CN112920262A

CN112920262A - 一种可抑制CGMMV积累的蛋白ClALKBH2B、其基因、表达载体、转化体及方法

Info

Publication number: CN112920262A
Application number: CN202110150075.8A
Authority: CN
Inventors: 何艳军; 范敏; 张慧青; 李玉林; 姚依秀
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN112920262B

Abstract

本发明“一种可抑制CGMMV积累的蛋白ClALKBH2B、其基因、表达载体、转化体及方法”属于植物基因工程领域。所述可抑制CGMMV积累的蛋白ClALKBH2B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的蛋白ClALKBH2B是一个质膜定位的蛋白，ClALKBH2B过表达后第3天，能明显抑制CGMMV病毒的积累水平。

Description

一种可抑制CGMMV积累的蛋白ClALKBH2B、其基因、表达载体、转化体及方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种可抑制CGMMV积累的蛋白ClALKBH2B、其基因、表达载体、转化体及方法。

背景技术

西瓜是一种在世界范围内广泛种植的经济作物。据统计，2018年我国西瓜播种面积约为2264万亩，总产量约为6302万吨，面积和产量均居世界第一(http://www.fao.org/faostat)。然而多种病虫害的爆发严重限制了西瓜产业的安全发展。其中，黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是一种典型的正义单链RNA病毒，属于帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员。该病毒在自然条件下主要侵染西瓜、黄瓜、甜瓜和瓠瓜等多种葫芦科作物，目前已在40多个国家或地区内报道发生，我国也大面积受到危害，尤其是西瓜嫁接地区更易大面积爆发，该病毒防治难度大，造成损失严重，2006年农业部发布公告将其确定为我国重要的检疫性病毒。目前，防治西瓜CGMMV主要依靠一些化学和农业防治手段，但都存在不足，发展绿色精准的抗病新策略和培育推广西瓜抗病新品种是解决问题的根本途径，而这些工作的有效开展依赖于对抗病基因的挖掘和植物免疫调控机制的深入研究。对西瓜CGMMV抗病调控机制的研究，将为西瓜CGMMV抗病分子育种提供重要的技术支撑和理论基础。

关于可抑制CGMMV积累的蛋白，本领域尚未报道。

发明内容

基于本领域存在的上述空白，本发明提供一种可抑制黄瓜绿斑驳花叶病毒积累的蛋白ClALKBH2B、基因、表达载体、转化体及应用。

本发明的技术方案如下：

一种可抑制CGMMV积累的蛋白ClALKBH2B，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

一种可抑制CGMMV积累的基因ClALKBH2B，其特征在于，所述基因ClALKBH2B的编码序列如SEQ ID NO.2所示。

所述基因ClALKBH2B的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

一种可抑制CGMMV积累的重组表达载体，其特征在于，为可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体；所述蛋白ClALKBH2B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体为装载有可抑制CGMMV积累的基因ClALKBH2B的基因序列的表达载体；

优选地，所述可抑制CGMMV积累的基因ClALKBH2B的基因序列选自：基因ClALKBH2B的编码序列，和/或，基因ClALKBH2B的DNA序列；

优选地，所述基因ClALKBH2B的编码序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述基因ClALKBH2B的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述表达载体为pFGC载体。

一种可抑制CGMMV积累的转化体，其特征在于，为含有可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体的宿主细胞；所述蛋白ClALKBH2B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述含有可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体的宿主细胞指，转化了可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体的宿主细胞；

优选地，所述基因ClALKBH2B的编码序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述基因ClALKBH2B的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述表达载体为pFGC载体；

优选地，所述宿主细胞为农杆菌；

优选地，所述农杆菌为农杆菌GV3101。

一种可抑制CGMMV积累的方法，其特征在于，在植物体内过表达蛋白ClALKBH2B；所述蛋白ClALKBH2B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在植物体内过表达蛋白ClALKBH2B指，将可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体注入植物体内，和/或，将含有可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体的宿主细胞转化至植物体内。

优选地，所述基因ClALKBH2B的编码序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述基因ClALKBH2B的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述表达载体为pFGC载体；

