CN112920425A - 医用水凝胶组合物，医用水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供医用水凝胶组合物，医用水凝胶及其制备方法。医用水凝胶组合物包括第一组分和第二组分，其中，所述第一组分包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物和含有氨基的天然物质；所述第二组分包括水溶性壳聚糖或其衍生物和修饰有功能化基团的聚乙二醇，所述功能化基团包括甲氧基、琥珀酰亚胺基、巯基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺酯基、琥珀酰亚胺戊二酸酯基中的至少一种。本发明的医用水凝胶组合物的生物相容性好，可以与细胞良好复合，降解产物安全无毒，不存在过敏反应或者毒性反应的潜在危险。
Description
技术领域
本发明涉及一种医用水凝胶组合物，医用水凝胶及其制备方法，特别涉及一种水凝胶生物墨水及其制备方法，更具体地，本发明涉及一种分时策略的自支撑、自修复水凝胶生物墨水及其制备方法，属于生物医用材料领域。
背景技术
生物3D打印可以在体外模拟活体组织、器官及其功能单元，通过方便和有效地整合特定细胞和生物材料，用于各种临床模拟研究。在最常见、最廉价的微挤压打印中，已有大量的水凝胶生物墨水被报道具有无毒、生物相容性、形状保持和微结构保存等优点。然而，目前大部分生物墨水采取了溶胶(打印前)-凝胶(打印后)相变的成型固化方式，溶胶相在固化的过程中，随着打印时间和固化时间的延长，会导致细胞沉淀，使构建的类组织体中细胞的分布不均匀。此外，在打印过程中需要额外的辅助相变手段(低温、辅助交联或牺牲材料)来稳定结构。
由于上述问题的存在，剪切变稀和/或自愈合凝胶相生物墨水成为首选墨水。这是因为这种墨水在打印时易于保持预设形状，同时确保可接受的细胞分散度。剪切变稀和/或自愈合凝胶相生物墨水主要基于动态交联，如纳米化卡拉胶(nanoengineered kappa-carrageenan)、蛋白化海藻酸(protein-engineered alginate)、和羟基-环糊精/金刚石功能化的透明质酸(HA)。然而，由于这些凝胶相的生物墨水过于稀软而无法保持自身形状，上述水凝胶生物墨水体系的形状维持离不开温度控制或其他辅助手段，但温度控制不当和辅助交联在打印过程中是不利于细胞生存和形状保留的。虽然有一些自支撑水凝胶生物墨水的报道克服了上述困境，但原料和水凝胶的制备非常耗时，打印效果有待提高。因此，开发一种即用的、自支撑的水凝胶生物墨水具有重要的价值。
用于微挤压3D生物打印的、基于席夫碱交联的可注射水凝胶的强度通常可以横跨3个量级，这对于自支撑水凝胶来说是足够的。然而，由于席夫碱键在水溶液中容易水解，大多数应用时需将此类水凝胶制成大块状来延缓水解速率。此外，在主要使用这种水凝胶的3D生物打印中，如何平衡其自愈行为以避免微观结构融合也是一个挑战。
功能化的聚乙二醇(PEG)可以与常用蛋白质基材料的氨基通过水稳定共价键反应形成水凝胶，弥补了席夫碱水凝胶的过融合现象。单就该水凝胶而言，由于在稳定共价键中缺乏自愈合能力，必须采用轻交联，这就造成该水凝胶通常需要几个小时才能达到打印所要求的交联度，极大地降低了打印效率，同时难以控制交联程度和打印速率之间的平衡。
引用文献1公开了一种高拉伸、自修复和高粘合的生物相容性水凝胶材料。这类材料基于双网络结构的设计原理，由可聚合聚乙二醇基高分子构成第一重共价交联网络，超高分子量的亲水性高分子通过缠结而形成第二重非共价交联网络。第一重网络的网格尺寸需大于构成第二重网络高分子的分子有效尺寸，且构成第二重网络的高分子的分子量应大于其临界缠结分子量，使其形成有效的分子缠结，赋予双网络水凝胶高拉伸性、自修复特性和高粘合性。如上所述，由于在稳定共价键中缺乏自愈合能力，这种水凝胶材料在打印或挤出时受剪切力作用，第二重网络易从第一重网络中挤出，无法恢复；受外力作用发生分子链断裂也会引起形变。同时该体系必须采用轻交联，这就造成该水凝胶通常需要几个小时才能达到打印所要求的交联度，极大地降低了打印效率，同时难以控制交联程度和打印速率之间的平衡。
引用文献2公开了一种巯基-醛基交联水凝胶材料及其制备方法与应用。将组分A-含巯基的高分子衍生物溶于生物相容性介质得到溶液A；将组分B-含醛基的高分子衍生物溶于生物相容性介质得到溶液B；将溶液A和溶液B混合后即得该种水凝胶，即交联初期具有可塑性，交联后期可以形成可去除性的水凝胶体系，也可以形成力学性能增强的互穿网络水凝胶体系。但是，这种水凝胶材料的自修复性能较差，且通透性较差，不利于营养物质和新陈代谢废物的传递。
引用文献：
引用文献1：CN110240712A
引用文献2：CN110128682 A
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的技术问题，例如：凝胶相的生物墨水过于稀软而无法保持自身形状，制备耗时，达到所需的交联度所需时间过长等，本发明首先提供了一种医用水凝胶组合物以及该医用水凝胶组合物制备得到的医用水凝胶。本发明的医用水凝胶组合物和医用水凝胶是优化的、具有即时即用的自支撑且能够自愈合的水凝胶体系。
