CN112940300B - 交联透明质酸凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及交联透明质酸凝胶的制备方法，至少包括以下步骤：（1）使包含交联剂与透明质酸、其金属盐、其衍生物或其混合物的水溶液在非中性环境下混合均匀；（2）将上述混合溶液置于低于0℃、高于混合溶液共晶点的温度下以形成固液异相体系。本发明还涉及本发明方法制备得到的交联透明质酸凝胶及其用途。

Description

交联透明质酸凝胶的制备方法

技术领域

本发明涉及医用生物材料领域，特别涉及制备交联的透明质酸凝胶的方法。本发明还涉及本发明方法制备得到的交联透明质酸凝胶、包含本发明方法制备得到的交联透明质酸凝胶的组合物，及其用途。

背景技术

透明质酸是人体皮肤、软骨组织和关节润滑液的重要成分，它为一链状聚合物，由（1-β-4）D-葡萄糖醛酸和（1-β-3）N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位重复连接而成。得益于其无种属差异性、无免疫源性等优点，天然透明质酸被广泛应用于医学填充美容、骨关节炎的治疗以及眼部手术中。

天然透明质酸存在着在组织内半衰期短、易被降解和扩散的缺点，这大大限制了其在软组织填充等领域的应用。将天然透明质酸经化学交联剂交联修饰形成含有化学交联键的三维立体结构高分子凝胶是目前解决天然透明质酸上述缺点的常用方法。然而，将交联透明质酸凝胶施予生物体内时，其在生物体内分解后残留的交联剂成分对生物体来说存在着一定的安全性隐患。因此，在保证交联透明质酸的基本性能的前提下，以尽可能少的化学交联剂制备交联透明质酸凝胶是有着明显意义的。

目前，制备交联透明质酸的常规工艺方法是将透明质酸与交联剂在非中性的水溶液中搅拌混合均匀后，通过交联剂与透明质酸高分子链段上的基团间形成化学键合来制备的。如今市场上主流的交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE），其上市的产品包括Restylane®、Juvederm®、Esthelis®等。国内也有大量的相关发明专利陆续被申请，如CN106589424、CN104086788、CN102660040等。然而从工艺方法角度上看，这些专利总不能摆脱常规工艺方法的束缚，主要表现在其工艺流程大致相同，其中使用的一项或多项工艺参数较为苛刻等方面。究其原因则是由于这种常规化学交联工艺存在着根本上的缺陷：在反应过程中，非中性的环境会使透明质酸发生持续的降解。因此，为了得到交联透明质酸，必须使交联反应正向进行，即交联网络形成速度必须高于透明质酸降解速度，从而导致其反应条件限定较严，具体表现在反应所需的透明质酸浓度高、BDDE交联剂用量大、反应温度高等方面。然而，这些工艺参数数值的上升均会带来不利影响，如提高透明质酸的浓度在工艺上存在着难以均匀溶解的问题，延长溶解时间又会出现透明质酸过度降解的问题；提高交联剂用量存在着交联剂用量和残留量过高的安全性风险；提高反应温度一方面存在着交联剂如BDDE高温分解导致产品生物相容性下降和颜色变化的问题，另一方面存在着透明质酸分子降解速率随着反应温度提高而加快的问题。

由于常规工艺方法的根本性缺陷，现有的工艺方法往往顾此失彼。如美国发明第2006/0194758A1号公开了一种将高、低分子量的透明质酸混合反应制备交联透明质酸的方法，产品具有良好的粘弹性。但该方法反应温度较高（50℃），交联剂用量大（交联剂用量为透明质酸质量的10%）。又如CN104072814公开了一种用于制备交联透明质酸的组合物，产物具有较好的粘弹性，但却要求工艺参数中透明质酸在其碱性水溶液中的浓度达到15~25%w/v，这在生产上也是比较难实现的。

