CN112920141B - 一类大黄酸衍生物及其抗病毒用途 - Google Patents

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Abstract

本发明一类大黄酸衍生物及其抗病毒用途，属于新药开发技术，其具有通式(I)或式(II)所示的结构，实验数据显示具有更好的抗病毒药物活性。

Description

一类大黄酸衍生物及其抗病毒用途
交叉引用
本发明要求2019年12月05日提交的申请号为201911232603.3的中国发明申请，2020 年1月10日提交的申请号为202010025146.7的中国发明申请为优先权，其全部内容以引用方式视为并入本发明。
技术领域
本发明涉及新药开发技术，具体地涉及一类大黄酸衍生化合物及其抗病毒用途。
背景技术
病毒疾病是严重威胁人类健康的最常见感染性疾病，具有高传染和高变异的特点。现有抗病毒药物的多是病毒酶抑制剂，具有作用靶点明确、特异性高、疗效强等优点。然而，耐药性病毒的发现以及新病毒变种的不断出现，已成为病毒病预防与治疗的一大挑战。例如，流感病毒在历史上曾造成多次大流行，共造成数千万人的死亡，目前全球每年仍有几十万人死于流感病毒感染。当前，抗流感病毒效果最好的一类药物是神经氨酸酶(NA)抑制剂(如奥司他韦、扎那米韦等)，是WHO推荐的流感预防和治疗流感病毒治疗的首选药物。但是随着NA抑制剂的广泛使用，已经出现了耐药株。2008-2009年的季节性H1N1流感对大部分的NA抑制剂耐药。在欧洲的一些国家，奥司他韦耐药株的发生率在逐年增加。因此，包括抗流感病毒药物在内的新型抗病毒抗病毒药物的研发迫在眉睫。
大黄酸(4，5-dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic acid)主要分布于蓼科植物中，是掌叶大黄、唐古特大黄、何首乌、虎杖等多种传统中药分离提纯的主要有效成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗阿尔兹海默病等多种药理活性，受到了广大研究者的关注，但是在抗病毒应用方面有待进一步开发。
发明内容
本发明的主要目的在于，提供更多具有更好的抗病毒活性的候选药物。发明人基于大黄酸的多羟基蒽醌进行结构改造，基于改造结果选出并验证了一系列大黄酸衍生物对多种病毒具有更好的抑制活性，且药学性质有了更好的改善。本发明设计和验证的化合物，迄今为止未见有国内外相关文献或技术的用于抗病毒作用的报道。
基于上述成果，本发明请求保护的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种化合物，其具有通式(I)或式(II)：
Figure BDA0002821970850000011
Figure BDA0002821970850000021
其中
R1为氢、取代或未取代的C1-C4烷基、芳基、C1-C4酰基、CONH-C1-C4烷基、CON- 二C1-C4烷基或-C5-C7环烷基、COO-C1-C4烷基；
R2为H或羟甲基、卤代甲基、亚甲基-NH2、亚甲基-NH-C1-C4烷基或C5-C7环烷基、亚甲基-N-二C1-C4烷基、亚甲基-饱和杂环、羧基、酰胺基、氰基、醛基、-CONHOH、 -C(O)-O-C1-6烷基、CO-NH-C1-6烷基；
R3为H或O-R1；
X为氮、氧或硫原子；
M为＝0或者二H、C1-C4烷基；
R4、R5同时或者单独为H、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C5-C7环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的饱和杂环、取代或未取代的芳香杂环；或者对于通式I化合物或X为氮原子的通式II化合物，R4、R5与它们所键合的氮原子一起形成取代或未取代的C3-C8饱和杂环基、取代或未取代的芳香杂环；其中，当X为氧或硫原子时， R5不存在。
优选地，对于通式I化合物或X为氮原子的通式II化合物，R4和R5与N原子形成以下结构：
Figure BDA0002821970850000022
其中Y为碳或氮原子；
R6、R7独立地为氢、烷基、芳基、杂环基、卤素、苄基、氨基、羟基、烷氧基、烷氨基、氰基、羧基、苯氧基、苯硫基、三氟甲氧基、硝基或三氟甲基；优选地，R6、R7独立地为甲基、乙级、异丙基、氟、氯。
优选地，所述的化合物，其特征在于：C1-C4烷基是指主链上具有1至4个碳原子的直链或支链烷基；优选为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或已基；进一步优选为甲基、乙基、丙基或异丁基。
优选地，所述的化合物，其特征在于：所述芳基是指不含杂原子的芳香族环基；优选是碳原子数为6～14个的芳基；进一步优选为碳原子数为6～10个的芳基，如苯基、萘基、联苯基；所述取代的芳基是指4-甲基苯基、4-氟苯基、4-三氟甲基苯基。
优选地，所述的化合物，其特征在于：所述饱和杂环是指具有至少一个选自N、O和S中的杂原子的5-6元饱和环烷。
优选地，所述的化合物，其特征在于：所述芳香杂环是指在环上具有至少一个选自N、 O和S中的杂原子的芳香族环基，非限制性地选自呋喃基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、咪唑基、吡唑基或吡啶基；优选选自吡啶基和喹啉基。
优选地，所述的化合物，其特征在于：所述取代是指但不限于，由卤素，烷氧基，羟基，烷基，氨基，烷基氨基，氨基烷基，烯基或苯基取代。
优选地，所述的化合物，其特征在于：所述取代的苯环是指，但不限于由取代基：烷基，烷氧基，羟基，氨基，苯氧基，苯硫基或卤素单取代的苯环，或由所述取代基在临位或间位双取代的苯环。
优选地，所述的化合物，其由下表编号001-034所代表的任一结构式所表示：
Figure BDA0002821970850000031
Figure BDA0002821970850000041
Figure BDA0002821970850000051
Figure BDA0002821970850000061
Figure BDA0002821970850000071
本发明的第二方面，提供上述通式I所示化合物的合成方法，其特征在于：当R3是非氢基团时，是以大黄素为原料；
(a)经过三氧化铬氧化后，6-甲基被氧化为羧基，得化合物A，
(b)在催化条件下，3位羧基与胺基化合物缩合反应得化合物B，
(c)在Na2S2O4存在条件下，甲醛与化合物B发生反应，在7位发生Marschalk反应，得到化合物C，
(d)羟甲基经过进一步取代反应，得到化合物D，
(e)酚羟基经进一步取代，得通式I化合物；
Figure BDA0002821970850000072
其中
R1为氢、取代或未取代的C1-C4烷基，或C1-C4酰基；
R2为H或羟甲基、卤代甲基、亚甲基-NH2、亚甲基-NH-C1-C4烷基或C5-C7环烷基、亚甲基-N-二C1-C4烷基、亚甲基-饱和杂环、羧基、酰胺基、氰基、醛基、-CONHOH、 -C(O)-O-C1-6烷基、CO-NH-C1-6烷基；
R3为H或O-R1；
X为氮、氧或硫原子；
R4、R5同时或者单独为H、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C5-C7环烷基、取代或未取代的苯环、取代或未取代的饱和杂环、取代或未取代的芳香杂环，或者R4、R5与它们所键合的氮原子一起形成取代或未取代的C3-C8饱和杂环基、取代或未取代的芳香杂环；其中，当X为氧或硫原子时，R5不存在。
本发明的第三方面，提供另一种上述通式I所示化合物的合成方法，其特征在于：当 R3为氢时，是以大黄酸为原料，经过以下步骤得到目标产物
(b)在催化条件下，3位羧基与胺基化合物缩合反应得化合物B，
(c)在Na2S2O4存在条件下，甲醛与化合物B发生反应，在7位发生Marschalk反应，得到化合物C，
(d)羟甲基经过进一步取代反应，得到化合物D，
(e)酚羟基经进一步取代，得到通式I化合物，
Figure BDA0002821970850000081