优选地，所述宿主细胞为农杆菌；

优选地，所述农杆菌为农杆菌GV3101；

优选地，所述植物选自：烟草、西瓜。

本发明从西瓜中鉴定到一个蛋白ClALKBH2B，该基因编码的蛋白属于一类ALKBH基因家族。荧光定量PCR结果表明西瓜ClALKBH2B基因的表达量能显著地被CGMMV侵染诱导表达。进一步在烟草中瞬时过量表达该基因后证实了过量ClALKBH2B基因能够提高烟草对CGMMV病毒侵染的抗性。本发明鉴定到的ClALKBH2B基因有利于分析研究西瓜响应CGMMV侵染的抗性机制，可用于西瓜抗病毒品种的培育。本发明对在病毒响应信号途径中发挥的生物学功能的西瓜ALKBH基因进行筛选和研究，并进行了西瓜ClALKBH2B基因的功能研究及应用，为进一步深入研究西瓜响应CGMMV病毒的防御机制，以及为西瓜抗病毒品种的培育提供重要的理论依据。本发明的蛋白ClALKBH2B是一个质膜定位的蛋白，ClALKBH2B过表达后第3天，能明显抑制CGMMV病毒的积累水平。

附图说明

图1为本发明实验例对ClALKBH2B基因序列的扩增产物电泳结果图。

图2为本发明实验例中西瓜ClALKBH2B基因对CGMMV病毒的响应模式。

图3为本发明实验例中利用在烟草中瞬时表达对ClALKBH2B蛋白进行亚细胞定位分析。

图4为本发明实验例中瞬时过量表达西瓜ClALKBH2B能够抑制CGMMV病毒在烟草中的积累。图A，为CGMMV单独注射(左)以及CGMMV+ClALKBH2B-pFGC混合注射(右)3天后叶片的表型；图B为CGMMV单独注射以及CGMMV+ClALKBH2B-pFGC混合注射3天后，利用qRT-PCR对CGMMV编码的运动蛋白(MP)和衣壳蛋白(CP)基因的表达水平进行检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不以此限制本发明的保护范围。

生物材料的来源和记载出处

‘JJZ’西瓜为申请人实验室保存的西瓜高代自交系，申请人承诺自本发明申请日起20年内向公众发放用于验证本发明的效果。

本氏烟草由本实验室保存，也可商购获得

农杆菌GV3101购自上海唯地生物有限公司。

第1组实施例、本发明的蛋白ClALKBH2B

本组实施例提供一种可抑制CGMMV积累的蛋白ClALKBH2B。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述蛋白ClALKBH2B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本领域技术人员可根据本发明的启示，利用蛋白ClALKBH2B对理论上任何可发生CGMMV积累的植物，包括但不限于：西瓜、甜瓜、瓠瓜、黄瓜，进行CGMMV积累的抑制。任何利用本发明的蛋白ClALKBH2B对任何植物进行抑制CGMMV积累的操作都落入本发明的保护范围。任何利用本发明的蛋白ClALKBH2B对任何植物进行增加CGMMV积累的操作也落入本发明的保护范围。

第2组实施例、本发明的基因ClALKBH2B

本组实施例提供一种可抑制CGMMV积累的基因ClALKBH2B。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述基因ClALKBH2B的编码序列如SEQ ID NO.2所示。

在一些实施例中，所述基因ClALKBH2B的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

本领域技术人员可根据本发明的启示，利用基因ClALKBH2B对理论上任何可发生CGMMV积累的植物，包括但不限于：西瓜、甜瓜、瓠瓜、黄瓜，进行CGMMV积累的抑制。任何利用本发明的基因ClALKBH2B对任何植物进行抑制CGMMV积累的操作，即过表达基因ClALKBH2B都落入本发明的保护范围。任何利用本发明的基因ClALKBH2B对任何植物进行增加CGMMV积累的操作，即沉默表达基因ClALKBH2B也落入本发明的保护范围。

第3组实施例、本发明的重组表达载体

本组实施例提供一种可抑制CGMMV积累的重组表达载体。本组所有实施例的共同特征在于，为可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体；所述蛋白ClALKBH2B的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

在一些实施例中，所述可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体为装载有可抑制CGMMV积累的基因ClALKBH2B的基因序列的表达载体；

优选地，所述基因ClALKBH2B的编码序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述基因ClALKBH2B的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述表达载体为pFGC载体。