另一方面，在常规化学交联工艺条件下，随着反应过程中交联剂的不断消耗，交联反应速率减缓，在反应后期反应体系将会以透明质酸的水解反应为主，这必将导致凝胶性质的劣化。因此，在常规化学交联工艺中，交联反应在进行一段时间后就必须终止，这一定会带来相当量或大量交联剂的残留。目前最常用的去除或降低交联剂残留量的方法有透析法或清洗法，但此类纯化方法效果有限。同时，对于一端已是键结态而另一端仍为自由态官能团的交联剂而言，无法依靠上述方法去除，但此类自由态官能团仍然具有反应性，如美国发明专利第5808050号所示，含有这类官能团的材料在动物体内使用时存在着一定的风险。为了解决这一问题，如CN104761736公开了一种不对称结构的交联透明质酸凝胶的制备方法，通过在反应过程中对反应溶液进行梯度浓缩的方式来降低交联剂残留量；如CN103146003公开了一种低温二次交联透明质酸凝胶的制备方法，采用尽可能少的BDDE加入量，同时结合较低温（2-15℃）下反应和高温下短时间去除交联剂以及快速透析的方法制备出安全有效的交联透明质酸；如CN104231285公开了一种在低温下使用零段交联剂制备交联透明质酸凝胶的方法，采用通过阶段低温反应避免了零段交联剂与辅助交联剂在较高温度下发生副反应，提高了交联剂的利用率和交联程度。但纵观这些专利依然未摆脱常规工艺方法理念的束缚，未解决其根本性缺陷，因此或效果不佳、或工艺较为复杂实现难度高。

综上所述，常规化学交联工艺方法的根本性缺陷导致现有的工艺方法都存在着某项或某几项反应条件较为苛刻的缺点并与之带来的不利影响，且均无法有效降低交联剂的用量和残留，目前对常规工艺方法的优化也并不理想。业界迫切需要一种简单方便的能替代常规工艺方法的交联透明质酸凝胶的制备方法。

发明内容

为了解决制备交联透明质酸的常规工艺方法中的诸多缺陷，本发明提供了一种新型的交联透明质酸凝胶的制备方法。该方法不仅能够显著降低透明质酸分子链内化学键合被切断的可能性，同时在反应过程中能使透明质酸出现局部富集进而提高交联效率，因而能在较低的透明质酸浓度、交联剂含量和反应温度下获得具有较好粘弹性的交联透明质酸产品，并降低了交联剂残留的可能性。

本发明涉及交联透明质酸凝胶的制备方法，其包括以下步骤：

（1）将透明质酸、其金属盐、其衍生物或其混合物的水溶液与交联剂在非中性环境下混合均匀，形成混合溶液；

（2）将混合溶液置于低于0℃且高于混合溶液共晶点的温度下以形成固液异相体系；

（3）将固液异相体系置于低于0℃且高于混合溶液共晶点的温度下进行交联反应。

根据本发明一个实施方案，本发明方法还包括将交联反应后的固液异相体系中的固相融化的步骤，任选地随后还包括中和、纯化和匀化的步骤。

根据本发明另一实施方案，本发明方法包括以下步骤：

（1）使包含交联剂与透明质酸、其金属盐、其衍生物或其混合物的水溶液在非中性环境下混合均匀，形成混合溶液；

（2）将上述混合溶液置于低于0℃且高于混合溶液共晶点的温度下并保持足以形成固液异相体系的时间以形成固液异相体系；

（3）将该异相体系置于低于0℃且高于混合溶液共晶点的温度下进行交联反应。

本发明方法还包括将交联反应后的异相体系中的固相融化的步骤（4），任选地进一步包括中和、纯化和匀化。

根据本发明另一实施方案，固液异相体系由冰晶和透明质酸溶液组成。

根据本发明另一实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（1）中交联剂选自缩水甘油醚、双环氧化物、双碳二亚胺、二乙烯基砜、多功能聚乙二醇基交联剂及其混合物。所述交联剂例如但不限于1，4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、1,2-双（2，3-环氧丙氧基）-2,3-乙烯、1,2,7,8-二环氧辛烷、乙二酰肼、己二胺、二乙烯基砜，及其混合物。

根据本发明另一实施方案，所述的透明质酸金属盐，是指由透明质酸与金属离子所形成的的盐，例如但不限于透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐及其组合。

根据本发明另一实施方案，所述的透明质酸衍生物，是指含有羟基的多糖类，例如但不限于羧甲基纤维素、褐藻酸盐、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、黄原胶、壳聚糖、果胶、琼脂、鹿角菜胶或瓜尔胶，及其混合物。

根据本发明另一个实施方案，交联剂浓度为0.05~20% w/w，优选为0.5~10% w/w，更优选1~8% w/w，更优选2%~6% w/w。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（1）中透明质酸透明质酸、其金属盐、其衍生物或其混合物的浓度至少为0.05% w/v且不高于50% w/v，优选为0.1~30% w/v，甚至0.5~10% w/v，特别地2~8% w/v，尤其4%~6% w/v。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（1）中交联剂与透明质酸质量比为0.05~20% w/w，优选为0.5~10% w/w，更优选1~8% w/w，更优选2%~6% w/w。