其中
R1为氢、取代或未取代的C1-C4烷基，或C1-C4酰基；
R2为H或羟甲基、卤代甲基、亚甲基-NH2、亚甲基-NH-C1-C4烷基或C5-C7环烷基、亚甲基-N-二C1-C4烷基、亚甲基-饱和杂环、羧基、酰胺基、氰基、醛基、-CONHOH、 -C(0)-O-C1-6烷基、CO-NH-C1-6烷基；
X为氮、氧或硫原子；
R4、R5同时或者单独为H、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C5-C7环烷基、取代或未取代的苯环、取代或未取代的饱和杂环、取代或未取代的芳香杂环，或者 R4、R5与它们所键合的氮原子一起形成取代或未取代的C3-C8饱和杂环基、取代或未取代的芳香杂环；其中，当X为氧或硫原子时，R5不存在。
本发明的第四方面，提供上述通式II所示化合物的合成方法，其中R3为非氢基团，且M为羰基时，是以大黄素为原料，步骤如下：
(f)以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂与二氯亚砜反应即得中间体E；
(g)在碱作用下与带氨基或羟基、巯基的化合物发生亲核取代反应得中间体F，
(c)在Na2S2O4存在条件下，甲醛与化合物F发生反应，在7位发生Marschalk反应，得到化合物G，
(d)羟甲基经过进一步取代反应，得到化合物H，
(e)酚羟基经进一步取代，得到通式II化合物；
合成路线如下：
Figure BDA0002821970850000091
本发明的第五方面，提供另一种上述通式II所示化合物的合成方法，当R3为氢且M为羰基时，是以芦荟大黄素为原料：
(f)以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂与二氯亚砜反应即得中间体E，
(g)在碱作用下与带氨基或羟基、巯基化合物发生亲核取代反应得中间体F，
(c)在Na2S2O4存在条件下，甲醛与化合物F发生反应，在7位发生Marschalk反应，得到化合物G，
(d)羟甲基经过进一步取代反应，得到化合物H，
(e)酚羟基经进一步取代，得到通式II化合物；
合成路线如下：
Figure BDA0002821970850000092
本发明的第六方面，提供再一种上通式II所示化合物的合成方法，当R3为氢，且M为二H、C1-C4烷基时，是以芦荟苷为原料：
包括以下合成步骤
(h)以水为溶剂与苯肼发生水解反应得中间体I，
(i)与碘化烷在丙酮溶剂中发生取代反应得中间体J，
(j)在碱作用下与氯化亚砜发生取代反应中间体K，
(g)在碱作用下与带氨基或羟基、巯基化合物发生亲核取代反应得中间体F，
(c)在Na2S2O4存在条件下，甲醛与化合物F发生反应，在7位发生Marschalk反应，得到化合物G，
(d)羟甲基经过进一步取代反应，得到化合物H，
(e)酚羟基经进一步取代，得到通式II化合物；
合成路线如下：
Figure BDA0002821970850000101
本发明的第七方面，提供上述任一所述化合物在制备抗病毒药物中的应用。
本发明的第八方面，提供一种药物组合物，该药物组合物中含有治疗有效量的所述具有通式II的化合物或其盐，并含有一种或多种药学上可接受的药物辅剂。
优选地，所述的药物组合物，所述盐是指所述化合物与酸发生成盐反应的产物，包括无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐或硫酸盐等；有机酸盐，如乙酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐或对甲苯甲酸盐；或
所述化合物与碱反应形成的碱加成盐，例如钠、钾、钙、铝、锌、镁和其它金属盐以及胆碱，二乙醇胺、乙醇胺、乙二胺、葡甲胺和其它众所周知的碱加成盐。
优选地，所述的药物组合物，其中的活性成分为通式I所示的化合物或其药用盐；所述活性成分的重量含量为0.1％-99.5％，优选的重量含量为0.5％-99.5％。
本发明的第九方面，提供一种药物组合物，该药物组合物中含有治疗有效量的所述具有通式I的化合物或其盐，并含有一种或多种药学上可接受的药物辅剂。
优选地，所述的药物组合物，所述盐是指所述化合物与酸发生成盐反应的产物，包括无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐或硫酸盐等；有机酸盐，如乙酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐或对甲苯甲酸盐；或
所述化合物与碱反应形成的碱加成盐，例如钠、钾、钙、铝、锌、镁和其它金属盐以及胆碱，二乙醇胺、乙醇胺、乙二胺、葡甲胺和其它众所周知的碱加成盐。
优选地，所述的药物组合物，其中的活性成分为通式I所示的化合物或其药用盐；所述活性成分的重量含量为0.1％-99.5％，优选的重量含量为0.5％-99.5％。
优选地，前述任一药物组合物在制备抗病毒药物中的应用，所述病毒指小RNA病毒、嗜肝DNA病毒(如乙型肝炎病毒、鸭乙型肝炎病毒)、疱疹病毒、痘病毒、人乳头瘤病毒、副黏病毒、黄病毒、逆转录病毒(如人艾滋病病毒)、冠状病毒、甲病毒、弹状病毒、沙粒病毒、戊型肝炎病毒、星状病毒、环状病毒、细小病毒、腺病毒、多瘤病毒等病毒；优选的，所述病毒是指甲型流感病毒、人手足口病病毒、艾滋病病毒及乙肝病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒。
发明人在前期的研究中发现并证实大黄酸、大黄素、芦荟大黄素等天然产物具有良好的抗病毒活性，尤其对于流感病毒有很好的抑制活性，并且认为可能具有全新的作用靶点。
本发明研究人员基于大黄酸的多羟基蒽醌进行结构改造，基于这种特征结构合成和研究了大量大黄酸类衍生物，发现并验证其中通式(I)和式(II)代表的大黄酸衍生物对多种病毒具有更好的抑制活性，且药学性质有了更好的改善。为抗病毒提供了更多候选药物。
附图说明
图1.示出了WB检测化合物对流感病毒的抑制效果，其中，MocK为阴性对照，Ost为奥司他韦，Inc003指代双醋瑞因；
图2.示出了化合物对流感病毒半数抑制浓度检测结果，其中纵坐标表示病毒抑制率，横坐标表示病毒摩尔浓度的对数值。
图3.示出了本发明化合物的细胞毒性检测结果；
图4.示出了本发明化合物对乙肝病毒S蛋白的抑制效果，其中是以450nm吸光值减630nm 吸光值为纵坐标作图。
图5.化合物对人免疫缺陷病毒(HIV-1)的抑制效果细胞水平药效学检测，其中纵坐标表示荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值。
具体实施方式
以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例并非用于限制本发明的保护范围。
制备实施例
实施例1(化合物1)1，8-二羟基-3-(哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
Figure BDA0002821970850000111
大黄酸(200mg，0.70mmol)，三乙胺(142mg，1.4mmol)和无水哌嗪(60mg，0.70mmol)加入到N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中，室温搅拌下加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)(266mg，0.7mmol)，室温反应1小时。用水淬灭反应，然后用乙酸乙酯萃取3到5次，合并有机相，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，柱层析(洗脱剂：50％-100％乙酸乙酯：石油醚)分离得产物(180 mg，73％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.89(s，2H)，7.85(t，J＝8.0Hz，1H)，7.73-7.67 (m，2H)，7.43-7.41(m，2H)，3.67-3.19(m，8H).