第4组实施例、本发明的转化体

本组实施例提供一种可抑制CGMMV积累的转化体。本组所有实施例的共同特征在于，所述可抑制CGMMV积累的转化体为含有可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体的宿主细胞；所述蛋白ClALKBH2B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在具体的实施例中，所述含有可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体的宿主细胞指，转化了可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体的宿主细胞；

优选地，所述基因ClALKBH2B的编码序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述基因ClALKBH2B的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述表达载体为pFGC载体；

优选地，所述宿主细胞为农杆菌；

优选地，所述农杆菌为农杆菌GV3101。

第5组实施例、本发明抑制CGMMV积累的方法

本组实施例提供一种可抑制CGMMV积累的方法。本组所有实施例的共同特征在于，在植物体内过表达蛋白ClALKBH2B；所述蛋白ClALKBH2B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一些实施例中，在植物体内过表达蛋白ClALKBH2B指，将可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体注入植物体内，和/或，将含有可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体的宿主细胞转染至植物体内。

在具体的实施例中，所述可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体为装载有可抑制CGMMV积累的基因ClALKBH2B的基因序列的表达载体；

优选地，所述基因ClALKBH2B的编码序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述基因ClALKBH2B的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述表达载体为pFGC载体；

优选地，所述宿主细胞为农杆菌；

优选地，所述农杆菌为农杆菌GV3101；

优选地，所述植物选自：烟草、西瓜。

本领域技术人员可根据本发明的启示，利用本发明的蛋白ClALKBH2B或基因ClALKBH2B对理论上任何可发生CGMMV积累的植物，包括但不限于：西瓜、甜瓜、瓠瓜、黄瓜，进行CGMMV积累的抑制。任何利用本发明的蛋白ClALKBH2B或基因ClALKBH2B对任何植物进行抑制CGMMV积累的行为，即过表达蛋白ClALKBH2B或基因ClALKBH2B都落入本发明的保护范围。任何利用本发明的基因ClALKBH2B对任何植物进行增加CGMMV积累的行为，即沉默表达蛋白ClALKBH2B或基因ClALKBH2B也落入本发明的保护范围。例如，通过沉默表达蛋白ClALKBH2B或基因ClALKBH2B增加CGMMV积累使植株致病，构建模式病株，这样的行为也落入本发明的保护范围。

实验例、本发明的蛋白ClALKBH2B的克隆与验证

1.基因ClALKBH2B的克隆

将本研究室保存的西瓜高代自交系‘JJZ’种植在浙江省农业科学院基地的温室大棚，挑选生长至坐果期的西瓜，取其根、茎、叶片、当天开放的雄花和雌花、以及直径3cm左右的授粉的果实，迅速置于液氮中，然后放在-80℃冰箱至RNA提取。采用TAKALA公司的RNA提取试剂盒进行RNA的提取，具体步骤参考说明书(TAKALA,日本)。cDNA第一链的合成参照TAKALA公司的反转录试剂盒(SMART TM PCR cDNA Synthesis Kit)的说明书进行。将各个样品cDNA混合后作为模板，以引物ClALKBH2B-S：ATGGCGATTAGTCATCAG(SEQ ID NO.4)；ClALKBH2B-A:TTACTCTCTGCTCCTCCTATC(SEQ ID NO.5)；进行扩增。扩增体系50μL，其中buffer 25μL、dNTP 10μL、上下引物各1.5μL、模板2μL、ddH2O 9μL、KOD FX 1μL。扩增程序为98℃2min；98℃20s，60℃30s，68℃1min，共40个循环；68℃5min；10℃保温。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，将目的片段切下之后进行纯化，并进行测序验证。扩增产物的电泳结果图如图1所示。ClALKBH2B基因的编码序列如SEQ ID NO.2所示。

2.Pro35S::ClALKBH2B-pFGC载体的构建

采用特异性引物OEALKBH2B-S和OEALKBH2B-A扩增ClSAUR1的编码序列(CDS)：

OEALKBH2B-S:

AATTTGCAGGTATTTGGATCCATGGCGATTAGTCATCAG；(SEQ ID NO.6)

OEALKBH2B-A:

CTCTAGACTCACCTAGGATCCTTACTCTCTGCTCCTCCTATC(SEQ ID NO.7)。

PCR产生的扩增子利用同源重组的方法连接到利用BamH I酶切的PFGC载体中。随后，通过冻融法将pFGC-Pro35S::ClALKBH2B载体转化到农杆菌菌株GV3101中。