根据本发明另一个实施方案，非中性环境可以是酸性环境，pH值为1~6，优选1~4，也可以是碱性条件，pH为9~14，优选11~14。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（2）中固液异相体系形成温度为混合溶液共晶点至0℃，优选为混合溶液共晶点至-5℃，更优选混合溶液共晶点至-10℃。共晶点是指物料（如混合溶液）中水分完全冻结成冰晶时的温度。混合溶液的共晶点由透明质酸、其金属盐、其衍生物或其混合物的物理特性和浓度共同决定，如当溶液中主要成分为透明质酸且其浓度为10%时，混合溶液的共晶点范围约为-30至-80℃之间。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（2）中保持时间为1~24h，更优选2~12h，更优选4~8h。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（3）中交联反应温度为混合溶液共晶点至0℃，优选为混合溶液共晶点至-5℃，更优选混合溶液共晶点至-10℃。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（3）中交联反应时间为100天以内，优选为1~28天，更优选3~21天，更优选5~14天。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（4）中的融化，是指将异相体系中的冰晶转化为液态水。如将异相体系放置于25℃环境下直至冰晶自然融化。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（4）中的中和是指将交联反应中的非中性环境中和为中性环境，例如pH大约为7，如pH为6.5至7.5， 尤其6.8至7.2，特别地6.9至7.1。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（4）中的纯化是指将凝胶内未反应的交联剂残留量降低至2 μg/g以内。例如但不限于，将凝胶在pH为中性的磷酸盐缓冲液中透析至交联剂残留量低于2 μg/g。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶，步骤（4）中的匀化是指将交联反应中所得的交联透明质酸通过例如但不限于碾碎、压碎、切割的方式均匀分散成颗粒或溶液。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶的浓度为10-30 mg/ml时，其储能模量G’值介于10Pa和2000Pa之间；G’值是使用TA的DHR旋转流变仪，在间隙高度为1mm时使用40mm的板直径，在25℃恒温下测定的。其中，每次测量在0.8%的应变和1Hz的频率下进行。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶的浓度为10-30 mg/ml时，其损耗模量G’’值介于5Pa和1000Pa之间；G’’值是使用TA的DHR旋转流变仪，在间隙高度为1mm时使用40mm的板直径，在25℃恒温下测定的。其中，每次测量在0.8%的应变和1Hz的频率下进行。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶的浓度为10-30 mg/ml时，将凝胶从27G针头挤出时，其挤压力在30mm/分钟的挤压速率下为5-50N。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶为无色、透明的凝胶。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶的粒径的中位数在100 μm-1 mm之间。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶的pH在6.5-8.0范围之间。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶的蛋白质含量不大于0.1质量%。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶的重金属含量不大于5 μg/g。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶的交联剂残留量不大于2μg/g。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶的细菌内毒素含量不大于0.5 EU/mL。

本发明还涉及交联透明质酸凝胶在医疗美容例如但不限于面部细纹的治疗、面部雕塑、面部特征的矫正中的应用。

根据本发明另一个实施方案，所述的交联透明质酸凝胶在外科手术、软组织填充、伤口止血、伤口愈合、抗瘢痕、瘢痕修复、关节润滑、关节保护中的应用。

本发明所述的交联透明质酸凝胶的制备方法，摈弃了常规的均相交联的工艺方法，而是采用了一种在冰晶和透明质酸溶液组成的固液异相体系中进行交联的工艺方法。在本发明方法降温过程中，透明质酸水溶液中出现冰晶并逐渐生长，使液相中的水逐渐减少，透明质酸浓度逐渐上升，最终组成了一个冰晶形成的固相与透明质酸和少部分水形成的液相的异相体系。该异相体系中一方面透明质酸出现了局部高浓度富集，透明质酸的浓度达到了均相环境下不可能实现的程度，大幅度提高了交联效率。此外，冰晶的形成使得液相中透明质酸的浓度大幅上升，透明质酸分子链内/间相互碰撞缠结和氢键作用产生的更为频繁，低温使透明质酸分子链在非中性条件下发生断裂的速率降低，足够的分子链长能够最大限度的保持分子链内/间的氢键作用，同时为透明质酸分子链内/间缠结的产生提供了充分条件因而显著增强。另一方面透明质酸的分子链间键合不再易被切断，大幅抑制了透明质酸的降解，所得凝胶的交联网络更为致密，粘弹性和抗酶解性大幅度提升；交联剂也可以反应的更为充分，交联剂的利用率高，残留量低，减少了交联剂和一端已是键结态而另一端仍为自由态官能团的交联剂残留的可能性，降低了使用风险，突破了常规工艺方法的根本性缺陷。

