)；SS为略微敏感 (0.5 cm ＞抑菌圈半径＞ 0.2 cm)。

实施例2

本实施例涉及LB 26-6菌粉的制备工艺流程：斜面种子-茄形瓶种子液-20 L发酵罐-絮凝离心-晾干粉碎。

具体步骤如下：

用无菌水将斜面菌种冲洗到含有灭菌培养基的茄形瓶中，30℃震荡培养16 h，作为发酵种子液。

将玉米面、豆饼粉等培养基于121℃下高温灭菌30 min，加适量自来水（约7 L）搅匀，转至20 L发酵罐内。分别在45~50℃、65~70℃下用蛋白酶、淀粉酶各水解1h。向培养基中加入用自来水混悬的碳酸钙、硫酸镁和葡萄糖，将混合后的培养基转入罐中，定容至10 L，加少许消泡剂，调pH到7.0左右。在121℃下灭菌30 min并冷却。将茄形瓶种子液加入到20 L发酵罐内。

发酵调整罐压0.05 MPa，温度37℃。搅拌起始200 rpm。2 h后300 rpm，4h后400rpm，5h后450 rpm。视起泡情况手动流加消泡剂。溶氧≥30%。镜检芽孢形成情况，当芽孢形成率大约在95%以上时，停止培养。

发酵液的量，加入质量百分数为4%氯化钙，溶解后再加入4%磷酸氢二钠，搅拌溶解。加入5%碳酸钙，搅匀。4000 rpm、4 min离心收集菌体。然后50℃烘至半干时，在室外晾干，粉碎后即为菌粉（1×10¹¹CFU/g）。

实施例3

本实施例涉及一种饲料的制备方法。

包括以下步骤：

幼虾饲料配方以鱼粉为动物蛋白原，豆粕、玉米粕为植物蛋白源，鱼油和磷脂油为脂肪源，配制成粗蛋白为64.6 %，粗脂肪为7.4%的基础饲料，具体饲料配方见表3。

表3

表3中，鱼粉：粗蛋白，710 g/kg干物质；粗脂质，108 g/kg干物质；

豆粕，粗蛋白，527 g/kg干物质；粗脂质，19 g/kg干物质；

小麦粉，粗蛋白，940 g/kg干物质；粗脂质，140 g/kg干物质；

花生粉，粗蛋白，540 g/kg干物质；粗脂质，34 g/kg干物质；

磷虾粉，粗蛋白，797 g/kg干物质；粗脂肪，36 g/kg干物质；

多矿：NaCl （99.5%）， 0.767 g；KCl （99.5%），1.916 g；ZnSO₄·7H₂O，80.230 mg；MgSO₄·7H₂O （99%），6.145 g；FeSO₄·7H₂O，198.610 mg；CoSO₄·7H₂O，1.667 mg；MnSO₄·H₂O，30.731 mg；Ca(IO₃)₂（0.99%），0.077 mg；Na₂SeSO₃，0.779 mg。

饲料原料经粉碎，80目过筛、混合均匀后，添加不同体积固定浓度的益生菌LB 26-6配制终浓度为1×10⁵ CFU/g，1×10⁷CFU/g，1×10⁹ CFU/g，1×10¹¹ CFU/g的实验饲料，对照组（C）为直接加等量体积生理盐水的基础饲料。原料全部混合均匀后，喷水制备面团，用饲料颗粒机挤压膨化成型，常温阴至半干，剪切成1.5 mm×3 mm的颗粒，随即阴干，于阴暗干燥处保存。

实施例4

饲料中添加菌剂对肝胰腺坏死病和荧光病的预防效果评估

（1）对虾的准备

取12个水箱（180 L），每个水箱中准备60只活力强，体格相近的南美白对虾（0.5±0.03 g）。所有实验水箱都装备有气石以维持溶解氧，并且在整个实验期间将水箱温度维持在26℃至28℃的范围内。

LB 26-6菌剂与对虾饲料按0%、1%、3%和5%的比例混合，每天分四次投喂，投饵量为对虾体重5%-10%，投喂时间分别为06：00、10：30、18：00、22：00，其投喂量占总投饵量的比值分别为30%、20%、30%、20%。

（2）副溶血弧菌侵染实验

以实验室保存的副溶血弧菌菌株测试对虾的抗病力。将副溶血弧菌用TSB+培养基、在30℃下、以150 rpm培养24 h，并且将其浓度调节为2×10⁹CFU/ml (OD：1.7)。用30 ml的副溶血弧菌菌悬液浸渍12个水箱(180 L，水体体积60L)中的对虾，每12小时确认虾的存活和游动状态，并在8小时后检测水体中弧菌数量，随后更换 95％的水。侵染实验持续7 d，每天制备菌悬液保证水体中的弧菌浓度。弧菌数量结果如表4所示，侵染存活曲线如图1（副溶血弧菌侵染下对虾的存活曲线图）所示。图1中，C组为对照组，LB26-6添加量为0；实验组中，添加不同体积固定浓度的益生菌LB 26-6，LB26-6添加量分别为1×10⁵ CFU/g，1×10⁷CFU/g，1×10⁹ CFU/g，1×10¹¹ CFU/g。