3.CGMMV侵染性克隆和ClALKBH2B瞬时过表达载体的接种将上述载体在LB培养基中摇菌(28℃,200rpm振荡培养)，将菌液摇至OD600＝0.8-1后，6000×g,10mins,弃上清，加入30ml烟草悬浮液(100ul 0.2M乙酰丁香酮，2ml 0.5M MES，1ml 1M MgCl₂，用ddH₂O定容至100ml)，摇匀，室温静置2h。然后将CGMMV侵染性克隆和pFGC-Pro35S::ClALKBH2B菌液等量混合后准备注射西瓜。准备3-4叶期的西瓜幼苗，在烟草幼苗的第一个真叶的左侧注射悬浮液作为对照，右侧注射各个转录因子的菌液，叶片先在叶片背面扎一个孔，再对准针孔注射，注入悬浮液，注射后将西瓜光照培养3天后，在叶片注射孔的位置，以针孔为中心取直径为为1cm²的叶片，液氮冷冻后在-80℃冰箱保存。将样品取出进行RNA提取并反转录成cDNA，以cDNA作为模板，通过qRT-PCR检测烟草在CGMMV的侵染后瞬时过表达ClALKBH2B对CP和MP基因表达量的影响，以明确其对CGMMV病毒积累水平的影响。

4.实时定量PCR反应

对获得的西瓜材料进行总RNA的提取，并合成一链cDNA。CGMMV编码的MP和CP基因的定量引物为：

qrtMP-S:TCCTTATCCGAGAAAGTTGA(SEQ ID NO.8)，

qrtMP-A:TTTAGAATGCCGCTTACCAC(SEQ ID NO.9)；

qrtCP-S:CAGACTCAAGCGGGAAGA(SEQ ID NO.10)，

qrtCP-A:AAGCGAAACGAAGATAGGC(SEQ ID NO.11)。

所有引物按照引物合成说明进行稀释。反应体系参照TAKARA公司SYBR Premix ExTaq试剂盒说明书，在CFX96 Real Time Systerm(Bio-rad,USA)仪器上进行反应。每次实验设置3次技术重复和3次生物学重复，数据处理按照2^-ΔΔCt方法进行处理和分析。CGMMV接种后1、4、12和24h后西瓜材料中ClALKBH2B的表达水平变化模式，ClALKBH2B定量引物为：qRTClALKBH2B-S:GAAGAAATTGCCAACCCTC(SEQ ID NO.12)；qRTClALKBH2B-A:ATTGTAACAGCACCC GAAC(SEQ ID NO.13)。

结果描述：

在接种CGMMV后1到48h后，利用qRT-PCR检测发现ClALKBH2B被诱导表达了6.37到44.15倍。

为了检测ClALKBH2B对CGMMV积累水平的影响，将CGMMV单独注射以及CGMMV+ClALKBH2B-PFGC混合注射叶片进行瞬时过量表达，接种3天后，利用qRT-PCR对CGMMV编码的MP和CP基因的表达水平进行检测，结果发现瞬时表达ClALKBH2B的叶片中CGMMV的运动蛋白编码基因MP的表达水平(0.355倍)明显低于单独接种CGMMV的叶片组织，而CGMMV衣壳蛋白编码基因CP的表达水平(0.219倍)，这些结果说明过量表达ClALKBH2B基因能够抑制CGMMV病毒的积累。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种可抑制CGMMV积累的蛋白ClALKBH2B、其基因、表达载体、转化体及方法

<130> P210060/NKY

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 528

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 蛋白ClALKBH2B

<400> 1

Met Ala Ile Ser His Gln His Leu Lys Leu Glu Asp Pro Phe Leu His

1 5 10 15

Asn Tyr Lys Pro Ser Glu Leu Arg Ile Ala Ser Glu Phe Leu Thr Thr

20 25 30

Trp Leu Pro Phe Leu Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp Cys Thr Lys Leu

