CN112940080A - 一种多肽p10581及其在制备缓解骨癌痛药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了一种多肽P10581及其在制备缓解骨癌痛药物中的用途，所述多肽P10581的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。本发明合成的多肽P10581能够有效、稳定的缓解骨癌痛。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种多肽P10581及其在制备缓解骨癌痛药物中的用途。
背景技术
骨癌早期疼痛特点为局部疼痛，多为持续性，逐渐加重，夜间尤重，影响睡眠，服用一般止痛药无法止痛，还可在肿瘤发生部位及周周牵涉痛。乳腺癌骨转移指乳腺癌细胞经血行转移至骨组织引起的以骨损害、疼痛为主要表现的疾病，乳腺癌骨转移常见部位有脊柱、骨盆、髋关节周围、长骨的骨干等，常见表现有背部持续性疼痛、肢体麻木、肌无力、肋骨疼痛、咳嗽、胸腔积液等，病情严重者甚至出现骨痛加剧、病理性骨折、椎体变形，脊髓压迫、骨转移病灶进展及高钙血症等严重症状。
目前临床上对癌症病人疼痛的镇痛药物已有多种，其中最常用且镇痛效果最好的是吗啡，但吗啡也有其明显的副作用及缺点，比如长期应用的成瘾性、后期的耐药性，以及对部分顽固性癌性疼痛镇痛效果不佳等。因此临床上急需要寻找一种镇痛效果能堪比吗啡但无吗啡副作用的药物。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种多肽P10581及其在制备缓解骨癌痛药物中的用途，所述的多肽P10581能够有效、稳定的缓解骨癌痛，且其镇痛耐受性低于吗啡。
本发明的第一个目的提供一种多肽P10581，所述多肽P10581的氨基酸序列如SEQID N0.1所示。
本发明的第二个目的提供一种包含权利要求1所述的多肽P10581的镇痛药物。
进一步地，所述缓解骨癌痛药物包括但不限于药剂学上允许的粉剂、片剂、丸剂、颗粒、口服液或者注射液。
进一步地，所述注射液包括但不限于皮下注射液和腹腔注射液。
本发明的第三个目的提供上述多肽P10581在制备缓解骨癌痛药物中的用途。
进一步地，所述多肽P10581皮下注射(S.C.)给药剂量为7.2-14.4μg/kg。
进一步地，所述多肽P10581腹腔注射(i.p.)方式给药剂量为270-540μg/kg。
进一步地，所述多肽P10581用于制备骨癌痛稳定镇痛的药物。
进一步地，所述多肽P10581用于制备低药物耐受性的骨癌痛镇痛药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明中多肽P10581能够高效且稳定的缓解乳腺癌骨转移大鼠的骨癌痛，其镇痛效果具有剂量依赖性。
2、本发明中P10581对大鼠骨癌痛的急性镇痛效果，在作用5小时后，其镇痛效果明显强于吗啡。
3、本发明中，吗啡连续给药5天(每天给药2次)对骨癌痛的镇痛效果完全消失，说明吗啡对骨癌痛的镇痛作用产生耐受性；但合成肽P10581对骨癌痛仍然具有镇痛效果，因此合成肽P10581的镇痛耐受性低于吗啡。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1表示本发明中大鼠骨癌痛造模后的痛阈值变化；
图2表示本发明中腹腔注射多肽P10581对大鼠骨癌疼痛的镇痛效果；
其中，图2A表示protocol显示大鼠骨癌痛造模第19天，药物对大鼠骨癌疼痛作用测试时间点；
图2B表示不同剂量的合成多肽P10581对大鼠骨癌痛的抑制作用；
其中，B、C表示大鼠机械伸缩阈值，BL表示基础阈值，BC明显低于BL，说明大鼠骨癌痛模型造模成功；
图3表示本发明合成多肽P10581对大鼠骨癌痛的抑制作用的剂量依赖性；
