CN115429871A - 司美格鲁肽新用途 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了司美格鲁肽在制备预防和/或治疗皮肤纤维化药物的用途。本申请首次研究表明司美格鲁肽具有明显的治疗皮肤纤维化的效果,并通过实验证实,对于经典的皮肤纤维化模型BLM小鼠,司美格鲁肽可以改善其皮肤纤维化状态;并且,司美格鲁肽能够抑制TGF‑β诱导的皮肤原代成纤维细胞的胶原‑1的表达,以及皮肤原代成纤维细胞的迁移。
Description
技术领域
本申请涉及药物新用途技术领域,特别是涉及司美格鲁肽在制备预防和/或治疗皮肤纤维化药物的用途。
背景技术
纤维化是病理性细胞外基质(ECM)过度蓄积,持续进展可致器官结构破坏和功能减退,乃至衰竭,严重威胁人类健康和生命。
纤维化可累及多种器官,如肺、肝、肾、腹膜、血管、胰腺、皮肤等,导致进行性组织瘢痕和器官功能障碍。成纤维细胞是皮肤纤维化过程中的中心细胞类型,可导致ECM积聚和炎症。纤维化性皮肤病涉及真皮中ECM成分的积聚,包括硬皮病、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩等;轻则减少汗腺分泌从而影响体温调节,重则关节挛缩致功能障碍。
迄今为止,目前临床上用于治疗皮肤纤维化的药物并没有取得良好疗效,因此寻找和开发新型抗皮肤纤维化药物是很有必要的。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的目的为提供司美格鲁肽在制备预防和/或治疗皮肤纤维化药物的用途;本申请通过实验证实,对于经典的皮肤纤维化模型BLM小鼠,司美格鲁肽可以改善其皮肤纤维化状态。并且司美格鲁肽能够抑制TGF-β诱导的皮肤原代成纤维细胞的胶原-1的表达,以及皮肤原代成纤维细胞的迁移。
本发明提供的技术方案如下:
司美格鲁肽在制备预防和/或治疗皮肤纤维化药物的用途。
优选地,司美格鲁肽具有减轻皮肤厚度、减轻胶原沉积的功效。
优选地,司美格鲁肽具有降低COL1、α-SMA的表达量的功效。
优选地,司美格鲁肽具有降低TGF-β、IL-6的表达量的功效。
优选地,所述皮肤纤维化由博来霉素诱导产生。
优选地,司美格鲁肽具有减弱TGF-β1刺激引起的COL1表达量升高的功效。
优选地,司美格鲁肽具有抑制TGF-β诱导的人皮肤原代成纤维细胞迁移的功效。
优选地,司美格鲁肽的给药方式为皮下注射给药。
优选地,所述药物包括有效剂量的司美格鲁肽。
优选地,所述药物还包括药学上可接受的辅料。
司美格鲁肽是一种长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物,能够以葡萄糖浓度依赖的模式刺激胰岛素的分泌,从而改善2型糖尿病患者的血糖控制,目前广泛用于治疗2型糖尿病。
本申请首次研究表明司美格鲁肽具有明显的治疗皮肤纤维化的效果,为皮肤纤维化疾病的治疗提供一种高效、安全的药物来源。
本申请通过司美格鲁肽处理皮下注射博来霉素(BLM)的小鼠,小鼠的皮肤HE、masson染色结果显示,BLM小鼠给予司美格鲁肽处理后,相比于BLM对照组,皮肤增厚和胶原沉积明显减少,western blot结果显示,胶原-1(COL1)、平滑肌α-肌动蛋白(SMA)的表达在司美格鲁肽处理的BLM小鼠中的表达相比BLM对照组明显下调。本发明的结果证明了,对于经典的皮肤纤维化模型BLM小鼠,司美格鲁肽可以改善其皮肤纤维化状态。
并且,实验显示,司美格鲁肽能够抑制TGF-β诱导的皮肤原代成纤维细胞的胶原-1的表达,以及皮肤原代成纤维细胞的迁移。
因此,本申请提供司美格鲁肽制备预防和/或治疗皮肤纤维化药物的用途,可以用于制备皮肤纤维化治疗药物。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为小鼠皮肤HE和Masson染色照片;显示司美格鲁肽减轻博来霉素诱导的皮肤纤维化模型小鼠的纤维化程度。BLM模型组的皮肤厚度、胶原沉积明显高于PBS组,司美格鲁肽治疗组的皮肤厚度、胶原沉积与BLM模型组相比,均有明显下降,图中,***代表P<0.001,****代表P<0.0001;其中1为空白对照组,2为BLM模型组,3为司美格鲁肽治疗组;4为单纯司美格鲁肽组;
图2为小鼠皮肤Western blot结果图;BLM模型组与空白对照组相比,其COL1和α-SMA的表达量显著升高;司美格鲁肽治疗组小鼠经司美格鲁肽处理后,相较BLM模型组,其COL1和α-SMA的表达量明显下降;其中1为空白对照组,2为BLM模型组,3为司美格鲁肽治疗组;4为单纯司美格鲁肽组;
图3为小鼠血清ELISA结果;显示BLM模型组小鼠血清中TGF-β和IL-6的表达显著高于空白对照组,司美格鲁肽治疗组与BLM模型组相比,均有明显下降。图中,*代表<0.05;**代表<0.01;其中1为空白对照组,2为BLM模型组,3为司美格鲁肽治疗组;