实施例2(化合物2)1，8-二羟基-3-(4-甲基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
Figure BDA0002821970850000112
合成方法如实施例1，将“无水哌嗪”替换为“N-甲基哌嗪”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.91(s，2H)，7.86(t，J＝8.0Hz，1H)，7.75-7.72 (m，2H)，7.46-7.41(m，2H)，3.63-3.17(m，8H)，2.72(s，3H).
实施例3(化合物3)1，8-二羟基-3-(4-乙基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
Figure BDA0002821970850000121
合成方法如实施例1，将“无水哌嗪”替换为“N-乙基哌嗪”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.03(s，1H)，11.92(s，1H)，7.86(t，J＝8.0Hz， 1H)，7.78-7.71(m，2H)，7.50-7.41(m，2H)，4.58(m，2H)，3.70-3.17(m，8H)，1.26 (t，J＝8.0Hz，3H).
实施例4(化合物4)1，8-二羟基-3-(3-甲基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
Figure BDA0002821970850000122
大黄酸(200mg，0.70mmol)，三乙胺(142mg，1.4mmol)和1-Boc-2-甲基哌嗪(140mg，0.70mmol)加入到N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中，室温搅拌下加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)(266mg，0.7mmol)，室温反应1小时。用水淬灭反应，然后用乙酸乙酯萃取3到5次，合并有机相，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，柱层析(洗脱剂：50％-100％乙酸乙酯：石油醚)分离得产物220mg(产率67％)。
将上一步的到固体(220mg，0.49mmol)溶于甲醇(5mL)，加入浓盐酸(5mL)，室温反应2小时，除去甲醇，用氢氧化钠(1M)中和，大量固体析出，抽滤得粗产品淡红色固体。
粗产品用乙酸乙酯结晶，得淡红色固体(150mg，83％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.92(s，2H)，7.85(t，J＝8.0Hz，1H)，7.78-7.72 (m，2H)，7.47-7.41(m，2H)，4.46(s，1H)，3.68-3.15(m，6H)，1.41(m，3H).
实施例5(化合物5)1，8-二羟基-3-(2-甲基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
Figure BDA0002821970850000123
合成方法如实施例4，将“1-Boc-2-甲基哌嗪”替换为“1-Boc-3-甲基哌嗪”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.87(s，2H)，7.85(t，J＝8.0Hz，1H)，7.73-7.62 (m，2H)，7.36-7.31(m，2H)，5.12(s，1H)，3.62-3.12(m，6H)，1.66(m，3H).
实施例6(化合物6)1，8-二羟基-3-(4-苄基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
Figure BDA0002821970850000131
合成方法如实施例1，将“无水哌嗪”替换为“1-苄基哌嗪”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.02(s，1H)，11.91(s，1H)，7.84(t，J＝8.0Hz， 1H)，7.77-7.68(m，2H)，7.67-7.58(m，2H)，7.51-7.39(m，5H)，4.34(s，2H)， 3.76-3.10(m，8H).
实施例7(化合物7)1，8-二羟基-3-(4-苯基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
Figure BDA0002821970850000132
合成方法如实施例1，将“无水哌嗪”替换为“1-苯基哌嗪”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.99(s，2H)，7.85(t，J＝8.0Hz，1H)，7.76(m，1H)，7.68(m，1H)，7.46-7.41(m，2H)，7.28-7.20(m，2H)，7.00-6.93(m，2H)， 6.85-6.79(m，1H)，3.80-3.11(m，8H).
实施例8(化合物8)4，5-羟基-9，10-二氧代-N-(2-二甲基胺-乙基)-9，10-二羟蒽-2-甲酰胺的制备
Figure BDA0002821970850000133
合成方法如实施例1，将“无水哌嗪”替换为“N，N-二甲基乙二胺”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.89(s，2H)，8.85(t，J＝4.0Hz，1H)，8.12(s， 1H)，7.90-7.61(m，2H)，7.42(m，1H)，3.50-3.17(m，4H)，2.25(s，6H).
实施例9(化合物9)1，8-二羟基-3-(吡咯烷-1-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
Figure BDA0002821970850000134
合成方法如实施例1，将“无水哌嗪”替换为“吡咯烷”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.95(s，2H)，7.85(t，J＝8.0Hz，1H)，7.75(m，2H)，7.50-7.39(m，2H)，3.50(t，J＝8.0Hz，2H)，3.39(t，J＝8.0Hz，2H)，1.86-1.78 (m，4H).
实施例10(化合物10)1，8-二羟基-3-(4-(N，N-二甲基)哌啶-1-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
Figure BDA0002821970850000141
合成方法如实施例1，将“无水哌嗪”替换为“4-二甲氨基哌啶”。
1wNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.66(s，2H)，7.85(t，J＝8.0Hz，1H)，7.76-7.63 (m，2H)，7.45-7.39(m，2H)，4.60(m，1H)，3.70-3.00(m，8H)2.69(s，6H).
实施例11(化合物10)1，8-二羟基-3-(吗啉-4-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
Figure BDA0002821970850000142
合成方法如实施例1，将“无水哌嗪”替换为“吗啉”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.95(s，1H)，7.85(t，J＝8.0Hz，1H)，7.74(m， 1H)，7.65(d，J＝4.0Hz，1H)，7.44-7.39(m，2H)，3.77-3.34(m，8H).
实施例12(化合物12)4，5-二羟基-9，10-二氧代-N-(吡啶-4-基)-9，10-二羟蒽-2-甲酰胺的制备
Figure BDA0002821970850000143
合成方法如实施例1，将“无水哌嗪”替换为“4-氨基吡啶”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.88(d，2H)，8.66(d，J＝8.0Hz，2H)，8.22(m， 1H)，8.11(d，J＝4.0Hz，2H)，7.97(m，1H)，7.89-7.71(m，2H)，7.42(d，J＝8.0Hz， 1H).