进一步地，本发明还提供了一种医用水凝胶组合物的制备方法，该制备方法简单易行，适合大批量生产。
用于解决问题的方案
[1]、一种医用水凝胶组合物，其包括第一组分和第二组分，其中，
所述第一组分包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物和含有氨基的天然物质；
所述第二组分包括水溶性壳聚糖或其衍生物和修饰有功能化基团的聚乙二醇，所述功能化基团包括甲氧基、琥珀酰亚胺基、巯基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺酯基、琥珀酰亚胺戊二酸酯基中的至少一种。
[2]、根据上述[1]所述的医用水凝胶组合物，其中，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物中，醛基的含量为10％～50％，优选20～40％，更优选为25.31％～30.45％。
[3]、根据上述[1]或[2]所述的医用水凝胶组合物，其中，所述含有氨基的天然物质包括蛋白质或其衍生物、明胶或其衍生物、胶原或其衍生物中的一种或两种以上的组合。
[4]、根据上述[1]-[3]任一项所述的医用水凝胶组合物，其中，所述水溶性壳聚糖或其衍生物的数均分子量为8万～25万；和/或，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的数均分子量为80万～200万。
[5]、根据上述[1]-[4]任一项所述的医用水凝胶组合物，其中，所述修饰有功能化基团的聚乙二醇的数均分子量为5000～20000；和/或，所述聚乙二醇包括单臂聚乙二醇、二臂聚乙二醇或多臂聚乙二醇中的一种或两种以上的组合。
[6]、一种医用水凝胶，其特征在于，其由上述[1]-[5]任一项所述的医用水凝胶组合物的第一组分和第二组分反应后形成，优选地，所述医用水凝胶由所述第一组分和所述第二组分在缓冲溶液中反应后形成。
[7]、根据上述[6]所述的医用水凝胶，其中，所述医用水凝胶包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物交联形成的第一凝胶体系；以及
含有氨基的天然物质与修饰有功能化基团的聚乙二醇经交联形成的第二凝胶体系。
[8]、一种根据权利要求[6]或[7]所述的医用水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
将修饰有醛基的透明质酸或其衍生物溶于缓冲溶液中，得到第一反应液；将含有氨基的天然物质溶于缓冲溶液中，得到第四反应液；
将水溶性壳聚糖或其衍生物溶于缓冲溶液中，得到第二反应液；将修饰有功能化基团的聚乙二醇溶于缓冲溶液中，得到第三反应液；
将第一反应液与第四反应液混合，得到第一混合液；将第二反应液与第三反应液混合，得到第二混合液；
将第一混合液和第二混合液混合，得到医用水凝胶。
[9]、根据权利要求[8]所述的制备方法，其中，所述第一反应液中，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的质量体积浓度为2～6％；和/或，所述第二反应液中，所述水溶性壳聚糖或其衍生物的质量体积浓度为2～5％；和/或，所述第三反应液中，修饰有功能化基团的聚乙二醇的质量体积浓度为0.5～6％；和/或，所述第四反应液中，所述含有氨基的天然物质的质量体积浓度为1～5％。
[10]、根据上述[8]或[9]所述的制备方法，其中，所述第一反应液与所述第四反应液的体积比为1:0.5～4；所述第二反应液与第三反应液的体积比为1:0.5～4；优选地，所述第一反应液与第二反应液的体积相同；所述第三反应液与第四反应液的体积相同。
[11]、根据上述[8]-[10]任一项所述的制备方法，其中，所述第二反应液和/或第四反应液中还包含有细胞和/或生长因子。
[12]、一种医用水凝胶试剂盒，其包括权利要求[1]-[5]任一项所述的医用水凝胶组合物以及用于溶解医用水凝胶组合物的各组分的缓冲溶液。
[13]、根据上述[12]所述的医用水凝胶试剂盒，其中，所述医用水凝胶组合物的第一组分与第二组分是分开储存的；
优选地，所述医用水凝胶组合物的第一组分中的修饰有醛基的透明质酸或其衍生物和含有氨基的天然物质是分开储存的；和/或，所述第二组分中的水溶性壳聚糖或其衍生物和修饰有功能化基团的聚乙二醇是分开储存的。
发明的效果
本发明的医用水凝胶组合物至少具备如下技术效果之一：
本发明的医用水凝胶组合物的生物相容性好，可以与细胞良好复合，降解产物安全无毒，不存在过敏反应或者毒性反应的潜在危险；
本发明的医用水凝胶组合物具备自支撑的性能，在打印前即可获得一定强度的凝胶并不影响可打印性能，可以满足打印过程中快速成型的要求；
本发明的医用水凝胶组合物的原料用量较少，含水量大，通透性好，便于营养物质和新陈代谢废物的传递；
本发明的医用水凝胶组合物在进行交联反应制备水凝胶时的条件温和，不会损伤细胞；
本发明的医用水凝胶组合物的制备方法简单易行，原料易于获取，且能够即配即用，降低了配液难度和生产成本。
本发明的医用水凝胶组合物存在稳定的交联键，使得打印制得的类组织体具有较高的抗水解性能。
附图说明
图1示出了医用水凝胶组合物及医用水凝胶的制备过程示意图；
图2示出了医用水凝胶的打印性能测试结果；