（3）哈维氏弧菌侵染实验

以实验室保存的哈维氏弧菌菌株测试对虾的抗病力。将哈维氏弧菌用TSB+培养基、在30℃下、以150 rpm培养24 h，并且将其浓度调节为2×109 CFU/ml (OD：1.7)。用30ml的哈维氏弧菌菌悬液浸渍12个水箱(180 L，水体体积60L)中的对虾，每12小时确认虾的存活和游动状态，并在8小时后检测水体中弧菌数量，随后更换 95％的水。侵染实验持续7d，每天制备菌悬液保证水体中的弧菌浓度。弧菌数量结果如表4所示，侵染存活曲线如图2（哈维氏弧菌侵染下对虾的存活曲线图）所示。图2中，C组为对照组，LB26-6添加量为0；实验组中，添加不同体积固定浓度的益生菌LB 26-6，LB26-6添加量分别为1×10⁵ CFU/g，1×10⁷CFU/g，1×10⁹ CFU/g，1×10¹¹ CFU/g。

表4

如表4所示，添加了侧孢短芽孢杆菌LB26-6的组别中的弧菌数量显著低于对照组，其中1×10⁷CFU/g，1×10⁹ CFU/g和1×10¹¹ CFU/g三个组差异不大。如图1和图2所示，在对虾的副溶血弧菌和哈维氏弧菌侵袭测试中，饲料中添加1×10⁷ CFU/g和1×10⁹CFU/g侧孢短芽孢杆菌的组别显示了更高的存活率，1×10¹¹ CFU/g组存活率有一定的下降，可能是由于侧孢短芽孢杆菌过量使用所致。

基于上述实施例，侧孢短芽孢杆菌LB26-6在1×10⁷ CFU/g至1×10⁹CFU/g可以提高南美白对虾的侵染存活率，并降低水体中弧菌数量。

实施例5

饲料中添加侧孢短芽孢杆菌的抗病机理初步研究

（1）对虾肝胰腺免疫相关酶活性测定

收集副溶血弧菌侵染后对虾的肝胰腺组织置于液氮速冻，分析免疫相关酶活性，每个处理4个平行。临近测定时，将适量对虾肝胰腺样品加入PBS 匀浆缓冲液中制成20%的组织匀浆样品，4℃下以2500 g离心10 min，收集上层澄清匀浆液分装备用。酶活力均采用南京建成试剂盒测定，蛋白含量采用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，测定结果如表5所示。

表5

（2）对虾肠道弧菌数测定

取侵染后的对虾，用无菌水冲洗并用70%乙醇擦拭体表，收集肠道样品置于匀浆管中，5000次/min匀浆后稀释涂布于LB和TSB＋培养基中，分析肠道内可培养好氧菌和弧菌数量，每个处理3个平行。结果如表6所示。

表6

饲料中补充侧孢短芽孢杆菌能够不同程度提高对虾肝胰腺中的免疫相关酶活性（见表5）。所有检测的免疫相关酶活力，在1×10⁷CFU/g组中均显著高于对照组和1×10¹¹CFU/g组（P < 0.05），对照组和1×10¹¹CFU/g组的差异不显著（P > 0.05）。CAT在1×10⁷CFU/g组的酶活力最高，除了SOD和CAT，其他酶活力在1×10⁵CFU/g、1×10⁷CFU/g和1×10⁹CFU/g组中均有较高活性，且组间差异不显著（P > 0.05）。

各组中的可培养好氧菌数目没有显著差异，各实验组的肠道弧菌数远低于对照组（P < 0.05）。1×10⁵CFU/g组的弧菌数略大于其他组，但各实验组之间的肠道弧菌数没有显著差异（P > 0.05）。

本发明所涉及的侧孢短芽孢杆菌LB 26-6在1×10⁵ CFU/g至1×10⁹CFU/g可以显著提高南美白对虾的非特异性免疫力，并显著降低肠道中弧菌数量。

结合侵染死亡率曲线图，本发明所涉及的侧孢短芽孢杆菌LB 26-6在实际应用中使用浓度在10⁷CFU/g左右即可。

基于上述实施例数据，1吨南美白对虾饲料中添加100g 侧孢短芽孢杆菌LB 26-6制剂，即可有效预防由副溶血弧菌和哈维氏弧菌引起的肝胰腺坏死病和发光病。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

Claims

1.一种用于预防细菌性疾病的菌株，其特征在于，该菌株的分类命名为侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus，该菌株已于2020年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：中国北京，保藏编号为CGMCC NO.20038。

2.一种如权利要求1所述的用于预防细菌性疾病的菌株，其特征在于，该菌株的工作浓度为1×10⁷ CFU/g -1×10⁹CFU/g。

3.一种如权利要求1所述的用于预防细菌性疾病的菌株的应用，其特征在于，所述菌株用于预防南美白对虾细菌性疾病。