图4为健康成人原代成纤维细胞western blot结果图,经TGFβ1刺激24小时后,阳性对照组COL1的蛋白表达量与空白对照组相比较明显升高,而2nM和20nM司美格鲁肽处理能够减弱TGF-β1刺激引起的COL1表达量升高,2nM与20nM对比无差异;
图5为健康成人原代成纤维细胞迁移结果图,其24h和48h结果均表明司美格鲁肽显著抑制了TGF-β诱导的人皮肤原代成纤维细胞迁移,图中,ns代表>0.05,*代表<0.05;**代表<0.01,***代表<0.001。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
需要说明的是,当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件上,它可以直接在另一个元件上或者间接设置在另一个元件上;当一个元件被称为是“连接于”另一个元件,它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至另一个元件上。
需要理解的是,术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本申请和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本申请的限制。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多该特征。在本申请的描述中,“多个”、“若干个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确具体的限定。
须知,本说明书附图所绘示的结构、比例、大小等,均仅用以配合说明书所揭示的内容,以供熟悉此技术的人士了解与阅读,并非用以限定本申请可实施的限定条件,故不具技术上的实质意义,任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整,在不影响本申请所能产生的功效及所能达成的目的下,均应仍落在本申请所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
一、小鼠实验
以下实验将通过研究司美格鲁肽对博来霉素(BLM)诱导小鼠皮肤纤维化程度的影响,以证明司美格鲁肽可作为治疗皮肤纤维化的药物。
通过连续皮下注射博来霉素28天建立皮肤纤维化模型,建立完纤维化模型后再给予连续21天(1次/天)皮下注射司美格鲁肽治疗,以观察司美格鲁肽对皮肤纤维化小鼠的影响。
1动物模型构建
实验所用到的小鼠为BALB/c小鼠(8周龄,18-22g),均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。所有实验均经中南大学动物伦理审查委员会批准。实验小鼠每3只喂养于塑料笼中,给予标准饮食和正常饮水,室温控制在20~25℃,相对湿度50~60%,12小时光照循环。
BALB/c小鼠6周龄进入屏障环境后使其适应2周,于小鼠8周龄时开始实验处理。12只小鼠随机分配入PBS加生理盐水(空白对照组)组(n=3)、BLM加生理盐水组(BLM模型组)(n=3)、BLM后给予司美格鲁肽处理组(司美格鲁肽治疗组)(n=3)、PBS加司美格鲁肽组(单纯司美格鲁肽组)(n=3)。
BLM模型组、司美格鲁肽治疗组、单纯司美格鲁肽组先进行PBS/BLM皮下注射造模:小鼠背部剃毛后,首先用75%酒精棉球消毒小鼠剃毛区域皮肤和注射针头。一人固定小鼠的头尾,另一人一只手轻轻捏起剃毛区域的皮肤,另一只手用1mL注射器吸取配置好的工作液,在剃毛区域中央进针,使针头突破皮肤,进入皮下区域,然后缓缓注射100μL,每只小鼠BLM注射剂量40ug/d,注射完毕缓慢将针头抽出,再次酒精棉球消毒小鼠皮肤和针头。连续注射28天,以建立皮肤纤维化模型,该模型是最经典并最为常用的皮肤纤维化模型。
空白对照组每天注射100μL生理盐水,连续注射28天。
2药物干预及结果处置
2.1造模成功后,对司美格鲁肽治疗组进行药物干预,药物干预时间为21天,司美格鲁肽治疗组和单纯司美格鲁肽组小鼠皮下注射司美格鲁肽(0.12ug/kg/d),空白对照组及BLM模型组小鼠皮下注射等体积生理盐水。
2.2药物干预第21天,处死各组小鼠,取皮肤组织和全血,将皮肤组织分为两份,一份置于4%中性甲醛固定,随后针对各组样本分别给予HE,Masson染色,一份置于-80℃,后期行Western blot(检测COL1,α-SMA);结果见附图1-3。
其中,图1的HE和Masson染色显示司美格鲁肽减轻博来霉素诱导的皮肤纤维化模型小鼠的纤维化程度。BLM模型组的皮肤厚度、胶原沉积明显高于PBS组,司美格鲁肽治疗组的皮肤厚度、胶原沉积与BLM模型组相比,均有明显下降,图中,***代表P<0.001,****代表P<0.0001。
图2:Western blot结果分析表明,BLM模型组与空白对照组相比,其COL1和α-SMA的表达量显著升高;司美格鲁肽治疗组小鼠经司美格鲁肽处理后,相较BLM模型组,其COL1和α-SMA的表达量明显下降。