实施例13(化合物13)9，10-二氧代-3-(喹啉-4-基)氨基甲酰基)-9，10-二氢化蒽-1，8- 二乙酸酯的制备
Figure BDA0002821970850000151
将双醋瑞因(200mg，0.54mmol)，三乙胺(110mg，1.09mmol)和4-氨基喹啉(47mg，0.55mmol)加入到N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中，室温搅拌下加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)(207mg，0.54mmol)，室温反应1小时。用水淬灭反应，然后用乙酸乙酯萃取3到5次，合并有机相，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，柱层析(洗脱剂：50％-100％乙酸乙酯：石油醚)分离得产物(180mg，73％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.97(d，J＝4.0Hz，1H)，8.77(s，1H)，8.28(d， J＝8.0Hz，1H)，8.22(s，1H)，8.15(d，J＝8.0Hz，1H)，8.03(d，J＝8.0Hz，1H)， 7.94(t，J＝8.0Hz，1H)，7.89(d，J＝4.0Hz，1H)，7.78(t，J＝8.0Hz，1H)，7.65-7.62 (m，2H)，2.44(s，3H)，2.42(s，3H).
实施例14(化合物14)4，5-二羟基-9，10-二氧代-N-(9H-嘌呤-6-基)-9，10-二羟蒽-2-甲酰胺的制备
Figure BDA0002821970850000152
4，5-二乙氧基-9，10-二氧-9，10-二氢化蒽-2-羧酸(200mg，0.59mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中，加入N，N-羰基二咪唑(95mg，0.59mmol)，搅拌10分钟，然后加入腺嘌呤(80mg，0.59mmol)。90℃反应2小时，加入水(50mL)淬灭，体系用乙酸乙酯(40mL)萃取三次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，除去溶剂得黄色固体，黄色固体用乙酸乙酯结晶得到淡黄色固体(150mg，56％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.30(s，1H)8.77(s，1H)，8.54(s，1H)，8.38 (s，1H)，8.17(m，1H)，7.81-7.71(m，2H)，7.58(dd，J1＝8.0Hz，J2＝4.0Hz，1H)， 4.36(q，J＝8.0Hz，2H)，4.24(q，J＝8.0Hz，2H)，1.51-1.40(m，6H).
实施例15(化合物15)4，5-二羟基-9，10-二氧代-N-(7H-吡咯[2，3-d]嘧啶-4-基)-9，10- 二羟蒽-2-甲酰胺的制备
Figure BDA0002821970850000161
4，5-二乙氧基-9，10-二氧-9，10-二氢化蒽-2-羧酸(200mg，0.59mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中，加入N，N-羰基二咪唑(95mg，0.59mmol)，搅拌10分钟，然后加入4-氨基-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶(80mg，0.59mmol)。90℃反应2小时，加入水(50mL) 淬灭，体系用乙酸乙酯(40mL)萃取三次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，除去溶剂得黄色固体，黄色固体用乙酸乙酯结晶得到淡黄色固体(170mg，63％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.11(s，1H)，11.43(s，1H)，8.59(s，1H)，8.31 (s，1H)，8.13(s，1H)，7.81-7.67(m，2H)，7.56(dd，J1＝8.0Hz，J2＝4.0Hz，1H)，7.47(m，1H)，6.65(s，1H)，4.36(q，J＝8.0Hz，2H)，4.24(q，J＝8.0Hz，2H)， 1.48-1.36(m，6H).
实施例16(化合物16)9，10-二氧代-3-(喹啉-8-基)氨基甲酰基)-9，10-二氢化蒽-1，8- 二乙酸酯的制备
Figure BDA0002821970850000162
合成方法如实施例13，将“4-氨基喹啉”替换为“8-氨基喹啉”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：10.93(s，1H)，9.03(m，1H)，8.67(m，2H)，8.50 (m，1H)，8.21(m，2H)，8.01(t，J＝8.0Hz，1H)，7.84(dd，J1＝8.0Hz，J2＝4.0 Hz，1H)，7.76-7.64(m，3H)，2.46(s，3H)，2.43(s，3H).
实施例17(化合物17)1，6，8-三羟基-3-(4-对甲基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
Figure BDA0002821970850000163
中间体C1-1的合成
大黄素(10g，37mmol)溶于醋酸酐(50mL)和吡啶(50mL)中，室温反应过夜。将反应液倒入冰水(450mL)，大量固体析出，过滤，滤饼用水洗涤，干燥得黄色固体(13.2 g，90％)，无需纯化直接用于下一步。
中间体C1-2的合成
将黄色固体C1-1(13.2g，33.3mmol)溶于醋酸酐(70mL)和醋酸(70mL)中，三氧化铬(6.7g，66.7mmol)加入其中，该反应在65℃搅拌8小时。冷却，将反应液倒入冰水(500mL)中，大量固体析出，过滤得粗产品。将粗产品溶于二氯甲烷(400mL)，用 25wt％碳酸氢钠水溶液(300mL)洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，除去溶剂得产品黄色固体C1-2(12.8g，90％)。
中间体C1-3的合成
将固体C1-2(12.8g，30.0mmol)溶于四氢呋喃(200mL)和水(50mL)中，加入无水氢氧化锂(4.3g，180.2mmol)，室温反应3小时，除去四氢呋喃，加入冰水(200 mL)，用稀盐酸(4M)酸化，大量固体洗出，过滤，滤饼用水洗涤，干燥得黄色固体C1-3 (8g，89％)。
1，6，8-三羟基-3-(4-对甲基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮(17)的制备
取C1-3(8g，26.7mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(100mL)中，搅拌下加入三乙胺(5.4g，53.5mmol)和1-对甲基哌嗪(4.9g，27.8mmol)，搅拌15min后，加入 HATU(11.1g，29.2mmol)，反应进程以TLC跟踪，待原料完全反应后结束反应。将反应液倒入水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相用盐水(200mL)洗2次，过滤，有机相用无水硫酸钠干燥，得到棕黄色固体。棕黄色固体过硅胶层析柱纯化，洗脱剂为：乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1。得到淡黄色固体C1(10g，82％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.07(s，3H)，7.56(s，1H)，7.32(s，1H)，7.12 (s，1H)，6.57(s，1H)，3.65-3.18(m，4H)，2.44-2.28(m，4H)，2.24(s，3H).
实施例18(化合物18)9，10-二氧代-6-(4-对甲基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二氢化蒽-1，3，8- 三乙酸酯的制备
Figure BDA0002821970850000171
化合物17(200mg，0.44mmol)溶于醋酸酐(3mL)和吡啶(3mL)中，室温反应过夜。将反应液倒入冰水(20mL)，大量固体析出，过滤。滤饼用水洗涤，干燥得黄色固体，黄色固体过硅胶层析柱纯化，洗脱剂为：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2。得到淡黄色固体C2(180 mg，71％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.28(s，1H)，7.92(s，1H)，7.83(s，1H)，6.57 (s，1H)，3.65-3.18(m，4H)，2.79(s，9H)，2.44-2.24(m，4H)，2.35(s，3H).