图3A示出了使用alamar-blue检测的实施例2和对比例3的细胞增殖速率；
图3B示出了采用EdU+流式分析本发明的实施例2和对比例3的细胞增殖能力；
图3C示出了采用活死染色分析本发明的实施例2的细胞增殖情况；
图3D示出了采用活死染色分析本发明的对比例3的细胞增殖情况；
图3E示出了各种不同细胞的活体细胞比例；
图4示出了医用水凝胶的抗水解性能测试结果；
图5示出了医用水凝胶的自修复性能测试结果；
图6示出了医用水凝胶的通透性测试结果。
具体实施方式
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，如没有特殊声明，则“多”、“多种”、“多个”等中的“多”表示2或以上的数值。
本说明书中，所述“基本上”、“大体上”或“实质上”表示于相关的完美标准或理论标准相比，误差在5％以下，或3％以下或1％以下。
本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
<第一方面>
本发明的第一方面提供了一种医用水凝胶组合物，其包括第一组分和第二组分，其中，
所述第一组分包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物和含有氨基的天然物质；
所述第二组分包括水溶性壳聚糖或其衍生物和修饰有功能化基团的聚乙二醇，所述功能化基团包括甲氧基、琥珀酰亚胺基、巯基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺酯基、琥珀酰亚胺戊二酸酯基中的至少一种。
其中，所述第一组分和第二组分可以是分离的，在使用时将第一组分和第二组分混合。优选地，所述第一组分中的修饰有醛基的透明质酸或其衍生物和含有氨基的天然物质也是分离的，在使用之前几个小时或使用时将修饰有醛基的透明质酸或其衍生物和含有氨基的天然物质混合；所述第二组分中的水溶性壳聚糖或其衍生物和修饰有功能化基团的聚乙二醇也是分离的，在使用之前几个小时或使用时将水溶性壳聚糖或其衍生物和修饰有功能化基团的聚乙二醇混合。
在实际应用的过程中，所述第一组分中的修饰有醛基的透明质酸或其衍生物和含有氨基的天然物质可以分别单独储存，使用前或使用时再分别溶解于缓冲溶液之后再进行混合；当然也可以先进行混合，再将其溶于缓冲溶液中。所述第二组分中的水溶性壳聚糖或其衍生物和修饰有功能化基团的聚乙二醇也可以分别单独储存，使用前或使用时再分别溶解于缓冲溶液之后再进行混合；当然也可以先进行混合，再将其溶于缓冲溶液中。本发明对所述的医用水凝胶组合物中的各组分的储存方式没有限制，所属技术领域人员可以根据需要，选择具体的储存方式，均在本发明的范围之内。
第一组分
本发明的第一组分包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物和含有氨基的天然物质。
对于修饰有醛基的透明质酸或其衍生物，本发明对于醛基的修饰方式不作特别限定，可以是本领域常用的一些修饰方式，例如：在透明质酸上接枝醛基、取代获得醛基或者开环氧化得到醛基等。具体地，在本发明中，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物中，醛基的含量为10％～50％，优选20％～40％，更优选为25.31％～30.45％，例如：15％、25％、30％、35％、45％等。当醛基的含量为10％～50％时，有利于与水溶性壳聚糖或其衍生物发生反应，具有优异的成胶性能。
为了保证较好的凝胶强度，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的数均分子量在80万～200万之间，优选100万～150万。对于修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的来源，本发明不作特别限定，可以是本领域常用的制备方法制备得到。例如：利用氧化剂对透明质酸或其衍生物进行氧化得到。
对于含有氨基的天然物质，在本发明中不作特别限定，只要其含有氨基即可。具体地，所述含有氨基的天然物质包括蛋白质或其衍生物、明胶或其衍生物、胶原或其衍生物、哺乳动物组织中的一种或两种以上的组合。对于哺乳动物组织，可以是皮肤、粘膜、肌肉等哺乳动物组织。
第二组分
本发明的所述第二组分包括水溶性壳聚糖或其衍生物和修饰有功能化基团的聚乙二醇，所述功能化基团包括甲氧基、琥珀酰亚胺基、巯基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺酯基、琥珀酰亚胺戊二酸酯基中的至少一种。
对于水溶性壳聚糖或其衍生物，包括但不限于取代化壳聚糖(例如：羧甲基壳聚糖(CMC)、羟丙基壳聚糖(HPCS))、壳聚糖盐类(例如：壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖谷氨酸盐等)、壳聚糖硫酸酯、壳聚糖寡糖、类透明质酸壳聚糖等，以及上述水溶性壳聚糖作为接枝原料的水溶性共聚物。
进一步，在本发明中，为保证较好的凝胶强度，所述水溶性壳聚糖的数均分子量在8万～25万之间，优选10万～20万，例如：9万～24万，11万～22万，13万～18万，14万～16万等等。