本发明的交联透明质酸制备方法，对反应条件要求低，可适用的工艺范围更为宽广，从产品性能的角度上所得到的交联透明质酸产品性能更为多样化。从工艺条件的角度上所需透明质酸浓度低，降低了透明质酸原料均匀混合的难度；所需交联剂用量低，降低了产品的安全性隐患；所需反应温度低，避免了交联剂如BDDE的热分解和透明质酸的降解。

由此可见，本发明的交联透明质酸制备方法，所需工艺条件简单，易于实现和大量生产，满足工业生产规模水平的需要。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。

本发明所述的透明质酸钠浓度是指透明质酸钠的质量与水的体积比（w/v%）。

本发明所述的氢氧化钠浓度是指氢氧化钠的质量与水的体积比（w/v%）。

本发明所述的BDDE浓度是指BDDE的质量与透明质酸钠的质量比（w/w%）。

实施例1：

本实施例考察在本发明所述的工艺方法下，不同交联剂用量是否能形成凝胶及其对发明凝胶粘弹性的影响。制备方法如下，其中透明质酸钠浓度5 w/v%，氢氧化钠浓度1 w/v%，异相体系形成温度-20℃，保持时间2h，交联反应反应温度-20℃，反应时间3天。

配置1 w/v%的氢氧化钠水溶液20 ml，按表1所示浓度添加交联剂BDDE，混合均匀后向其中加入1 g透明质酸钠。将溶液搅拌至均一后置于-20℃下保持2h，随后置于-20℃环境下反应3天。反应完成后将产物放置于室温环境待冰晶完全融化，用盐酸溶液调节pH至中性，放入PBS缓冲液中透析纯化溶胀并经机械匀化后，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20mg/ml。

对比例1.1：本对比例考察在与实施例1相同的透明质酸钠浓度、交联剂用量和碱性条件下，在交联反应温度40℃、交联反应时间4h的常规工艺条件下是否能形成凝胶及其对发明凝胶粘弹性的影响。制备方法如下，其中透明质酸钠浓度5 w/v%，交联反应温度40℃，交联反应时间4h。

配置1 w/v%的氢氧化钠水溶液20 ml，按表1所示浓度添加交联剂BDDE，混合均匀后向其中加入1 g透明质酸钠。将溶液搅拌至均一后将混合物置于40℃烘箱中反应4h。反应完成后将凝胶用盐酸溶液调节pH至中性，放入PBS缓冲液中透析纯化并经机械匀化后，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20 mg/ml。

必须指出的是，在这样的常规反应条件下，只有当交联剂浓度为10 w/w%时才形成了凝胶，在其他较低的交联剂浓度下透明质酸钠的降解速度均超过了其交联网络形成速度，因此在反应4h后未形成凝胶，继续延长反应时间亦不会改变这一结果。

不受任何理论束缚，对比例的反应时间为4h，这是因为反应时间为4h最接近在此反应条件下最高的交联程度，如继续延长反应时间，由于交联反应速率的降低，反应将以水解为主要进程，产物的性能会降低，如延长到72h（如本发明所述方法所使用的时间），产物则可能无法形成凝胶。相反地，本发明所述方法可以延长反应时间（如上所述至72小时），是因为本发明所述方法中水解反应的速率被大幅度抑制了，产物可形成凝胶。

对比例1.2：本对比例考察在比实施例1更高的透明质酸钠浓度和交联剂用量下，在交联反应温度40℃、交联反应时间4h的常规工艺条件下是否能形成凝胶及其对发明凝胶粘弹性的影响。制备方法如下，其中透明质酸钠浓度10 w/v%，交联反应温度40℃，交联反应时间4h。

配置1 w/v%的氢氧化钠水溶液20 ml，按表1所示浓度添加交联剂BDDE，混合均匀后向其中加入2 g透明质酸钠。将溶液搅拌至均一后将混合物置于40℃烘箱中反应4h。反应完成后将凝胶用盐酸溶液调节pH至中性，放入PBS缓冲液中透析纯化并经机械匀化后，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20 mg/ml。

对比例1.3：配置透明质酸钠水溶液，其中透明质酸钠浓度为20 mg/ml。

将实施例1、对比例1.1和对比例1.2所制备的交联透明质酸钠凝胶通过27规格针头推出至旋转流变仪的载物台上，通过使用平板系统的应变为0.8%、频率为1Hz的振荡流变学对凝胶的粘弹性进行表征，测试结果列于表1中。结果显示，在本发明的工艺方法下（实施例1），相对于未经化学交联的透明质酸钠（对比例1.3），凝胶的粘弹性出现了明显上升，随着交联剂浓度的提高其上升幅度也增大，这说明在这些工艺条件下都形成了具有相对于未进行化学交联的凝胶更为致密的交联网络。在本发明的工艺方法下，交联剂浓度的可选范围宽广，在极低的交联剂浓度下亦能形成具有良好粘弹性的交联透明质酸钠凝胶。