35 40 45

Leu Ser Asn Arg Ile Arg Ala Leu Asp Pro Ala Leu His Ser Asp Asp

50 55 60

Asn Leu Ser Ser Ala Ser Pro Val Glu Asp Met His Gly Thr Asn Gly

65 70 75 80

Asn Gln Asp Asp Ala Asn Ser Leu Gly Ser Trp Lys Asp Glu Ala Glu

85 90 95

Thr Asn Ser Leu Gly Ser Trp Lys Asp Gly Ile Thr Glu Gly Asn Glu

100 105 110

Ala Asp Gly Val Pro Glu Ser Ser Ser Ser Glu Leu Ser Ser Lys Leu

115 120 125

Asn Ser Thr Lys Thr Ser Gly Pro Arg Met Ser Trp Ala Asp Met Thr

130 135 140

Gln Glu Asp Glu Leu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Tyr Glu Ser Glu Lys

145 150 155 160

Arg Leu Val Ser Val Asn Glu Ser Thr Arg Lys Leu Thr Ile Ser Lys

165 170 175

Val Ile Glu Lys Pro Gln Leu Ser Arg Glu Gln Arg Glu Tyr Ile Arg

180 185 190

Phe Met Asn Val Gly Arg Lys Lys Asp Phe Ile Cys Leu Glu Arg Phe

195 200 205

Lys Gly Lys Leu Val Asn Ile Leu Glu Gly Leu Glu Leu His Thr Gly

210 215 220

Ile Phe Ser Ala Ala Glu Gln Lys Arg Ile Val Asp His Val Tyr Ala

225 230 235 240

Leu Gln Glu Met Gly Lys Lys Gly Glu Leu Arg Val Leu Ala Glu Glu

245 250 255

Ile Ala Asn Pro Leu Glu Leu Ala Gly Trp Val Val Phe Val Ile Phe

260 265 270

Pro Cys Asn Pro Ala Pro Arg Lys Arg Thr Phe Ser Ala Pro Lys Lys

275 280 285

Trp Met Lys Gly Lys Gly Arg Val Thr Met Gln Phe Gly Cys Cys Tyr

290 295 300

Asn Tyr Ala Pro Asp Lys Asn Gly Asn Pro Pro Gly Ile Leu Arg Ser

305 310 315 320

Glu Ile Val Asp Pro Ile Pro Ser Leu Phe Lys Val Ile Ile Arg Arg

325 330 335

Leu Val Arg Trp His Val Leu Pro Pro Thr Cys Val Pro Asp Ser Cys

340 345 350

Ile Val Asn Ile Tyr Asp Glu Gly Asp Cys Ile Pro Pro His Ile Asp

355 360 365

Asn His Asp Phe Val Arg Pro Phe Cys Thr Val Ser Phe Leu Ser Glu

370 375 380

Cys Asn Ile Val Phe Gly Thr Asn Leu Ser Ile Val Gly Pro Gly Glu

385 390 395 400

Phe Ser Gly Pro Ile Ala Ile Pro Leu Pro Val Gly Ser Val Leu Val

405 410 415

Leu Asn Gly Asn Gly Ala Asp Val Ala Lys His Cys Val Pro Ala Val

420 425 430

Pro Thr Lys Arg Ile Ser Ile Thr Phe Arg Arg Ile Asp Glu Pro Lys

435 440 445

Arg Pro Ile Glu Tyr Ala Pro Glu Pro Asp Leu Gln Gly Leu Gln Pro

450 455 460

Leu Pro Tyr Glu Ala Ser Glu Asn Asp Val Pro Thr Ser Pro Val Ser

465 470 475 480

Ser Glu Arg Glu Ile Arg Arg Gln Pro Phe Arg Arg Gly Ser His Ile

485 490 495

Arg Thr Arg Gly Ser Gly Asn Arg Ser Asp Thr Arg Phe Asp Gln Arg

500 505 510

Asn Pro Gly Arg Ala Arg His Asn Ser Ala Asp Arg Arg Ser Arg Glu

515 520 525

<210> 2

<211> 1587

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 基因ClALKBH2B的编码序列

<400> 2

atggcgatta gtcatcagca tctcaaactg gaagaccctt ttcttcataa ttacaagcct 60

tcagagctac ggatcgcttc tgagtttctc accacttggc ttccgtttct ttcgagagat 120

ctctgccaag actgcaccaa attgctctcg aatcgtatcc gcgccctcga tccagctctc 180

cattccgacg ataatttaag ttctgcatca ccagtggaag acatgcatgg gactaatggg 240

aatcaggatg atgcaaattc tctgggaagt tggaaagatg aagcggaaac aaattcatta 300

ggcagttgga aggacggcat aacggaaggg aatgaagctg atggagtacc tgaatcttct 360

tctagtgaac tgtcctctaa attaaattcc accaagacct cggggcctcg tatgtcgtgg 420