图4表示本发明中皮下注射多肽P10581与吗啡对大鼠骨癌疼痛的影响比较；
其中，图4A表示大鼠骨癌痛造模第20天，药物对大鼠骨癌疼痛作用测试时间点；
图4B表示皮下注射方式多肽P10581与吗啡在不同时间对大鼠骨癌痛的镇痛效果比较；
图5表示皮下注射方式药物注射不同时间后多肽P10581与吗啡对大鼠骨癌疼痛的影响比较；
图5A表示大鼠骨癌痛造模第20天药物作用测试时间点；
图5B表示药物注射4小时后，多肽P10581的镇痛效果与吗啡镇痛效果比较；
图5C表示药物注射5小时后，多肽P10581的镇痛效果与吗啡镇痛效果比较。
图6表示吗啡镇痛耐受性对本发明合成肽P10581对大鼠骨癌痛镇痛效果的影响；
其中，图6A表示protocol显示大鼠骨癌痛造模后第31-35天，药物对大鼠骨癌疼痛作用测试时间点；图6B表示吗啡与合成肽P10581连续皮下注射5天后的镇痛效果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
多肽P10581的合成
利用常规方法人工合成多肽P10581，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示；
SEQIDN0.1：
Trp-Lys-Cys-Asn-Pro-Asn-Asp-Asp-Lys-Cys-Cys-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Cys。
根据所示的氨基酸序列，交由上海生工生物工程股份有限公司合成，获得纯度为98％的多肽P10581纯品。
实施例2
多肽P10581对骨癌痛的影响
一、实验动物、仪器和材料
选择健康幼年和成年雌性SD大鼠体重分别为90-100g和180g-220g，购于徐州医科大学实验动物中心；在测量房间适应2h后，用38500-PAM压力测量大鼠机械缩足阈值系统(Ugo Basile Biological Research Apparatus,Comerio–Varese,Italy)的锥形尖端对准大鼠左后足足底中心部位，以恒定的力率测量大鼠的机械性缩足阈值。为了避免对大鼠造成损伤，最大测量时间设定为15s。若受试大鼠15s后仍未出现缩足反射，则停止测量。每只大鼠重复测量3-5次(间隔5min)，取平均值即为大鼠造模前基础痛阈值(Baseline,BL)(单位为：g)。所有实验设计均遵循随机、双盲的实验设计原则。
Walker 256乳腺癌细胞购自上海生物医学工程研究所。
38500-PAM压力应用测量系统(Μgo Basile Biological Research Apparatμs,Comerio–Varese,Italy)由两部分组成，一部分为手持单元，另一部分为综合电子单元。手持单元为力传感器，该力传感器是根据Randall-Selitto测痛仪而设计，综合电子单元可自动记录施加在大鼠右侧后足足底最大的机械缩足反射阈值。
二、大鼠骨癌痛模型的制备
骨癌痛模型：按照文献(Medhurst SJ,et al.Pain,2002)描述的方法实施TCI(肿瘤细胞植入)手术。从液氮罐中取出Walker 256乳腺癌细胞冻存管，置于37℃水浴快速解冻，移至离心管中。加适量生理盐水，以1200r·min-1离心6min，弃上清。重复漂洗1次，再加入适量PBS，使细胞悬液稀释至1x107个/ml。选取90-100g的幼年雌性SD大鼠，抽0.5ml肿瘤细胞接种至幼鼠腹腔中，6-7d可出现大量腹水。从腹腔抽取10ml腹水，离心5min，沉淀经生理盐水洗涤后用PBS稀释至1×105个/ml。大鼠用10％水合氯醛麻醉后备皮，在右胫骨上半部的皮肤上形成1cm的切口并仔细暴露胫骨骨面，对肌肉或血管造成最小的损伤。使用4#针头，刺入骨骼距离骺生长板远端的膝关节5mm以下。针插入一定深度，以使其能够被推入骨髓腔。然后取出针头，并将连接到含有要注射的细胞的10ml微量注射器针头插入骨髓腔，回抽有血确定针尖位于骨髓腔内，将5ml(1×105个/ml)癌细胞注入骨髓腔中，注意观察有无细胞或血液从针口漏出。为使细胞充分扩散，针头停留1min后退出骨髓腔，棉签压迫针眼1min，使用骨水泥封闭该部位。然后用针线缝合伤口，并用青霉素粉末处理创口。造模后3d测大鼠机械缩足阈值，明显降低者视为骨癌痛模型建模成功，造模不成功的大鼠予以剔除。