而在常规工艺方法下（对比例1.1和对比例1.2），只有当交联剂浓度达到10%时方能形成凝胶，且所得凝胶的交联网络的致密程度远低于本发明的工艺方法和未交联的样品，这正是由于常规工艺方法的根本性缺陷所导致的。

表1 实施例1、对比例1到3制备工艺条件及所得凝胶粘弹性

* 未形成凝胶，无粘弹性特征及数值。

实施例2：本实施例考察在本发明所述的工艺方法下，不同透明质酸钠浓度是否能形成凝胶及其对发明凝胶粘弹性的影响。制备方法如下，其中交联剂浓度 1.5 w/w%，氢氧化钠浓度2 w/v%，异相体系形成温度-25℃，保持时间1h，交联反应温度-20℃，交联反应时间3天。

配置2 w/v%的氢氧化钠水溶液5ml，按表2所示浓度添加交联剂BDDE，混合均匀后添加透明质酸钠粉末至表2中所示的浓度。将溶液搅拌至均一后置于-25℃下保持1h，随后置于-20℃环境下3天。反应完成后将产物放置于室温环境待冰晶完全融化后，用盐酸溶液调节pH至中性，放入PBS缓冲液中透析纯化并经机械匀化后，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20 mg/ml。对于透明质酸钠浓度为0.5 w/v%的情况，待纯化完成后将凝胶醇沉后干燥，然后复溶于适量的PBS中，得到最终浓度为20 mg/ml的凝胶。

对比例2：本对比例考察在与实施例2相同的透明质酸钠浓度、交联剂用量和碱性条件下，在交联反应温度40℃、交联反应时间4h的常规工艺条件下是否能形成凝胶及其对发明凝胶粘弹性的影响。制备方法如下，其中交联剂浓度1 w/w%，反应温度40℃，反应时间4h。

配置2 w/v%的氢氧化钠水溶液5ml，按表2所示浓度添加交联剂BDDE，混合均匀后按表2所示浓度添加透明质酸钠。将溶液搅拌至均一后将混合物置于40℃烘箱中反应4h。反应完成后将凝胶用盐酸溶液调节pH至中性，放入PBS缓冲液中透析纯化并经机械匀化。在这样的常规反应条件下，透明质酸钠的降解速度均超过了其交联网络形成速度，因此在反应4h后未形成交联透明质酸钠凝胶，继续延长反应时间亦不会改变这一结果。

将实施例2所制备的交联透明质酸钠凝胶通过27规格针头推出至旋转流变仪的载物台上，通过使用平板系统的应变为0.8%、频率为1Hz的振荡流变学对凝胶的粘弹性进行表征，测试结果列于表2中。结果显示，在本发明的工艺方法下（实施例2），透明质酸浓度的可选范围宽广，在极低的透明质酸浓度下亦能发生交联反应形成交联透明质酸钠凝胶，所得凝胶的粘弹性优异。

而在常规工艺方法下（对比例2），在所有的反应条件下均不能形成交联透明质酸钠凝胶，这也是由于常规工艺方法的根本性缺陷所导致的。

表2 实施例2、对比例2制备工艺条件及所得凝胶粘弹性

* 未形成凝胶，无粘弹性特征及数值。

实施例3：本实施例考察在本发明所述的工艺方法下，不同交联反应温度对发明凝胶粘弹性的影响。制备方法如下，其中透明质酸钠浓度10 w/v%，氢氧化钠浓度1 w/v%，交联剂BDDE浓度1 w/w%，异相体系形成温度-30℃，保持时间2h，交联反应时间3天。

配置1 w/v%的氢氧化钠水溶液10 ml，加入0.01 g交联剂BDDE，混合均匀后添加1g透明质酸钠。将溶液搅拌至均一后置于-30℃下保持2h，随后置于表3中温度下反应3天。反应完成后将产物放置于室温环境待冰晶完全融化，用盐酸溶液调节pH至中性，放入PBS缓冲液中透析纯化并经机械匀化后，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20 mg/ml。

将实施例3所制备的交联透明质酸钠凝胶通过27规格针头推出至旋转流变仪的载物台上，通过使用平板系统的应变为0.8%、频率为1Hz的振荡流变学对凝胶的粘弹性进行表征，测试结果列于表3中。结果显示，在这些条件下均能形成交联透明质酸钠凝胶，所得凝胶粘弹性良好。