实施例19(化合物19)1，3，8-三羟基-2-羟甲基-6-(4-对甲基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
称取17(10g，21.8mmol)于500mL三颈瓶中，加入甲醇(150mL)，搅拌下加入10％NaOH溶液(50mL)，再加入连二亚硫酸钠溶液(1.0g，5.6mmol，Na2S2O4溶于 20mL水中)(20mL)，搅拌10min后，缓慢滴加甲醛水溶液(10mL)，以TLC点板检测反应的进程，当原料C1反应完后，向体系中加入双氧水(10mL)淬灭反应，同时打开密闭体系，继续搅拌30min后，停止反应。
后处理：将反应后的紫红色溶液倒入烧杯中，加入稀盐酸直到溶液变为橙黄色，将所得橙黄色溶液用二氯甲烷(100mL)萃取3次，合并有机相，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干二氯甲烷得到棕黄色固体，过硅胶层析柱纯化，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1得到淡黄色固体(3.2g，30％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.03(s，3H)，7.56(s，1H)，7.32(s，1H)，7.03 (s，1H)，4.62(s，2H)，3.65-3.20(m，4H)，2.44-2.29(m，4H)，2.34(s，3H).
实施例20(化合物20)2-溴甲基-1，3，8-三羟基-6-(4-对甲基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮的制备
精确称取化合物19(1.5g，3.1mmol)于三颈瓶中，加入无水二氯甲烷(60mL)使其溶解，氮气保护下，缓慢滴加三溴化磷(6mL)。实验现象为：开始浑浊的淡黄色溶液随着三溴化磷的加入逐渐变为澄清黄色溶液。待溶液澄清后，用TLC点板检测，待无原料点后缓慢滴加蒸馏水淬灭反应，继续搅拌15min后停止反应。将上述所得混合液倒入分液漏斗，取下层，再用二氯甲烷(60mL)萃取水相2次，合并萃取液，用无水Na2SO4干燥，过滤，旋干得黄色固体，过硅胶层析柱纯化(洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚＝1：3)得淡黄色固体(1.5g，89％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.03(s，3H)，7.56(s，1H)，7.32(s，1H)，6.95 (s，1H)，4.58(s，2H)，3.65-3.20(m，4H)，2.44-2.28(m，4H)，2.24(s，3H).
实施例21(化合物21)1，3，8-三羟基-9，10-二氧代-6-(4-对甲基哌嗪-1-羰基)-9，10-二氢化蒽-2-羧酸的制备
化合物19(1.5g，3.2mmol)溶于吡啶(20mL)中，加入高锰酸钾(1.0g，6.4mmol) 和碳酸钠(674mg，6.4mmol)，60℃反应过夜。冷却至室温，除去吡啶，加入冰水(50 mL)，用盐酸(1M)调至酸性，用乙酸乙酯(40mL)萃取三次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，除去溶剂得黄色固体，黄色固体过硅胶层析柱纯化，洗脱剂为：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1。得到淡黄色固体C5(800mg，52％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.03(s，3H)，7.56(s，1H)，7.32(s，1H)，7.26 (s，1H)，3.65-3.20(m，4H)，2.44-2.24(m，4H)，2.24(s，3H).
实施例22(化合物22)1，3，8-三羟基-9，10-二氧代-6-(4-对甲基哌嗪-1-羰基)-9，10-二氢化蒽-2-羧酸甲酯的制备
化合物21(200mg，0.41mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中，加入N，N- 羰基二咪唑(67mg，0.41mmol)，搅拌10分钟，然后加入甲醇(66mg，2mmol)。室温反应3小时，加入水(50mL)，用乙酸乙酯(40mL)萃取三次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，除去溶剂得黄色固体，黄色固体用乙酸乙酯结晶得到淡黄色固体C6(165 mg，80％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.03(s，3H)，7.56(s，1H)，7.32(s，1H)，7.15 (s，1H)，3.65-3.20(m，4H)，2.44-2.24(m，4H)，2.24(s，3H).
实施例23(化合物23)1，8-二羟基-9，10-二氧代-6-(4-对甲基哌嗪-1-羰基)-9，10-二氢化蒽-2-羧酸的制备
合成方法参照21，将“C1-3”替换成“大黄酸”即可。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.95(s，2H)，8.24(m，1H)，7.72(m，1H)，7.62 (m，1H)，7.41(s，1H)，3.63-3.17(m，4H)，2.44-2.24(m，4H)，2.30(s，3H).
实施例24(化合物24)2-(二甲氨基-甲基)-1，3，8-三羟基-6-(4-对甲基哌嗪-1-羰基)蒽 -9，10-二酮的制备
精确量取二甲胺(33mg，0.72mmol)于三颈瓶中，加入重蒸四氢呋喃(5mL)，再加入DIPEA(93mg，0.72mmol)，将20(200mg，0.36mmol)溶解于重蒸四氢呋喃中(3 mL)，搅拌中缓慢滴加溶解好的化合物20。室温下反应过夜，TLC检测20反应完后停止反应。将所得反应液旋干后再溶于二氯甲烷(30mL)中，用稀盐酸(20mL)洗涤3次，用无水Na2SO4干燥，过滤，旋干得棕黑固体，过硅胶层析柱纯化(洗脱剂为甲醇∶二氯甲烷＝1∶10)得目标产物C9(140mg，76％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：
12.03(s，3H)，7.56(s，1H)，7.32(s，1H)，6.95(s，1H)，3.69(s，2H)，3.65-3.20 (m，4H)，2.44-2.24(m，4H)，2.24(s，3H)，2.16(s，6H).
实施例25(化合物25)2-(二甲氨基-甲基)-1，8-二羟基-6-(4-对甲基哌嗪-1-羰基)蒽 -9，10-二酮的制备
Figure BDA0002821970850000191
化合物25的合成方法参照化合物24，将“20”替换成“C2-3”即可。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.95(s，2H)，7.62(m，1H)，7.41-7.35(m，3H)， 3.63-3.17(m，4H)，2.44-2.25(m，4H)，2.25(s，3H)，2.16(s，6H).
Figure BDA0002821970850000201
实施例26(化合物26)1，3，8-三羟基-9，10-二氧代-6-(4-对甲基哌嗪-1-羰基)-9，10-二氢化蒽-2-羧酸胺的制备
Figure BDA0002821970850000202
化合物21(200mg，0.41mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中，加入N，N- 羰基二咪唑(67mg，0.41mmol)，搅拌10分钟，然后加入氨(1M NH3in THF)(1mmol， 1mL)。室温反应3小时，加入水(50mL)，用乙酸乙酯(40mL)萃取三次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，除去溶剂得黄色固体，黄色固体用乙酸乙酯结晶。得到淡黄色固体26(150mg，75％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.03(s，3H)，7.56(s，1H)，7.32(s，1H)，7.20 (s，1H)，3.65-3.20(m，4H)，2.44-2.24(m，4H)，2.24(s，3H).