gctgatatga ctcaggaaga tgaactagaa gaagaggaag atgagtacga atcagaaaaa 480

agattagtca gtgttaatga gtccacaagg aaattaacaa tatcgaaggt tattgagaag 540

ccacagctgt ctagagagca gagagagtac atcaggttca tgaatgttgg acggaagaag 600

gattttattt gtctggaaag gtttaaaggg aaattagtaa atattcttga aggactcgag 660

cttcatacag gtatttttag tgctgcagaa cagaagagaa tagttgatca tgtttatgca 720

cttcaggaga tgggcaagaa gggagaatta agagttcttg cggaagaaat tgccaaccct 780

ctagaattgg ctggctgggt ggtttttgtt attttccctt gtaatcctgc tcccagaaaa 840

cgaacatttt cagctcccaa aaagtggatg aagggaaagg ggcgtgtaac catgcagttc 900

gggtgctgtt acaattatgc acctgataaa aatggcaatc cccctggaat tcttcgaagt 960

gaaattgtgg atccaatacc gtctctcttt aaggtgatca ttagaaggtt ggtgaggtgg 1020

catgtacttc ctccaacatg tgttcctgat agttgcattg tgaacatcta tgatgaaggg 1080

gactgtattc ctcctcatat tgacaaccac gattttgttc gacctttttg cactgtgtca 1140

tttctcagtg aatgcaatat tgtttttgga acaaaccttt ctattgtagg accaggtgaa 1200

ttttctgggc caattgcaat ccctctgcct gtggggtcag ttcttgtgtt aaatggaaat 1260

ggagctgatg ttgctaagca ttgtgtacct gcagtcccta caaagaggat atcgattaca 1320

tttagaagaa tagatgagcc caaaaggcca attgagtatg ctccagaacc tgatttgcag 1380

ggactccaac cattgcccta tgaagcaagt gaaaatgatg taccaacttc tcctgtatca 1440

tcagaaaggg aaataaggag gcagccattt aggaggggta gtcatattag aaccagggga 1500

tctggaaaca gaagcgacac tcgatttgat caacgcaatc caggtagagc tcgacataat 1560

tcagcagata ggaggagcag agagtaa 1587

<210> 3

<211> 3875

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 基因ClALKBH2B的DNA序列

<400> 3

atggcgatta gtcatcagca tctcaaactg gaagaccctt ttcttcataa ttacaagcct 60

tcagagctac ggatcgcttc tgagtttctc accacttggc ttccgtttct ttcgagagat 120

ctctgccaag actgcaccaa attgctctca atcgtatccg cgccctcgat ccaggtattc 180

ttttgtttat ttttattcgt tattgataaa ttattgcacg aggggcgttg gagtaattaa 240

cccatctata ttttagattc tttaaaagaa ttgagtgtat gaagggaaaa tttttaaaat 300

ttttgaggag ttcgggaatg gatttttatt aaagtagagt tcttaagttt cttgatgtgt 360

tgtgttgcta aaaagactga ggcgtctggt gtgtttgata atttacatga tctgttcctt 420

tggttcgcaa gatctcgatg cttccctgtt aaatcattag ttttatctaa tggaattgtt 480

gaacttgaca atgttgtagc tctccattcc gacgataatt taagttctgc atcaccagtg 540

gaagacatgc atgggactaa tgggaatcag gatgatgcaa attctctggg aagttggaaa 600

gatgaagcgg aaacaaattc attaggcagt tggaaggacg gcataacgga agggaatgaa 660

gctgatggag tacctgaatc ttcttctagt gaactgtcct ctaaattaaa ttccaccaag 720

acctcggggc ctcgtatgtc gtgggctgat atgactcagg aagatgaact agaagaagag 780

gaagatgagt acgaatcaga aaaaagatta gtcagtgtta atgagtccac aaggaaatta 840

acaatatcga aggttattga gaagccacag ctgtctagag agcagagaga gtacatcagg 900

ttcatgaatg ttggacggaa gaaggatttt atttgtctgg aaaggtttaa agggaaatta 960

gtaaatattc ttgaaggact cgagcttcat acaggtattt ttagtgctgc agaacagaag 1020

agaatagttg atcatgttta tgcacttcag gagatgggca agaagggaga attaagaggt 1080

aatcattcct gtttgcatct tgatttcctt ttatcttcta ctgaatgctg acattgtagt 1140

tcatggtaac atagcgaccc atcccattcc tgattagttt ttctcttagt atgttatgtc 1200