对于修饰有功能化基团的聚乙二醇，其中，所述聚乙二醇可以包括单臂聚乙二醇、二臂聚乙二醇或多臂聚乙二醇中的一种或两种以上的组合。对于多臂聚乙二醇，可以是四臂聚乙二醇、八臂聚乙二醇等。
具体地，修饰有功能化基团的聚乙二醇可以包括但不仅限于甲氧基聚乙二醇、同官能团取代聚乙二醇、异官能团取代聚乙二醇等，如，甲氧基聚乙二醇氨基(MPEG-NH2)、甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(MPEG-NHS)、二琥珀酰亚胺戊二酸酯聚乙二醇(SG-PEG-SG)、羧基-聚乙二醇-羧基(HOOC-PEG-COOH)、巯基-聚乙二醇-巯基(HS-PEG-SH)、巯基-聚乙二醇-马来酰亚胺(HS-PEG-Mal)等。
进一步，在本发明中，所述修饰有功能化基团的聚乙二醇的数均分子量为5000～20000，优选10000～20000；例如：6000～11000，7000～10000，8000～9000等；和/或，所述聚乙二醇包括单臂聚乙二醇、二臂聚乙二醇或多臂聚乙二醇中的一种或两种以上的组合。
本发明的医用水凝胶组合物所使用的材料为水溶性天然高分子，生物相容性好，可以与细胞良好复合，降解产物安全无毒，不存在过敏反应或者毒性反应的潜在危险。
<第二方面>
本发明的第二方面提供了一种医用水凝胶，其由本发明第一方面的所述的医用水凝胶组合物的第一组分和第二组分反应后形成，优选地，所述医用水凝胶由所述第一组分和所述第二组分在缓冲溶液中反应后形成。
对于缓冲溶液，本发明不作特别限定，可以是本领域常用的生物缓冲溶液，优选使用pH值为7.2～7.4的缓冲溶液。例如：磷酸盐缓冲溶液等(PBS缓冲溶液)等。
具体地，所述医用水凝胶包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物交联形成的第一凝胶体系；以及
含有氨基的天然物质与修饰有功能化基团的聚乙二醇经交联形成的第二凝胶体系。
本发明提出了应用分时(time-sharing,TSH)策略来制备医用水凝胶，并通过简单的混合方法即可制得自支撑、自愈合的医用水凝胶。本发明提出的TSH策略是应用基于动态交联的席夫碱共价键的快速即时凝胶体系，使医用水凝胶快速得到基础强度并可用于3D打印，同时应用基于稳定交联的水稳定共价键的缓慢凝胶体系，在3D打印中和3D打印后维持结构的稳定性。
本发明的医用水凝胶是一种复合水凝胶，其具有均匀的粘弹性、自愈性和高渗透性。这种高渗透性的自支撑、自愈合的医用水凝胶不仅可以为生物3D打印、组织工程提供材料基础，而且可以为靶向细胞治疗提供一种方便实用的解决方案。
本发明的第一凝胶体系，是一种快速凝胶体系，其是由席夫碱共价键作为主要交联基团的凝胶体系，具体地，是指由修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物通过席夫碱共价键交联形成的凝胶体系。在此第一凝胶体系中，修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物的氨基通过席夫碱反应形成动态交联的共价键，从而获得第一凝胶体系。
具体地，所述快速凝胶体系的交联速率较快，一般为5s～10min，在优化的体系浓度下，优选20s～3min，例如：20s、40s、1min、2min、4min、5min、6min、7min、8min、9min等。
本发明的第二凝胶体系，是一种慢速凝胶体系，其是由稳定共价键交联反应形成的凝胶体系。具体地，是由修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物的材料交联形成的水凝胶体系。
由于本发明医用水凝胶在凝胶初期即有快速凝胶体系成胶形成基础强度，然后慢速凝胶体系随着打印和体外培养的进行逐步凝胶，因此对慢速凝胶体系的成胶时间不做规定。具体地，对于慢速凝胶体系的交联速率，其反应时间通常大于10min，例如：15min、20min、25min等。
<第三方面>
本发明的第三方面提供了一种根据本发明第二方面的医用水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
将修饰有醛基的透明质酸或其衍生物溶于缓冲溶液中，得到第一反应液；将含有氨基的天然物质溶于缓冲溶液中，得到第四反应液；
将水溶性壳聚糖或其衍生物溶于缓冲溶液中，得到第二反应液；将修饰有功能化基团的聚乙二醇溶于缓冲溶液中，得到第三反应液；
将第一反应液与第四反应液混合，得到第一混合液；将第二反应液与第四反应液混合，得到第三混合液；
将第一混合液和第二混合液混合，得到医用水凝胶。
在一些具体的实施方案中，所述第一反应液中，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的质量体积浓度为2～6％，例如2.5％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％等；和/或，所述第二反应液中，所述水溶性壳聚糖或其衍生物的质量体积浓度为2～5％，例如2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％等；和/或，所述第三反应液中，修饰有功能化基团的聚乙二醇的质量体积浓度为0.5～6％，例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％等；和/或，所述第四反应液中，所述含有氨基的天然物质的质量体积浓度为1～5％，例如1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％等。