表3 实施例3制备工艺条件及所得凝胶粘弹性

实施例4：本实施例考察在本发明所述的工艺方法下，不同时间对发明凝胶粘弹性的影响。制备方法如下，其中透明质酸钠浓度3 w/v%，氢氧化钠浓度1 w/v%，交联剂BDDE浓度2 w/w%，异相体系形成温度-10℃，保持时间4h，交联反应温度-20℃。

配置1 w/v %的氢氧化钠水溶液40 ml，加入0.024 g交联剂BDDE，混合均匀后添加1.2 g透明质酸钠。将溶液搅拌至均一后置于-10℃下保持4h，随后按表4中所列时间置于-20℃环境下。反应完成后将产物放置于室温环境待冰晶完全融化，用盐酸溶液调节pH至中性，放入PBS缓冲液中透析纯化并经机械匀化后，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20 mg/ml。

将实施例4所制备的交联透明质酸钠凝胶通过27规格针头推出至旋转流变仪的载物台上，通过使用平板系统的应变为0.8%、频率为1Hz的振荡流变学对凝胶的粘弹性进行表征，测试结果列于表4中。结果显示，在本发明所述的工艺方法下，所得凝胶的粘弹性能够随交联时间延长而逐步上升并在14天交联剂基本消耗完毕后保持稳定。这说明在本发明所述的工艺方法下，透明质酸钠分子链内键合基本不会被切断，化学交联反应也能够顺利进行，所得凝胶粘弹性较好。

表4 实施例4制备工艺条件及其所得凝胶粘弹性

实施例5：本实施例考察在本发明所述的工艺方法下，不同时间对发明凝胶交联剂残留量的影响。制备方法如下，其中透明质酸钠浓度4 w/v%，交联剂BDDE浓度1 w/w%，异相体系形成温度-15℃，保持时间3h，交联反应温度-20℃。

配置1%的氢氧化钠水溶液20 ml，加入0.008 g交联剂BDDE，混合均匀后添加0.8 g透明质酸钠。将溶液搅拌至均一后置于-15℃下保持3h，随后按表3中所列时间置于-20℃环境下。反应完成后将产物放置于室温环境待冰晶完全融化，用盐酸溶液调节pH至中性并经机械匀化后，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20 mg/ml。为了研究不同反应时间对发明凝胶交联剂残留量的影响，因此不对本实施例所得凝胶进行透析纯化。

将实施例5所制备的交联透明质酸钠凝胶参考行业标准YY/T 0962-2014《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中附录F.2 气相色谱法测定实施例5所制备的交联透明质酸钠凝胶中BDDE残留量，测试结果列于表5中。结果显示，随着反应时间的延长，凝胶中交联剂的残留量逐步降低，在反应时间14天后即可降低至行业标准YY/T 0962-2014《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》所规定的残留量和方法定量限（2μg/g）以下。这说明在本发明所述的工艺方法下，化学交联反应可以进行的更为充分，交联剂利用效率高，在反应14天后交联剂已基本反应完全，与实施例4的数据相符。

表5 实施例5制备工艺条件及其所得凝胶交联剂残留量

* 残留量低于YY/T 0962-2014所规定的残留量和方法定量限。

实施例6：本实施例考察在本发明所述的工艺方法下制备的交联凝胶的抗酶解性，其中交联剂BDDE浓度1.5 w/w%，异相体系形成温度-20℃，保持时间2h，交联反应温度-20℃，交联反应时间5天。制备方法如下：

配置1%的氢氧化钠水溶液10 ml，按表6所示浓度添加交联剂BDDE，混合均匀后按表6所示浓度添加透明质酸钠。将溶液搅拌至均一后将混合物置于-20℃下保持2h，随后转移至-20℃环境下保持5天。反应完成后将产物放置于室温环境待冰晶完全融化，用盐酸溶液调节pH至中性，放入PBS缓冲液中透析纯化并经机械匀化后，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20 mg/ml。

对比例6：本对比例考察在透明质酸钠浓度10 w/v%、交联剂浓度10 w/w%时，在交联反应温度40℃、交联反应时间4h的常规工艺条件下形成的交联凝胶的抗酶解性。制备方法如下：

配置1 w/v%的氢氧化钠水溶液10ml，加入0.0125g交联剂BDDE，混合均匀后添加1g透明质酸钠。将溶液搅拌至均一后将混合物置于40℃烘箱中反应4h。反应完成后将凝胶用盐酸溶液调节pH至中性，放入PBS缓冲液中透析纯化并经机械匀化后，得到交联透明质酸钠凝胶，浓度为20 mg/ml。

