CN112899400A

CN112899400A - 口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒双重rpa检测试剂盒

Info

Publication number: CN112899400A
Application number: CN202110177477.7A
Authority: CN
Inventors: 赵晓民; 童德文; 王凯丽; 郭建雄
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-02-07
Filing date: 2021-02-07
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2041-02-07
Also published as: CN112899400B

Abstract

本发明公开了一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒双重RPA检测试剂盒，包括由SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.6所示核苷酸序列组成的口蹄疫病毒RPA检测引物组，以及由SEQ.ID.NO.8和SEQ.ID.NO.11所示核苷酸序列组成的水泡性口炎病毒RPA检测引物组。所述试剂盒基于重组酶聚合酶扩增法，以利用RNA反转录形成的cDNA为模板并在优化的反应温度和时间下进行扩增反应，利用核酸凝胶电泳获得检测结果。本发明可用于同时对口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒进行检测，操作简单，并且具有较高的灵敏度和特异性，为病原体的现场筛查提供了快速检测试剂。

Description

口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒双重RPA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒核酸检测领域，具体涉及一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的双重RPA检测引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)是小RNA病毒科口蹄疫病毒属成员，主要感染牛、羊、猪等动物。水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)属于弹状病毒科水疱病毒属成员，是一种有包膜、无节段的负义RNA病毒。水泡性口炎和口蹄疫均可导致动物的口腔黏膜、乳头皮肤及蹄冠部皮肤出现泡状病变，临床症状相似，很难区分。由于临床上很难区别口蹄疫和水泡性口炎，并且这两种病毒给养殖业带来重大危害，对社会公共卫生也造成了严重影响，因此，建立快速、敏感并且特异的针对FMDV和VSV的检测试剂十分必要。

重组酶聚合酶核酸等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是近几年发展起来的一种核酸等温扩增技术。RPA技术采用恒温扩增反应，利用重组酶UvsX打开模板链，不需高热变性，相比传统的PCR技术，优势在于可以在更短的时间内实现对目的核酸的扩增，操作更方便。

目前应用PCR技术可以单独针对FMDV的不同血清型进行检测，例如，中国专利CN104946795A、CN104862420A，也可以单独针对VSV的不同亚型进行检测，例如，中国专利CN106350609A。也有报道将RPA技术应用在小反刍兽疫病毒(含口蹄疫等多种病毒)的检测中。但是，针对同时进行FMDV和VSV的检测主要涉及基因芯片和PCR技术，尚未有报道涉及RPA技术。RPA相比于PCR，对引物设计的要求更为严苛，无法完全依照软件设计实现，筛选有效的特异性扩增引物和反应条件是实现多重RPA检测的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒双重RPA检测试剂盒，可以实现一次对两种病毒的同时检测，具有广泛应用前景。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的双重RPA检测引物组，该RPA检测引物组包括口蹄疫病毒反转录本扩增引物对P1以及水泡性口炎病毒反转录本扩增引物对P2；

所述引物对P1的核苷酸序列为：

上游引物F1：5'-GTCGACGTTTTGCCTGTTGAACACATTCTTTAC-3'(SEQ.ID.NO.1)下游引物R1：5'-GTGATGCGTTTGTTCTCATAGGCGTGCTCCG-3'(SEQ.ID.NO.6)；

所述引物对P2的核苷酸序列为：

上游引物F'2：5'-CTTCTAAGTCTCCATATTCTTCCGTCAAAAACCC-3'(SEQ.ID.NO.8)

下游引物R'2：5'-GTGGCGGTGCATTAGTCGTCAATCCTCCGGTAC-3'(SEQ.ID.NO.11)。

一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒双重RPA检测试剂盒，该试剂盒包括上述RPA检测引物组。

优选地，所述RPA检测引物组中，各引物的工作浓度均为5～20μM。

优选地，所述RPA检测引物组中，根据引物对扩增片段的大小差异，扩增片段较小的引物对P2在建立的RPA扩增反应体系中的含量大于扩增片段较大的引物对P1在该反应体系中的含量，从而确保两种病毒的RPA检测结果达到相对一致的稳定性，避免错误判读。