进一步地，所述第一反应液与所述第四反应液的体积比为1:0.5～4，例如：1:0.8、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5等；所述第二反应液与第三反应液的体积比为1:0.5～4，例如：1:0.8、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5等。为了获取性能优异的医用水凝胶，则第一反应液和第二反应液的体积应当相同，第三反应液和第四反应液的体积应当相同。当第一反应液和第二反应液的体积相同，第三反应液和第四反应液的体积相同时，同样可能存在未反应的基团，未反应基团会有助于巯基于组织上的氨基反应，提高胶水的粘附性。
在一些具体的实施方案中，基于细胞和/或生长因子与第一反应液、第二反应液、第三反应液以及第四反应液的生物相容性，所述第二反应液和/或第四反应液中还包含有细胞和/或生长因子。作为优选，在第四反应液掺杂细胞和/或生长因子，这样可以进一步减少细胞和/或生长因子与生物相容性不好的反应液的接触时间。
对于细胞，可以是任何可行的生物活细胞。其具体类型取决于所生产的细胞构建体、组织或器官的类型。例如所述细胞可以包括并不限于为收缩性细胞或肌肉细胞、结缔组织细胞、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、胃肠道细胞、肝细胞、胰腺细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、生殖细胞、脂肪细胞、间皮细胞、间质细胞、内胚层源细胞、中胚层源细胞、外胚层源细胞中的一种或两种以上的组合。
具体地，所述细胞可以单独冻存在液氮罐中，需要时解冻复苏，复苏后用缓冲溶液洗涤2-4次，离心去除缓冲溶液，用细胞培养基重悬并计数，进而添加至第三反应液中。
对于生长因子，所述生长因子包括但不限于神经生长因子、表皮生长因子、骨骼生长因子、造血生长因子、内皮生长因子、胶质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、多肽生长因子中的一种或两种以上的组合。
本发明通过将生长因子引入医用水凝胶中，优点在于可以给医用水凝胶中的细胞提供营养。在运用3D打印技术打印出支架，生长因子可以促进水凝胶支架上的细胞分化、增值，加速组织重建。
本发明的所述医用水凝胶可以促使细胞更好地增殖、细胞分布较为立体，同时在长期培养时，仍保持更好的促细胞能力。
本发明的医用水凝胶可以用3D打印。在具体的打印过程中，第一反应液和第二反应液相遇后可以快速成胶，混合液逐渐形成一定强度的凝胶的同时还可以从注射器中挤出，保持着可打印性；第三反应液和第四反应液相遇后凝胶反应亦已开始，但因反应速率较慢，不会影响前期的可打印性，且随着慢速凝胶反应的加深，所述生物墨水的凝胶强度进一步增强。本发明的医用水凝胶生具有即时打印功能，且可以在打印过程中保持稳定。
具体地，本发明的医用水凝胶可以在生物打印、体外细胞培养、体内组织修复、水凝胶覆盖与封堵、体内含细胞凝胶注射等方面中进行应用。
<第四方面>
本发明的第四方面提供了一种医用水凝胶试剂盒，其包括本发明第一方面所述的医用水凝胶组合物以及用于溶解医用水凝胶组合物的各组分的缓冲溶液。
根据本发明的医用水凝胶试剂盒，所述医用水凝胶组合物的第一组分与第二组分是分开储存的；
优选地，所述医用水凝胶组合物的第一组分中的修饰有醛基的透明质酸或其衍生物和含有氨基的天然物质是分开储存的；和/或，所述第二组分中的水溶性壳聚糖或其衍生物和修饰有功能化基团的聚乙二醇是分开储存的。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例中，修饰有醛基的透明质酸(AHA)的制备方法如下：用稀HCl将去离子水的pH调节到6.0，称取1.5g透明质酸溶于150mL pH为6.0的去离子水中，磁力搅拌一天使其充分溶解。然后加入16.5mL，0.25mol/L的高碘酸钠溶液，40℃磁力搅拌3h后加入30mL乙二醇终止反应，将反应液移至截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋置入去离子水中透析3天，每8h换水一次。而后将透析后的反应液冷冻干燥即得修饰有醛基透明质酸，记作AHA。经羟胺基法显色滴定分析，如上制备的修饰有醛基透明质酸中，醛基的含量为27.45±3.60％，修饰有醛基透明质酸的数均分子量为100万～150万。
透明质酸：山东福瑞达医药集团有限公司，中国；
羧甲基壳聚糖(CMC)、羟丙基壳聚糖(HPCS)：上海麦克林生化科技有限公司，中国，数均分子量为10万～20万；
四臂-聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊二酸(4-arm-PEG-SG)、双臂二巯基聚乙二醇(2-arm-PEG-SH)：厦门赛诺邦格生物科技有限公司，中国，数均分子量为1万～2万；