酶解过程是通过一种来源于芽孢杆菌的透明质酸酶HAase-B实现的。在适宜条件下，该酶可将HA完全降解为单一的不饱和双糖，该降解产物在波长232nm处有较强的紫外吸收，因此可通过测定不同酶解时间后溶液的吸光度与降解终点时溶液的吸光度来反映凝胶的降解程度。

将实施例6及对比例6所制备的交联透明质酸钠凝胶分别取0.5g凝胶置于无菌24孔板中，向其中加入3ml透明质酸酶溶液（HAase-B，200IU/ml）。将24孔板置于42℃恒温槽中孵育4.5h后取上清液50 μl稀释至3 ml，在紫外232 nm波长测定波长吸收。继续孵育至24h后吸光度不再发生变化，因此以孵育24h时的吸光度为降解终点，以降解4.5h时吸光度占降解终点时吸光度的百分比为酶降解率。酶降解率越低，表明凝胶的抗酶解性越好，凝胶在体内填充的效果持续时间越长。测试结果列于表6中。结果显示，在本发明所述的工艺方法下，即使所用交联剂浓度远低于常规工艺方法，在充分反应后所得凝胶的抗酶解性仍表现出相对于常规工艺方法极大的优越性。

表6 实施例6、对比例6制备工艺条件及其所得凝胶抗酶解性

实施例7：为说明固液异相体系对非中性环境下透明质酸钠分子量的影响，本实施例考察固液异相体系在碱性环境保持一段时间所得透明质酸钠的分子量分布。制备方法如下：

配置1%的氢氧化钠水溶液20 ml，添加1 g透明质酸钠。将溶液搅拌至均一后置于-25℃下保持时间2h以形成固液异相体系。随后将固液异相体系置于-20℃环境下一段时间，具体时间如表7所示，而后将凝胶用盐酸溶液调节pH至中性，得到透明质酸钠凝胶，浓度为20 mg/ml。

对比例7：本对比例考察常规工艺方法对透明质酸钠分子量的影响。制备方法如下：

配置1%的氢氧化钠水溶液20 ml，添加1 g透明质酸钠。将溶液搅拌至均一后将混合物置于40℃环境下，具体时间如表8所示，而后将凝胶用盐酸溶液调节pH至中性，得到透明质酸钠凝胶，浓度为20 mg/ml。

将实施例7和对比例7所制备的透明质酸钠采用凝胶渗透色谱法测定其重均分子量。结果显示，在本发明所述的工艺方法下，即使是在保持3天后，透明质酸分子量仍然远大于常规工艺条件1天内透明质酸的分子透明质酸分子量，同时在常规工艺条件下保持2天、3天后透明质酸钠分子已经完全被剪切成为小分子，已低于检测下限，说明在固液异相体系下，透明质酸分子链内键合不易被切断，透明质酸的碱降解被显著抑制。

表7 实施例7及对比例7经不同温度和时间处理后透明质酸钠分子量分布

综上所述，本发明的交联透明质酸制备方法，所得凝胶产品交联网络更为致密，粘弹性优异，性能更为多样化，抗酶解性好。交联剂反应更为充分，可以减少交联剂的用量，降低交联剂的残留。所需工艺条件简单易实现，易于实现和大量生产。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (38)

1.交联的透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，其至少包括以下步骤：

(1)将透明质酸的水溶液与交联剂在非中性环境下混合均匀，形成混合溶液；

(2)将混合溶液置于低于0℃且高于混合溶液共晶点的温度下以形成固液异相体系；

(3)将固液异相体系置于低于0℃且高于混合溶液共晶点的温度下进行交联反应。

2.根据权利要求1所述方法，其还包括将交联反应后的固液异相体系中的固相融化的步骤，任选地随后还包括中和、纯化和匀化的步骤。

3.根据前述权利要求1或2所述方法，其具体包括以下步骤：

(1)使包含交联剂与透明质酸、其金属盐、或其混合物的水溶液在非中性环境下混合均匀，形成混合溶液；

(2)将上述混合溶液置于低于0℃且高于混合溶液共晶点的温度下并保持足以形成固液异相体系的时间以形成固液异相体系；

(3)将该异相体系置于低于0℃且高于混合溶液共晶点的温度下进行交联反应；

(4)将交联反应后的异相体系中的固相融化，任选地中和、纯化和匀化。

4.根据前述权利要求1或2所述方法，其中固液异相体系由冰晶和透明质酸溶液组成。

5.根据前述权利要求1或2所述方法，其中所述交联剂选自缩水甘油醚、双环氧化物、双碳二亚胺、二乙烯基砜、多功能聚乙二醇基交联剂及其混合物。

6.根据前述权利要求1或2所述方法，其中步骤(1)中所述透明质酸的水溶液包括透明质酸的水溶液、透明质酸金属盐的水溶液或其混合物的水溶液。

7.根据权利要求6所述方法，其中所述透明质酸金属盐选自透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐及其组合。