实施例27(化合物27)4，5-二羟基-9，10-二氧代-N-(喹啉-4-基)-9，10-二羟蒽-2-甲酰胺的制备
合成方法如实施例1，将“无水哌嗪”替换为“4-氨基喹啉”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：11.89(s，2H)，8.89(s，1H)，8.74(s，1H)，8.22 (d，J＝8.0Hz，1H)，8.19(s，1H)，8.11(d，1H)，8.01(d，1H)，7.92(t，J＝8.0Hz， 1H)，7.88(d，1H)，7.76(t，J＝8.0Hz，1H)，7.67-7.62(m，2H).
实施例28(化合物28)9，10-二氧代-3-(哌嗪-1-羰基)-9，10-二氢化蒽-1，8-二乙酸酯的制备
合成方法如实施例13，将“4-氨基喹啉”替换为“无水哌嗪”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：7.85(t，J＝8.0Hz，1H)，7.73-7.67(m，1H)，7.67 (d，J＝1.2Hz，1H)，7.43-7.41(m，2H)，3.67-3.19(m，8H)，2.06(s，3H)，2.01(s， 3H).
实施例29(化合物29)盐酸9，10-二氧代-3-(吡啶-4-基)氨基甲酰基)-9，10-二氢化蒽 -1，8-二乙酸酯的制备
合成方法如实施例13，将“4-氨基喹啉”替换为“4-氨基吡啶”。
1HNMR(400MHz，D2O)δ：8.52(d，J＝4.0Hz，2H)，8.21(s，1H)，8.03(d，J＝ 8.0Hz，2H)，7.92(t，J＝12.0Hz，1H)，7.78-7.64(m，2H)，7.42(m，1H)，2.32(s，3H)，2.30(s，3H).
实施例30(化合物30)9，10-二氧代-3-(4-乙基哌嗪-1-羰基)-9，10-二氢化蒽-1，8- 二乙酸酯的制备
合成方法如实施例13，将“4-氨基喹啉”替换为“N-乙基哌嗪”。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.15(m，1H)，8.05(m，1H)，7.96(t，J＝8.0Hz，1H)，7.69-7.64(m，2H)，4.58(m，2H)，3.70-3.17(m，8H)，2.40(m，6H)，1.07(t，J＝8.0 Hz，3H).
实施例31(化合物31)1，8-二羟基-3-(4-乙基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮盐酸盐的制备
将1，8-二羟基-3-(4-乙基哌嗪-1-羰基)蒽-9，10-二酮(30mg，0.08mmol)溶于甲醇(3mL)中，加入氯化氢(1M甲醇溶液)(2mL)，有固体析出，抽滤干燥得产品(25mg， 76％)淡红色固体。将其溶于甲醇(2mL)中，加入氯化氢(1M甲醇溶液)，有固体析出，抽滤干燥得产品亮黄色固体。
1HNMR(400MHz，D2O)δ：7.90(t，J＝8.0Hz，1H)，7.80-7.71(m，2H)，7.55-7.45 (m，2H)，4.60(m，2H)，3.88-3.19(m，8H)，1.30(t，3H).
实施例32(化合物32)3-[(4-乙基哌嗪-1基)甲基]-1，8-二羟基蒽-9，10-二酮盐酸盐的制备
Figure BDA0002821970850000211
中间体3-(氯甲基)-1，8-二羟基蒽-9，10-二酮的合成
将1，8-二羟基-3-(羟甲基)-蒽-9，10-二酮(10g，36.47mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(100mL)并降温至0-10℃，然后缓慢加入氯化亚砜(74mL，0.98mol)，加毕，体系恢复至室温，继续在室温下搅拌，TLC点板监控(大约反应四小时)。反应完毕，搅拌下将体系倒入300mL冰水，有大量橙色固体析出，过滤，滤饼用50mL纯水洗涤两次，湿滤饼无水乙醇重结晶，过滤，滤饼用冰的无水乙醇洗涤一次，40℃干燥12小时得到橙黄色产品(9.25g，86％)。
3-[(4-乙基哌嗪-1-基)甲基]-1，8-二羟基蒽-9，10-二酮盐酸盐(化合物32)的制备
室温下，将3-(氯甲基)-1，8-二羟基蒽-9，10-二酮(9.25g，32.04mmol)和无水碳酸钾(13.28g，96.12mmol)溶于乙腈(200mL)中，然后搅拌下加入乙基哌嗪(3.66g，32.04mmol)，加毕，升温至80℃，反应进程以TLC跟踪。待原料完全反应后结束反应，旋除溶剂，向残余物中加入200mL纯水，用稀盐酸调pH至7，然后用二氯甲烷(100mL) 萃取三次，合并有机相用饱和食盐水(200mL)洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋除溶剂，残余物硅胶柱层析纯化(洗脱剂：100％乙酸乙酯到二氯甲烷∶甲醇＝10∶1) 得到棕黄色固体33(7.0g，60％)。将其溶于甲醇(10mL)中，加入氯化氢(1M甲醇溶液)，有固体析出，抽滤干燥得产品(7.1g)淡黄色固体。
1HNMR(400MHz，D2O)δ：7.44(t，1H)，7.35(s，1H)，7.18-7.10(m，2H)，7.03-6.96 (d，J＝8.0Hz，1H)，4.21(s，2H)，3.89-3.22(m，10H)，1.30(t，J＝8.0Hz，3H).
实施例33(化合物33)3-[(4-乙基哌嗪-1-基)甲基]-9，10-二羰基-9，10-二氢蒽-1，8-二羟基二甲氨基甲酸酯的制备
Figure BDA0002821970850000221
室温下，将化合物32(200mg，0.55mmol)和三乙胺(167mg，1.65mmol)溶于二氯甲烷中(5mL)，然后滴加二甲氨基甲酰氯(130mg，1.21mmol)，加毕，继续室温反应，TLC监控反应进程。反应完毕，加水(20mL)淬灭，稀盐酸调pH至7，二氯甲烷(20 mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋除溶剂，残余物硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)得黄色固体(154mg， 55％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.30(s，1H)，8.10(m，1H)，7.95-7.87(m，2H)， 7.63(dd，J1＝8.0Hz，J2＝1.2Hz，1H)，4.40(s，2H)，3.69-3.22(m，10H)，3.17(s， 12H)，1.25(t，J＝8.0Hz，3H).