明胶、胶原：GELITA嘉利达有限公司，德国。
实施例1
(1)将0.4g的修饰有醛基透明质酸(AHA)溶解于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，常温搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤除菌后形成4％(w/v)的第一反应液，记作AHA溶液。
(2)将0.3g的CMC(羧甲基壳聚糖)溶解于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃搅拌过夜，0.22μm滤膜过滤除菌后形成3％(w/v)的第二反应液，记作CMC溶液。
(3)将0.2g的4-arm-PEG-SG(四臂-聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊二酸)溶解于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，在打印前快速搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤除菌后形成2％(w/v)的第三反应液，记作PEG-SG溶液。
(4)将0.4g的Gelatin(明胶)溶解于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃搅拌过夜，0.22μm滤膜过滤除菌后形成4％(w/v)的第四反应液，记作GEL溶液。
(5)将AHA溶液和GEL溶液在室温、无菌条件下按1：1体积比混合，形成第一混合液，记作AHA-GEL混合液；将CMC溶液和PEG-SG溶液在室温、无菌条件下按1：1体积比混合，形成第一混合液，记作CMC-PEG-SG溶液。
(6)将AHA-GEL混合液和CMC-PEG-SG混合液分别取5mL注入2个无菌注射器中，将2个无菌注射器通过鲁尔转接头连接后，反复互相推注30s使混合液充分混匀，即得体积比为1：1：1：1的医用水凝胶，其中各组分的最终质量浓度(w/v)为：1％AHA、0.75％CMC、0.5％PEG-SG、1％GEL。
实施例2
(1)将0.53g的修饰有醛基透明质酸(AHA)溶解于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，常温搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤除菌后形成5.3％(w/v)的第一反应液，记作AHA溶液。
(2)将0.4g的羟丙基壳聚糖(HPCS)溶解于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃搅拌过夜，0.22μm滤膜过滤除菌后形成4％(w/v)的第二反应液，记作HPCS溶液。
(3)将0.26g的2-arm-PEG-SH(双臂二巯基聚乙二醇)溶解于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，在打印前快速搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤除菌后形成2.6％(w/v)的第三反应液，记作PEG-SH溶液。
(4)将0.13g的Collagen(胶原蛋白)溶解于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃搅拌过夜，0.22μm滤膜过滤除菌后形成1.3％(w/v)的COL溶液，并按照1.5×106/mL的细胞量将NIH/3T3细胞加入的第四反应液，记作COL溶液。
(5)将AHA溶液和COL溶液在室温、无菌条件下按2：1体积比混合，形成第一混合液，记作AHA-COL混合液；将HPCS溶液和PEG-SH溶液在室温、无菌条件下按2：1体积比混合，形成第二混合液，记作HPCS-PEG-SH溶液。
(6)将AHA-COL混合液和HPCS-PEG-SH混合液各取5mL注入2个无菌注射器中，将2个无菌注射器通过鲁尔转接头连接后，反复互相推注30s使混合液充分混匀，即得体积比为2：2：1：1的医用水凝胶，其中各组分的最终质量浓度(w/v)为：1.33％AHA、1％CMC、0.67％PEG-SH、0.33％COL。
实施例3
(1)将0.26g的修饰有醛基透明质酸(AHA)溶解于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，常温搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤除菌后形成2.6％(w/v)的第一反应液，记作AHA溶液。
(2)将0.2g的CMC(羧甲基壳聚糖)溶解于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃搅拌过夜，0.22μm滤膜过滤除菌后形成2％(w/v)的第二反应液，记作CMC溶液。