8.根据前述权利要求1或2所述方法，其中步骤(1)中所述透明质酸的水溶液的浓度至少为0.05％w/v且不高于50％w/v。

9.根据前述权利要求1或2所述方法，其中步骤(1)中交联剂与透明质酸、或透明质酸金属盐、或其混合物的质量比为0.05～20％w/w。

10.根据前述权利要求1或2所述方法，其中所述非中性环境是酸性环境，该酸性环境的pH值为1～6；或，所述非中性环境是碱性环境，该碱性环境的pH为9～14。

11.根据前述权利要求1或2所述方法，其中步骤(2)保持时间为1～24h。

12.根据前述权利要求1或2所述方法，其中步骤(3)中交联反应时间为100天以内。

13.根据前述权利要求2所述方法，其中所述中和是指将交联反应中的非中性环境中和为中性环境，即，调整pH值为6.5至7.5。

14.根据前述权利要求2所述方法，其中所述纯化是指将凝胶内未反应的交联剂残留量降低至2μg/g以内。

15.根据前述权利要求2所述方法，其中所述匀化是指将交联反应中所得的交联透明质酸通过均匀分散成颗粒或溶液。

16.根据权利要求1或2所述方法，其中所述交联剂选自1，4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、1,2-双(2，3-环氧丙氧基)-2,3-乙烯、1,2,7,8-二环氧辛烷、乙二酰肼、己二胺、二乙烯基砜，及其混合物。

17.根据权利要求8所述方法，其中步骤(1)中所述透明质酸的水溶液的浓度为0.1～30％w/v。

18.根据权利要求8所述方法，其中步骤(1)中所述透明质酸的水溶液的浓度为0.5～10％w/v。

19.根据权利要求8所述方法，其中步骤(1)中所述透明质酸的水溶液的浓度为2～8％w/v。

20.根据权利要求8所述方法，其中步骤(1)中所述透明质酸的水溶液的浓度为4％～6％w/v。

21.根据权利要求9所述方法，其中步骤(1)中交联剂与透明质酸、或透明质酸金属盐、或其混合物的质量比为0.1～15％w/w。

22.根据权利要求9所述方法，其中步骤(1)中交联剂与透明质酸、或透明质酸金属盐、或其混合物的质量比为0.5～10％w/w。

23.根据权利要求9所述方法，其中步骤(1)中交联剂与透明质酸、或透明质酸金属盐、或其混合物的质量比为1～8％w/w。

24.根据权利要求9所述方法，其中步骤(1)中交联剂与透明质酸、或透明质酸金属盐、或其混合物的质量比为2％～6％w/w。

25.根据权利要求10所述方法，其中所述非中性环境是酸性环境，该酸性环境的pH值为1～4。

26.根据权利要求10所述方法，其中所述非中性环境是碱性环境，该碱性环境的pH为11～14。

27.根据权利要求1所述方法，其中步骤(2)中所述固液异相体系的形成温度为混合溶液共晶点至-5℃。

28.根据权利要求1所述方法，其中步骤(2)中所述固液异相体系的形成温度为混合溶液共晶点至-10℃。

29.根据权利要求11所述方法，其中步骤(2)保持时间为2～12h。

30.根据权利要求11所述方法，其中步骤(2)保持时间为4～8h。

31.根据权利要求1所述方法，其中步骤(3)中交联反应温度为混合溶液共晶点至-5℃。

32.根据权利要求1所述方法，其中步骤(3)中交联反应温度为混合溶液共晶点至-10℃。

33.根据权利要求12所述方法，其中步骤(3)中交联反应时间为1～28天。

34.根据权利要求12所述方法，其中步骤(3)中交联反应时间为3～21天。

35.根据权利要求12所述方法，其中步骤(3)中交联反应时间为5～14天。

36.根据权利要求13所述方法，其中所述中和是指将交联反应中的非中性环境中和为中性环境，即，调整pH值为6.8至7.2。

37.根据权利要求13所述方法，其中所述中和是指将交联反应中的非中性环境中和为中性环境，即，调整pH值为6.9至7.1。

38.根据权利要求15所述方法，其中所述匀化是指将交联反应中所得的交联透明质酸通过选自碾碎、压碎、切割的方式均匀分散成颗粒或溶液。