三、机械性痛觉过敏检测
实验一：测定腹腔注射合成肽P10581对大鼠骨癌痛的镇痛效果。
选取180g-220g健康成年雌性SD大鼠，在其尾巴编号后放入同一鼠笼中(共20只)。在测量房间适应2h，待大鼠安静后用38500-PAM压力应用测量系统(Ugo BasileBiological Research Apparatus,Comerio–Varese,Italy)的锥形尖端对准大鼠右后足足底中心部位，以恒定的力率(30gf/s)测量大鼠的机械性缩足阈值，最大测量时间设定为15s(当测量值大于450gf时，会对大鼠造成损伤)。记录大鼠右后足缩时的机械性缩足阈值，若受试大鼠15s后仍未出现缩足反射，停止测量。每只大鼠重复测量3-5次，每次间隔5-10min，取平均值。测量完毕后让大鼠休息数小时，随后开始制备骨癌痛模型。造模后第3天及第5天上午测大鼠机械缩足阈值，剔除造模失败大鼠。并且在造模后每天测定疼痛阈值，直至疼痛阈值降到稳定的最低水平，达到骨癌痛所导致的最痛状态，说明造模成功，可用于下一步实验。第19天将造模成功大鼠随机分为3组，A组腹腔注射生理盐水，B组注射270μg/kgP10581，C组注射540μg/kg P10581,注射药物后1.5h记录各组大鼠右后足的机械性缩足阈值，每只大鼠均重复测试3-5次(每次测试时间间隔为5-10min)，取缩足反射阈值的平均值为该大鼠实际缩足反射阈值(单位：g)。
实验二：测定皮下注射合成肽P10581及吗啡对大鼠骨癌痛的镇痛效果。
实验二的实验步骤与实验一类似，不同的是：实验二于骨癌痛造模后第20天将造模成功大鼠随机分为4组，均采取皮下注射给药的方式，A组注射生理盐水，B组注射5mg/Kg吗啡，C组注射7.2μg/kg P10581，D组注射14.4μg/kg P10581，随后分别于给药后的1h、2h、3h、4h、5h记录各组大鼠机械性缩足阈值；
吗啡给药时间为每天上午9：30和下午4：30，PWT值于每天上午给药1h后检测；
实验检测时间：骨癌痛大鼠造模成功22天后开始注射吗啡；
ΔPWT＝PWT(pre-drug)-PWT(post-drug)。
四、实验结果
如图1所示，骨癌模型造模成功，从第18天开始，大鼠痛阈值达到最低值(80g)，疼痛最显著；
如图2所示，腹腔注射方式给药的合成肽P10581，能够明显减轻大鼠骨癌疼痛，270μg/kg和540μg/kg的注射剂量对大鼠骨癌痛均有明显的抑制作用，270μg/kg时，镇痛效果即疼痛阈值升高17.94±2.42g；540μg/kg时，疼痛阈值升高27.62±2.34g。
镇痛效果计算方式：PWT(给药后)-PWT(给药前)；PWT为大鼠机械性缩足阈值，是评判疼痛程度的指标。
如图3所示，半剂量IC50＝1.53±0.18，Hill cofactor为：2.8±0.76；各剂量均为皮下注射给药1.5h后数值，说明本发明合成多肽P10581用量从1ug/kg到10ug/kg时其疼痛阈值升高最为明显，且呈剂量依赖性分布。大于10ug/kg后，其疼痛阈值进入一个相对平台区。