实施例34(化合物34)3-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-1，8-二羟基-10，10-二甲基蒽-9(10H)-酮盐酸盐的制备
Figure BDA0002821970850000222
中间体1，8-二羟基-3-(羟甲基)-蒽-9-(10H)-酮的合成
室温下，将芦荟苷(5g，11.95mmol)，十水合四硼酸钠(19g，49.82mmol)和盐酸苯肼(2g，13.83mmol)溶于纯水(100mL)，然后氮气置换三次，体系加热回流反应三小时。降温到室温，体系用4M盐酸调pH至5-6，乙酸乙酯(150mL)萃取三次，合并有机相，依次用5％稀盐酸(150mL)和饱和食盐水(150mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋除溶剂，残余物硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)得红色固体，继续用无水甲醇重结晶，得红色固体(660mg，21％)，用于下一步中间体的合成。
中间体1，8-二羟基-3-(羟甲基)-10，10-二甲基蒽-9(10H)-酮的合成
室温下，氮气保护下将上一步所得中间体1，8-二羟基-3-(羟甲基)-蒽-9-(10H)-酮(400mg，1.56mmol)和碳酸钾(862mg，6.24mmol)溶于丙酮(10mL)，然后滴加碘甲烷(487mg，3.43mmol)，加毕，体系升温至60℃反应2小时。降温到室温，加入30 mL纯水，体系用稀盐酸调pH至6-7，乙酸乙酯(30mL)萃取两次，合并有机相，饱和食盐水(30mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋除溶剂，残余物硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷∶乙酸乙酯＝1∶1)得红色固体(307mg，69％)，用于下一步中间体的合成。
中间体3-(氯甲基)-1，8-二羟基-10，10-二甲基蒽-9(10H)-酮的合成
0-10℃下，向上一步中间体1，8-二羟基-3-(羟甲基)-10，10-二甲基蒽-9(10H)-酮(307mg，1.08mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中缓慢滴加氯化亚砜(3.47g，29.16 mmol)，加毕，继续室温反应12小时，然后加入纯水(20mL)淬灭反应，二氯甲烷(20mL) 萃取两次，合并有机相，饱和食盐水(20mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋除溶剂，残余物硅胶柱层析纯化(洗脱剂：100％二氯甲烷)得黏的棕红色固体(217mg， 67％)，用于下一步化合物34的合成。
3-[(4-乙基哌嗪-1-基)甲基]-1，8-二羟基-10，10-二甲基蒽-9(10H)-酮(化合物34) 的制备
室温下，将上一步中间体3-(氯甲基)-1，8-二羟基-10，10-二甲基蒽-9(10H)-酮(217 mg，0.72mmol)和无水碳酸钾(398mg，2.88mmol)溶于乙腈(5mL)中，然后搅拌下加入乙基哌嗪(90mg，0.79mmol)，加毕，升温至70℃，反应进程以TLC跟踪。待原料完全反应后结束反应，旋除溶剂，向残余物中加入20mL纯水，用稀盐酸调pH至7，然后用二氯甲烷(20mL)萃取三次，合并有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋除溶剂，残余物硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)得到黏的棕红色固体(100mg，36％)。将其溶于甲醇(2mL)中，加入氯化氢(1 M甲醇溶液)，有固体析出，抽滤干燥得产品淡红色固体，为其盐酸盐。
1HNMR(400MHz，D2O)δ：7.44(s，1H)，7.23(s，1H)，7.08(s，1H)，6.72(s， 1H)，6.61(1H)，4.29(s，2H)，3.98-3.09(m，8H)，2.41(s，3H)，1.37(s，6H)，.
生物学实施例
实施例35、化合物对流感病毒的抑制效果检测
1.流感病毒的扩增及纯化
HIN1-PR8流感病毒：中国科学院微生物研究所
HIN1-PR8流感病毒采用鸡胚羊膜腔方法扩增：
具体方法为：取出鸡胚，用手电筒，照蛋器照射看鸡胚，在气囊边缘拿铅笔划一横线，下方找到无血管位置划一叉。标记出注射位置。
每个稀释度的HIN1-PR8流感病毒注射3-4枚鸡胚，一半从-1的稀释度开始。
超净台准备，酒精灯，针头，大针头。先将蛋喷酒精，然后拿大针烧一烧后先在气囊顶端打孔，再在标记位置打孔。
用1ml注射器注射稀释好的毒液。注射深度大概0.3-0.5cm，不益过深，用右手注射，不能有气泡。采用融化蜡块儿涂抹封孔。鸡胚放置37度培养箱培养72h收毒。放到4度冰箱过夜。喷酒精消毒，用镊子捣碎顶端气室。烧镊子，撕破顶端膜结构。用注射器吸取尿囊液(即病毒液)，鸡胚需灭菌处理，分装冻存。
取100微升测量血凝实验。取适量鸡红细胞用PBS洗一次，不要超过3000转，短暂离心。PBS重悬，放到排枪吸盒中，上面套个一次性手套，用尖底一次性96皿，设置阴性对照，按体积比1∶1比例加入红细胞25微升，和按十倍倍比稀释的病毒悬液25微升(采用PBS稀释)，放置20分钟，室温观察。
病毒液2000转，4度离心10分钟，病毒液分装冻存。
2.病毒滴度检测
(1)以8％FBS DMEM培养基培养MDCK细胞(来源：中国科学院微生物研究所)，胰酶消化后分细胞至96孔板，每孔2000个细胞。10％FBS DMEM培养基培养24小时。
(2)吸取分装冻存的病毒液或病毒培养上清100μl，采用DMEM培养基进行10倍稀释度倍比稀释。
(3)取出步骤(1)中的96孔培养板，去除每孔中的培养基，按每孔100微升加入稀释的病毒液，按1∶2000加入TPCK胰酶，4摄氏度吸附1小时，加200微升10％FBS DMEM 培养基，按1∶2000体积比加入TPCK胰酶。
(4)37度培养48-72小时，观察每个稀释度病变孔，以Reed-Muench法计算病毒滴度。
所测病毒滴度为TCID50＝6.48/0.1ml。
3.WB检测化合物对流感病毒的抑制效果
(1)胰酶消化MDCK细胞，细胞计数并分细胞至12孔培养板。
(2)24小时后，以MOI＝1接种前述第1和2节所得流感病毒，同时按1∶2000体积比加入TPCK胰酶。
(3)吸附45分钟后，弃上清，加入DMEM培养基，按1∶2000体积比加入TPCK胰酶。
(4)1小时后，加入各化合物，化合物终浓度为3微摩尔每升。
(5)细胞培养24或48小时后，弃上清，冰PBS洗三次，加入裂解液100微升。
(6)待至细胞裂解完全后，吸入1.5ml离心管中，12000转/分，4℃离心10分钟。