tgatgtaccc ggggcctggg ctcatctaat attttgcatc agtataagta cattatagta 1260

tctataaagc tgttagccag tggcaagtac aacataggga cccgtcctat ttccatttag 1320

tcttttttgt agaagactgt aaggtaataa gctaatatca tgttagataa aacaaagggt 1380

tccaacatct tatagtcttg gctctaaatg ctaatgctac tctctaatta accacaccac 1440

agattggctc agtccaatat aaaatacttt atttataaac tattgggggt ttaagtttgt 1500

accattgacc tctggtttca attcccgcac ctcacatgtt gtaaaagaaa actattgggg 1560

gtttgttttg agctagtacc tctcttggat ttatatcttt aaatccattc atttgtcttg 1620

gttgttaacc ttctttaggg tgctggatcc ttttgctacc aatatgacaa gttttttgac 1680

attttgggga aaactactga gaattgtgag gataactaac cggttgctgc ttttagtttt 1740

gttcagtgga attagaatga ctctgttagg cctccaatta ctaaaattta taggaggggt 1800

aagttgggta aatcacctca gacaggggag gagtaggaag cgtttgttag ttgactactg 1860

tcagggtttt ttttcttttt tttttttttt tttttttggg gggggggggg tttgttgagc 1920

aaggtagtga atattctgta tttttgccaa tacaattgta gttcttgcgg aagaaattgc 1980

caaccctcta gaattggctg gctgggtggt ttttgttatt ttcccttgta atcctgctcc 2040

cagaagttag taatacaata caatatagta aggaggtaac cttacaaatt cttcctaccg 2100

aattaagaag caaatttgaa cacataggca ttttctctgc cctctttggt tgattgtatg 2160

tcaaattcac agtctttatt gtttatggtg cacattgtct tgaaaaattt aatctgtgca 2220

tggatgtggt ccaaaaagag caatattagt taaatgataa aaaaaattgt caaatagggt 2280

gctaatggct atatccttga agctgtgatg gtttccctcg agcaaaagaa agactttgat 2340

gaagcaattc caatggactt acttttcctt gctaaaaggg tgtccaccga ggatcccttg 2400

aagtaaagta attagcttcc ccattagagc taggtgccaa ttaaatgcca ataggatatg 2460

atttcaaaat aaagcagcat aaggacaagt aatgaagaaa tgcagcaaga attcattgtc 2520

cttttgacaa aggacaccag tttggtgagg aagcaattca gggtcttttt tttttaaccc 2580

cttcacaaac gagagtgtat tgctgtatgt ttgtgtgatg tcgaggatgt gattatttga 2640

gtaagggatt ttgatgtgaa gggtccaatt ttaatccaat ggccatctcc aacctttttt 2700

cccccttttg attgaaaaca tgatgatgac ttgaatgcaa cgccacattc accattttaa 2760

ttttttttct ttttgcagaa cgaacatttt cagctcccaa aaagtggatg aagggaaagg 2820

ggcgtgtaac catgcagttc gggtgctgtt acaattatgc acctgtgagt ctatctgtag 2880

ttggtgtggt tcttttgaat tgcatttaat ttttcatttt tgaggatcaa ccagttgtga 2940

tgctagtatc cttaattaga gtatcatttt taatgaaggg taaatcattc taatgacagg 3000

ataaaaatgg caatccccct ggaattcttc gaagtgaaat tgtggatcca ataccgtctc 3060

tctttaaggt gatcattaga aggttggtga ggtggcatgt acttcctcca acatgtgttc 3120

ctgatagttg cattgtgaac atctatgatg aaggggactg tattcctcct catattgaca 3180

accacgattt tgttcgacct ttttgcactg tgtcatttct cagtgaatgc aatattgttt 3240

ttggaacaaa cctttctatt gtaggaccag gtgaattttc tgggccaatt gcaatccctc 3300

tgcctgtggg gtacgtgtat aacatgcagt ctgctatgtt tactttcatg gttaattacc 3360

cgtttccatc tgcaggtcgt caattgcatt attttcaatc ttactgttat tcatgttctc 3420

gcaggtcagt tcttgtgtta aatggaaatg gagctgatgt tgctaagcat tgtgtacctg 3480

cagtccctac aaagaggtat aattcaggaa ggtcttttgt ttatgattct atttagccac 3540

gatctttgct tgctagttat ccaagctaac ttgcctcctt tctggtctat tttaggatat 3600

cgattacatt tagaagaata gatgagccca aaaggccaat tgagtatgct ccagaacctg 3660