图3:ELISA结果分析表明,BLM模型组小鼠血清中TGF-β和IL-6的表达显著高于空白对照组,司美格鲁肽治疗组与BLM模型组相比,均有明显下降。图中,*代表<0.05;**代表<0.01。
二、细胞实验
1从一名正常成人皮肤组织中(男性包皮组织,25岁男性)成功提取原代皮肤成纤维细胞并培养,置于含10%胎牛血清、100单位/ml青霉素及100ug/ml链霉素的DMEM培养液中,于37℃、5%CCh培养箱中孵育,细胞传代用0.25%胰蛋白酶消化细胞。隔天换液,至细胞贴壁生长至亚融合状态(达到底面积的75%~80%)传代,分组,用无血清培养基平衡12小时,传至第三代后用于实验;然后分组分别给予刺激,
2刺激:去除原培养液,PBS清洗3次后,空白对照组用含有0.02%胎牛血清、100单位/ml青霉素及100ug/ml链霉素的DMEM培养液培养,TGF-β1(10ng/ml)阳性对照组用除空白对照组相同培养液外,加入10ng/mlTGF-β1培养,TGF-β1(10ng/ml)+司美格鲁肽(2nM)组除阳性对照组相同培养液外,加入2nM司美格鲁肽培养,TGF-β1(10ng/ml)+司美格鲁肽(20nM)组除阳性对照组相同培养液外,加入20nM司美格鲁肽培养。均于37℃、5%CCh培养箱中孵育24小时后,用0.25%胰蛋白酶消化细胞,提取细胞蛋白,进行COL1的Western blot检测,用TGF-β刺激成纤维细胞可促使高表达与纤维化密切相关的COL1,使成纤维细胞分泌细胞外基质COL1功能活跃。
Western blot分组类型:①空白对照组;②TGF-β1(10ng/ml)阳性对照组;③TGF-β1(10ng/ml)+司美格鲁肽(2nM);④TGF-β1(10ng/ml)+司美格鲁肽(20nM)。
结果如图4所示。
图4结果显示:经TGFβ1刺激24小时后,阳性对照组COL1的蛋白表达量与空白对照组相比较明显升高,而司美格鲁肽处理能够减弱TGF-β1刺激引起的COL1表达量升高,2nM与20nM对比无差异;TGF-β在成纤维细胞中高表达致成纤维细胞分泌过多的细胞外基质是促进SSc纤维化的原因。
3细胞迁移划痕试验:将生长良好的第4代人皮肤原代成纤维细胞消化后,接种于6孔板,实验分为:①空白对照组、②TGF-β1(10ng/ml)组、③TGF-β1(10ng/ml)+司美格鲁肽(20nM)组,待细胞生长至80-90%,进行实验。使用200ul枪头制作划痕,然后按照分组分别加入不含胎牛血清(FBS)的培养液,24h换液一次,每24h拍照一次,观察48h,于200倍显微镜下观测各组划痕距离的变化。用ImageJ软件分析细胞的迁移距离。
结果如图5所示。
图5结果显示:24h和48h结果均表明司美格鲁肽显著抑制了TGF-β诱导的人皮肤原代成纤维细胞迁移,TGF-β在成纤维细胞中高表达致成纤维细胞迁移较快是促进SSc纤维化的原因。图中,ns代表>0.05,*代表<0.05;**代表<0.01,***代表<0.001。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.司美格鲁肽在制备预防和/或治疗皮肤纤维化药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,司美格鲁肽具有减轻皮肤厚度、减轻胶原沉积的功效。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,司美格鲁肽具有降低COL1、α-SMA的表达量的功效。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,司美格鲁肽具有降低TGF-β、IL-6的表达量的功效。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途,其特征在于,所述皮肤纤维化由博来霉素诱导产生。
6.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,司美格鲁肽具有减弱TGF-β1刺激引起的COL1表达量升高的功效。
7.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,司美格鲁肽具有抑制TGF-β诱导的人皮肤原代成纤维细胞迁移的功效。
8.根据权利要求1-4、6-7中任一项所述的用途,其特征在于,司美格鲁肽的给药方式为皮下注射给药。
9.根据权利要求1-4、6-7中任一项所述的用途,其特征在于,所述药物包括有效剂量的司美格鲁肽。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于,所述药物还包括药学上可接受的辅料。
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