(7)将上清转移到离心管中，用Nanodrop测量蛋白浓度，以等量总蛋白上样，12％SDS-PAGE，80V电泳2小时，将所述蛋白通过湿转的方法转移至PVDF膜(GE Health)上(200mA、90min)，考马斯亮蓝染色确定转膜效率，脱色后TBST(Tris-HCI缓冲液(0.5MpH7.6)100ml NaCl 8.5～9g(0.15mol/L)，1ml/L的Triton-20)洗涤3次，5％脱脂奶粉封闭过夜，TBST洗涤3次后，加入兔抗A型流感病毒NP蛋白单克隆抗体或兔抗B型流感 NP蛋白多克隆抗体(1％脱脂奶粉，抗体1/1000稀释)，37℃孵育1小时，TBST洗涤3 次(每次10分钟)后，加入辣根过氧化酶标记的二抗(购买自中衫金桥)(1％脱脂奶粉，抗体1/3000稀释)，37℃孵育45分钟，TBST洗涤3次后(每次10分钟)，再用超敏发光液显色，拍照。以Image J分析WB条带灰度值。
(8)显色完成后，TBST洗膜，加入TBST稀释的抗GAPDH鼠单抗，室温孵育1小时，TBST洗三次，加入辣根过氧化酶标记的二抗(购买自中衫金桥)(1％脱脂奶粉，抗体1/3000稀释)，37℃孵育45分钟，TBST洗涤3次后(每次10分钟)，再用超敏发光液显色，拍照。以Image J分析WB条带灰度值。
检测结果如图1所示，其中MocK为阴性对照，Ost为奥司他韦，Inc003指代双醋瑞因。从结果可知，本发明提供的大部分化合物(化合物002，003，004，005，006，010， 031，009，011，028，029)对流感病毒的抑制效果显著优于双醋瑞因或奥司他韦。
4.化合物对流感病毒半数抑制浓度检测
胰酶消化MDCK细胞，细胞计数并分细胞至24孔培养板。24小时后，以MOI＝1接种流感病毒，同时按1∶2000体积比加入TPCK胰酶。吸附45分钟后，弃上清，加入DMEM培养基，按1∶2000体积比加入TPCK胰酶。1小时后，加入各化合物，起始浓度为300nM，每孔按10倍稀释。24小时后，收样儿，行WB分析。
027、028、029号化合物的结果如图2，从结果可知，本发明提供的化合物的半数抑制浓度为纳摩尔数量级(约1-10nM之间)。
5.化合物细胞毒性检测
(1)以10％FBS DMEM培养基培养293T细胞(来源：中国科学院微生物研究所)。以2.5％胰酶消化细胞，以每孔加入100微升5000个细胞分细胞至96孔板，培养24小时。
(2)以10％FBS DMEM培养基按2倍倍比稀释化合物，每种化合物设计三个重复，使其浓度从6000纳摩十倍稀释；置37度培养24小时。每孔加入10微升CCK-8溶液。
以加相应量细胞培养液和CCK-8溶液(来源：碧云天科技)但没有加入细胞的孔作为空白对照。
在细胞培养箱内继续孵育1小时，在450nm测定吸光度。以对照为100，计算细胞毒性百分数。
部分化合物的毒性结果如图3，从结果可知，在有效病毒抑制浓度范围内，化合物的毒性处于可接受范围内(＞70％)。
实施例36、化合物对乙肝病毒的抑制效果细胞水平药效学检测
Elisa实验检测乙肝HepG2-2215细胞模型上清乙肝病毒S抗原
化合物处理HepG2-2215细胞：首先胰酶消化对数期HepG2-2215细胞，细胞贴壁24小时后，加入化合物(终浓度1微摩尔)，以DMSO组为对照。孵育细胞48小时。收集上清
吸取本发明不同化合物处理的HepG2-2215细胞上清，以DMSO组为对照。
依据检测试剂盒(乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒，上海科华生物)说明书，预实验检测细胞上清的不同稀释比例，以期以不同的稀释度满足仪器量程。
具体检测方法如下：
将稀释的样品(稀释的HepG2-2215细胞上清)加入酶标孔，每孔100微升。37度孵育1小时，使S抗原与抗体结合。以洗涤液洗涤三次，每次将洗涤液拍干。加入50微升显色液A，50微升显色液B。37度孵育20分钟，加入终止液，读取450nm光吸收值，以630nm光吸收为参比波长。
以450nm吸光值减630nm吸光值为纵坐标作图，结果如图4。可知，各测试化合物对上清中乙肝病毒S蛋白均有显著抑制效果，其中，以002，003，010抑制效果最佳。
实施例37.化合物对人免疫缺陷病毒(HIV-1)的抑制效果细胞水平药效学检测
1.HIV-1假病毒的包装
pNL4-3 Luc-R-E及VSVG质粒：中国科学院微生物研究所
以10％FBS DMEM培养基培养293T细胞。
对pNL4-3 Luc-R-E及VSVG的质粒进行大量提取，Nanodrop测量质粒浓度及纯度。
将状态较好的细胞消化并分至10cm培养皿。培养24小时后，弃培养基，以DMEM漂洗两次，加入5毫升DMEM。
将pNL4-3 Luc-R-E及VSVG质粒按摩尔数1：1混合(总质量为6微克)，加入60微升PEI转染试剂，转染293T细胞。37度孵育2小时后，补加4毫升DMEM。继续培养46小时。吸取上清，1200转离心5分钟，保留上清。
配制5×PEG8000 NaCl溶液：称取NaCl 8.766g；PEG8000 50g溶解在200ml纯水中。高压灭菌30分钟。室温冷却后与病毒上清液均匀混合。置4度过夜。12000离心一小时，沥干液体，沉淀用PBS重悬。
2.双荧光素酶检测化合物对HIV-1的抑制
以10％FBS DMEM培养基培养HeLa细胞(中国科学院微生物研究所)。细胞用胰酶消化并分至6孔板。计数，并按50％汇合度铺细胞至六孔板。37度培养24小时，去除培养基，冰PBS漂洗三次，以适当病毒浓度(本实验中采用的病毒浓度具体为感染50％汇合度细胞的荧光值比值为50)感染HIV-1假病毒，弃上清，以冰PBS冲洗三次，加入10％FBS DMEM 培养基，同时加入不同浓度的化合物及DMOS对照。设置未感染对照组。培养48小时后，弃上清，以冰PBS漂洗三次。每孔加入500微升PLB裂解液，室温摇床孵育15分钟，12000 转离心5分钟，取上清。取一96孔板，按照每个样品三个重复，每个重复加入20微升蛋白裂解液。每孔加入100微升LARII荧光底物，测量萤火虫荧光素酶活力。之后迅速每孔加入100微升终止液，测量海肾荧光素酶活性。计算以荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值。
结果如图5，各测试化合物对HIV假病毒有显著抑制效果，其中，以002，005，006 抑制效果最佳，各测试化合物都优于对照双醋瑞因INC003。

Claims (7)

1.一种化合物，其具有以下结构式
Figure QLYQS_1
。
2.权利要求1所述化合物在制备抗病毒药物中的应用。
3.一种药物组合物，该药物组合物中含有治疗有效量的权利要求1所述化合物或其药用盐，并含有一种或多种药学上可接受的药物辅剂；所述药用盐是指所述化合物与酸发生成盐反应的产物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，所述活性成分的重量含量为0.1％-99.5％。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，所述活性成分的重量含量为0.5％-99.5％。
6.根据权利要求3-5任一所述的药物组合物在制备抗病毒药物中的应用，所述病毒指小RNA病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、痘病毒、人乳头瘤病毒、副黏病毒、黄病毒、逆转录病毒、冠状病毒、甲病毒、弹状病毒、沙粒病毒、戊型肝炎病毒、星状病毒、环状病毒、细小病毒、腺病毒、多瘤病毒。
7.根据权利要求3-5任一所述的药物组合物在制备抗病毒药物中的应用，所述病毒是指甲型流感病毒、人手足口病病毒、艾滋病病毒、乙肝病毒、猪瘟病毒。
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