atttgcaggg actccaacca ttgccctatg aagcaagtga aaatgatgta ccaacttctc 3720

ctgtatcatc agaaagggaa ataaggaggc agccatttag gaggggtagt catattagaa 3780

ccaggggatc tggaaacaga agcgacactc gatttgatca acgcaatcca ggtagagctc 3840

gacataattc agcagatagg aggagcagag agtaa 3875

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ClALKBH2B-S

<400> 4

atggcgatta gtcatcag 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ClALKBH2B-A

<400> 5

ttactctctg ctcctcctat c 21

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物OEALKBH2B-S

<400> 6

aatttgcagg tatttggatc catggcgatt agtcatcag 39

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物OEALKBH2B-A

<400> 7

ctctagactc acctaggatc cttactctct gctcctccta tc 42

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物qrtMP-S

<400> 8

tccttatccg agaaagttga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物qrtMP-A

<400> 9

tttagaatgc cgcttaccac 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物qrtCP-S

<400> 10

cagactcaag cgggaaga 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物qrtCP-A

<400> 11

aagcgaaacg aagataggc 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物qRTClALKBH2B-S

<400> 12

gaagaaattg ccaaccctc 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物qRTClALKBH2B-A

<400> 13

attgtaacag cacccgaac 19

Claims

1.一种可抑制CGMMV积累的蛋白ClALKBH2B，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种可抑制CGMMV积累的基因ClALKBH2B，其特征在于，所述基因ClALKBH2B的编码序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的一种可抑制CGMMV积累的基因ClALKBH2B，其特征在于，所述基因ClALKBH2B的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种可抑制CGMMV积累的重组表达载体，其特征在于，为可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体；所述蛋白ClALKBH2B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的一种可抑制CGMMV积累的重组表达载体，其特征在于，所述可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体为装载有可抑制CGMMV积累的基因ClALKBH2B的基因序列的表达载体；

优选地，所述基因ClALKBH2B的编码序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述基因ClALKBH2B的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述表达载体为pFGC载体。

6.一种可抑制CGMMV积累的转化体，其特征在于，为含有可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体的宿主细胞；所述蛋白ClALKBH2B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求6所述的一种可抑制CGMMV积累的转化体，其特征在于，

优选地，所述基因ClALKBH2B的编码序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述基因ClALKBH2B的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述表达载体为pFGC载体；

优选地，所述宿主细胞为农杆菌；

优选地，所述农杆菌为农杆菌GV3101。

8.一种可抑制CGMMV积累的方法，其特征在于，在植物体内过表达蛋白ClALKBH2B；所述蛋白ClALKBH2B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

9.根据权利要求8所述的一种可抑制CGMMV积累的方法，其特征在于，在植物体内过表达蛋白ClALKBH2B指，将可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体注入植物体内，和/或，将含有可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体的宿主细胞转化至植物体内。

10.根据权利要求9所述的一种可抑制CGMMV积累的方法，其特征在于，所述可表达蛋白ClALKBH2B的表达载体为装载有可抑制CGMMV积累的基因ClALKBH2B的基因序列的表达载体；

优选地，所述基因ClALKBH2B的编码序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述基因ClALKBH2B的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述表达载体为pFGC载体；

优选地，所述宿主细胞为农杆菌；

优选地，所述农杆菌为农杆菌GV3101；

优选地，所述植物选自：烟草、西瓜。