(3)将0.53g的4-arm-PEG-SG(四臂-聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊二酸)溶解于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，在打印前快速搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤除菌后形成5.3％(w/v)的第三反应液，记作PEG-SG溶液。
(4)将0.26g的Gelatin(明胶)溶解于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃搅拌过夜，0.22μm滤膜过滤除菌后形成2.6％(w/v)的第四反应液，记作GEL溶液。
(5)将AHA溶液和GEL溶液在室温、无菌条件下按1：2体积比混合，形成第一混合液，记作AHA-GEL混合液；将CMC溶液和PEG-SG溶液在室温、无菌条件下按1：2体积比混合，形成第一混合液，记作CMC-PEG-SG溶液。
(6)将AHA-GEL混合液和CMC-PEG-SG混合液分别取5mL注入2个无菌注射器中，将2个无菌注射器通过鲁尔转接头连接后，反复互相推注30s使混合液充分混匀，即得体积比为1：1：2：2的医用水凝胶，其中各组分的最终质量浓度(w/v)为：0.67％AHA、0.5％CMC、0.67％PEG-SG、1.33％GEL。
对比例1
快速凝胶体系AHA-CMC(羧甲基壳聚糖)。
如实施例1所述制得AHA溶液和CMC(羧甲基壳聚糖)溶液，按体积比1：1混合。在该对比例中，AHA的最终质量浓度(w/v)为2％，CMC的最终质量浓度(w/v)为1.5％。
对比例2
慢速凝胶体系PEG(聚乙二醇)-SG-GEL。
如实施例1所述制得PEG-SG溶液和GEL溶液，按体积比1：1混合。在该对比例中，PEG-SG的最终质量浓度(w/v)为1％，GEL的最终质量浓度(w/v)为2％。
对比例3
市售的海藻酸钠-明胶(ALG-GEL)生物墨水(SunP Gel A1，上普博源(北京)生物科技有限公司，中国)。
性能测试
1、3D打印
对实施例1和对比例1以及对比例2的生物墨水进行3D打印(打印针头规格25G
Livprint Norm打印机，打印网格横纵角度90°，30％填充率，针头线性速度6mm/s)，结果如图2所示。
结果显示，对比例1的快速凝胶体系AHA-CMC存在动态交联共价键，打印中会出现过融合现象，使得打印丝线融合成为块状，无法保持打印效果；对比例2的慢速凝胶体系PEG-SG-GEL挤出困难，调整打印参数并采取低交联度交联后，可得到类似预设形状的团块，但较低交联度使得该部分在浸水10min后即破裂；实施例1的生物墨水是四相体系经过测试，可以实现即时打印，打印效果优良，不会出现过融合或挤出困难的情况，打印结构清晰。
2、使用小鼠胚胎细胞(NIH/3T3)来测试所述生物墨水在细胞增殖性能。
首先使用实施例2所述制备的医用水凝胶，并通过生物打印技术将其制备为6层、12×12mm的立体网状结构细胞模型；而后利用对比例3的市售的海藻酸钠-明胶(ALG-GEL)生物墨水制备同样尺寸、同样细胞量的立体网状结构细胞模型作为对照组。将两组细胞模型转入含有10％FBS的DMEM培养基中，置入细胞培养箱中在37℃、5％CO2条件下培养。分别在第1、5、9、13、17、21天测试细胞增值率和并进行活死染色，结果如图3所示。
从结果中可以看出，在alamar-blue检测中，本发明所述的医用水凝胶呈现较高水平。与对比例3的ALG-GEL水凝胶相比，二者在第1天至第5天的细胞增殖情况上没有明显差别，但从第9天开始，实施例2中的细胞开始呈现远快于对比例3中的细胞增殖速率，并于第13天开始逐步下降并逐步进入平台期，但其相对细胞密度仍高于对比例3中的细胞密度，如图3A所示。
EdU+流式分析证明，在第9天对比例3的ALG-GEL生物墨水中仅有16.12±2.67％的细胞仍具有增殖能力，在第21天几乎全部细胞均不进行增殖；本发明所述的医用水凝胶在在第9天还有43.59±5.83％的细胞仍具有增殖能力，在第21天还有12.35±1.65％的细胞仍具有增殖能力，如图3B所示。
通过活死染色发现，在本发明所述的医用水凝胶中，细胞呈现更为立体的分布，同时活细胞数量较高、双染细胞较少、死细胞较少(如图3C和图3D所示)。由图3E可以看出，从第9天开始，实施例2与对比例3相比，活细胞数量保持较高水平，双染细胞保持较低水平，存在显著差异，且该差异在第21天进一步加剧。结合EdU+流式分析，说明本发明所述医用水凝胶不仅可以保持较高的细胞密度，且细胞的增殖活力更强更持久。
3、抗水解性能测试
将实施例1、2、3中制得的水凝胶体系分别置于培养皿中，加入20mL的MEM培养基，分别于加入后、第3天、第7天、第14天、第21天通过拍照观察水解情况，结果如图4所示。
由图4可以看出，经过水解测试，不同混合比例的水凝胶均可达到7天以上的抗水解性能，其中1：1：1：1的水凝胶更是可以保证21天的水解而不解体，为细胞的增殖提供了长期的支架空间。可见，本发明所述的医用水凝胶体系存在较为稳定的化学交联键，从而使得水凝胶的抗水解性能大大增强。
4、自愈合/自修复能力
取实施例1制得的医用水凝胶体系4份，并两两以两种颜色进行标记，将上述4份生物墨水进行组合后静置10min，结果如图5所示。
由图5可以看出，上述4份生物墨水可以融合成为整体，并具有一定的力学强度。