如图4所示，吗啡5mg/Kg，5小时后疼痛阈值103.2±1.9g，同时，P105817.2μg/kg，112.6±1.5g,14.4μg/kg,121.0±1.1g；给药5小时后吗啡的镇痛效果：24.39±3.94g，7.2g/kg P10581镇痛效果32.07±2.64g，14.4 g/kg P10581镇痛效果:37.05±4.34g；说明皮下注射方式给药的合成肽P10581，能够明显减轻大鼠骨癌疼痛，且这种抑制作用可持续5小时，而吗啡的镇痛作用，随着时间而下降，5小时后，多肽P10581的镇痛效果甚至明显强于吗啡，本发明获得的合成肽P10581的镇痛作用更加稳定。
如图5所示，B:药物注射4小时后，多肽的镇痛效果与吗啡镇痛效果没有显著性差别。吗啡5mg/Kg，4小时后疼痛阈值121.3±2.4g，同时，P105817.2μg/kg，116.5±2.8g,14.4μg/kg,121.1±1.0g，给药4小时后吗啡的镇痛效果：42.5±2.34g，7.2 g/kg P10581镇痛效果:35.48±2.52g，14.4g/kgP10581镇痛效果:39.81±3.20g；P>0.05。C:药物注射5小时后，多肽的镇痛效果明显强于吗啡。
如图6所示，吗啡连续用药5天(给药剂量为5mg/kg，每天给药2次)后对大鼠骨癌痛的镇痛作用完全消失，说明吗啡对骨癌痛镇痛效果产生耐受性；但本发明合成肽P10581(14.4ug/kg)仍然可以对大鼠骨癌痛产生强烈镇痛作用，说明本发明合成肽对骨癌痛的镇痛效果的耐受性低于吗啡。
综上所述，本发明的合成肽P10581能够对骨癌痛产生明显的镇痛效果，且镇痛效果稳定，其耐受性低于吗啡，有望用做制备用于骨癌痛的稳定镇痛药物。
本发明中腹腔给药药效低于皮下注射，可能是由于在腹腔给药时，有一部分药物在吸收过程中损失造成，因此，优选皮下注射给药方式。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 西南医科大学附属医院
<>
<120> 一种多肽P10581及其在制备缓解骨癌痛药物中的用途
<>
<160> 1
<>
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<>
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<>
<400> 1
Trp Lys Cys Asn Pro Asn Asp Asp Lys Cys Cys Arg Pro Lys Leu Lys
1 5 10 15
Cys
Claims (9)
1.一种多肽P10581，其特征在于，所述多肽P10581的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种包含权利要求1所述的多肽P10581的镇痛药物。
3.如权利要求2所述的镇痛药物，其特征在于，所述缓解骨癌痛药物包括但不限于药剂学上允许的粉剂、片剂、丸剂、颗粒、口服液或者注射液。
4.如权利要求3所述的镇痛药物，其特征在于，所述注射液包括但不限于皮下注射液和腹腔注射液。
5.权利要求1所述的多肽P10581在制备缓解骨癌痛药物中的用途。
6.如权利要求5所述的多肽P10581在制备缓解骨癌痛药物中的用途，其特征在于，所述多肽P10581皮下注射方式给药剂量为7.2-14.4μg/kg。
7.如权利要求5所述的多肽P10581在制备缓解骨癌痛药物中的用途，其特征在于，所述多肽P10581腹腔注射方式给药剂量为270-540μg/kg。
8.如权利要求5所述的多肽P10581在制备缓解骨癌痛药物中的用途，其特征在于，所述多肽P10581用于制备稳定性镇痛的药物。
9.如权利要求5所述的多肽P10581在制备缓解骨癌痛药物中的用途，其特征在于，所述多肽P10581用于制备低药物耐受性的骨癌痛镇痛药物。
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