5、通透性测试
取实施例2的医用水凝胶，并在其中参杂0.05g/mL的食品级水溶性颜料，然后观察其通透性，结果如图6所示。
由图6可以看出，将上述生物墨水浸入水中，20min后可见从凝胶块周围开始，颜色明显降低；浸泡2h后，凝胶块基本褪去颜色。而后将同一块凝胶块浸入0.05g/mL的食品级水溶性颜料溶液中2h，可发现凝胶块重新吸收颜料呈现颜料色。该实验证明了本发明的医用水凝胶具有良好的通透性。
需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (13)
1.一种医用水凝胶组合物，其特征在于，包括第一组分和第二组分，其中，
所述第一组分包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物和含有氨基的天然物质；
所述第二组分包括水溶性壳聚糖或其衍生物和修饰有功能化基团的聚乙二醇，所述功能化基团包括甲氧基、琥珀酰亚胺基、巯基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺酯基、琥珀酰亚胺戊二酸酯基中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的医用水凝胶组合物，其特征在于，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物中，醛基的含量为10％～50％，优选为20～40％，更优选为25.31％～30.45％。
3.根据权利要求1或2所述的医用水凝胶组合物，其特征在于，所述含有氨基的天然物质包括蛋白质或其衍生物、明胶或其衍生物、胶原或其衍生物中的一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的医用水凝胶组合物，其特征在于，所述水溶性壳聚糖或其衍生物的数均分子量为8万～25万；和/或，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的数均分子量为80万～200万。
5.根据权利要求1-4任一项所述的医用水凝胶组合物，其特征在于，所述修饰有功能化基团的聚乙二醇的数均分子量为5000～20000；和/或，所述聚乙二醇包括单臂聚乙二醇、二臂聚乙二醇或多臂聚乙二醇中的一种或两种以上的组合。
6.一种医用水凝胶，其特征在于，其由权利要求1-5任一项所述的医用水凝胶组合物的第一组分和第二组分反应后形成，优选地，所述医用水凝胶由所述第一组分和所述第二组分在缓冲溶液中反应后形成。
7.根据权利要求6所述的医用水凝胶，其特征在于，所述医用水凝胶包括修饰有醛基的透明质酸或其衍生物与水溶性壳聚糖或其衍生物交联形成的第一凝胶体系；以及
含有氨基的天然物质与修饰有功能化基团的聚乙二醇经交联形成的第二凝胶体系。
8.一种根据权利要求6或7所述的医用水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将修饰有醛基的透明质酸或其衍生物溶于缓冲溶液中，得到第一反应液；将含有氨基的天然物质溶于缓冲溶液中，得到第四反应液；
将水溶性壳聚糖或其衍生物溶于缓冲溶液中，得到第二反应液；将修饰有功能化基团的聚乙二醇溶于缓冲溶液中，得到第三反应液；
将第一反应液与第四反应液混合，得到第一混合液；将第二反应液与第三反应液混合，得到第二混合液；
将第一混合液和第二混合液混合，得到医用水凝胶。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述第一反应液中，所述修饰有醛基的透明质酸或其衍生物的质量体积浓度为2～6％；和/或，所述第二反应液中，所述水溶性壳聚糖或其衍生物的质量体积浓度为2～5％；和/或，所述第三反应液中，修饰有功能化基团的聚乙二醇的质量体积浓度为0.5～6％；和/或，所述第四反应液中，所述含有氨基的天然物质的质量体积浓度为1～5％。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，所述第一反应液与所述第四反应液的体积比为1:0.5～4；所述第二反应液与第三反应液的体积比为1:0.5～4；优选地，所述第一反应液与第二反应液的体积相同；所述第三反应液与第四反应液的体积相同。
11.根据权利要求8-10任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第二反应液和/或第四反应液中还包含有细胞和/或生长因子。
12.一种医用水凝胶试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的医用水凝胶组合物以及用于溶解医用水凝胶组合物的各组分的缓冲溶液。
13.根据权利要求12所述的医用水凝胶试剂盒，其特征在于，所述医用水凝胶组合物的第一组分与第二组分是分开储存的；
优选地，所述医用水凝胶组合物的第一组分中的修饰有醛基的透明质酸或其衍生物和含有氨基的天然物质是分开储存的；和/或，所述第二组分中的水溶性壳聚糖或其衍生物和修饰有功能化基团的聚乙二醇是分开储存的。
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