优选地，所述RPA检测引物组中，F1:R1:F'2:R'2的用量体积比为(1.1～1.2):(1.1～1.2):(1.2～1.3):(1.2～1.3)。

优选地，所述试剂盒还包括重组酶UvsX和DNA聚合酶(例如，含于RPA Basic冻干粉中)、RPA缓冲液(例如，Rehydration Buffer)和MgOAc。

一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的双重RPA检测方法，包括以下步骤：

1)从采集自待测牛的生物样品中提取RNA，以提取的RNA经反转录得到的cDNA为模板，采用上述RPA检测引物组在同一个反应体系中进行RPA扩增，得到扩增产物；

2)将扩增产物进行核酸电泳检测，若电泳结果出现331bp条带，则所述生物样品含有感染获得的口蹄疫病毒；若电泳结果出现260bp条带，则所述生物样品含有感染获得的水泡性口炎病毒；若电泳结果同时出现331bp和260bp的两种条带，则所述生物样品同时含有感染获得的口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒；若电泳结果无条带出现，则所述生物样品不含有口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒。

优选地，所述反应体系包括5～20μM上游引物F1 1.1～1.2μL、5～20μM下游引物R11.1～1.2μL、5～20μM上游引物F'2 1.2～1.3μL、5～20μM下游引物R'2 1.2～1.3μL、280mmol/L MgOAc 0.5～3μL、RPA缓冲液7～30μL以及≤2μL的模板。

优选地，所述反应体系中，模板的含量为30～100ng。

优选地，所述RPA扩增的反应条件为：35～40℃扩增20～30min，冰上终止反应。

优选的，所述生物样品选自血清或取自患处的水泡皮、水泡液。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过设计和筛选针对口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的RPA引物，实现了对两种病毒的双重RPA检测，检测结果采用核酸电泳分析进行判读，具有检测速度快、成本低、灵敏度和稳定性高，以及特异性强的优势，并且对基因扩增设备的要求低，适合在资源受限及突发传染病地区进行现场检测。

进一步地，本发明利用所述的RPA检测引物组结合反应体系优化，在核酸电泳中可以获得更清晰的产物条带，降低了检测结果受到RPA扩增产物在反应期间发生降解的影响。

附图说明

图1为本发明实施例中FMDV的RPA引物筛选结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：引物对F1-R1(扩增目的片段为331bp)；泳道2：引物对F2-R1(扩增目的片段为304bp)；泳道3：引物对F3-R1(扩增目的片段为173bp)；泳道4：引物对F4-R1(扩增目的片段为167bp)；泳道5：引物对F5-R1(扩增目的片段为147bp)；泳道6：阴性对照(阴性对照的模板是ddH₂O)。

图2为本发明实施例中VSV的RPA引物筛选结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000PlusMarker；泳道1：引物对F'1-R'2(扩增目的片段为182bp)；泳道2：引物对F'2-R'1(扩增目的片段为112bp)；泳道3：引物对F'2-R'2(扩增目的片段为260bp)；泳道4：引物对F'3-R'1(扩增目的片段为101bp)；泳道5：引物对F'3-R'2(扩增目的片段为249bp)；泳道6：阴性对照。

图3为本发明实施例中FMDV和VSV双重RPA扩增结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：FMDV和VSV双重RPA扩增；泳道2：阴性对照。

图4为本发明实施例中FMDV和VSV双重RPA扩增反应温度优化结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：30℃；泳道2：35℃；泳道3：40℃；泳道4：45℃；泳道5：50℃；泳道6：阴性对照。

图5为本发明实施例中FMDV和VSV双重RPA扩增反应时间优化结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：10min；泳道2：20min；泳道3：30min；泳道4：40min；泳道5：50min；泳道6：阴性对照。

图6为本发明实施例中FMDV和VSV双重RPA扩增反应特异性检测结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：VSV(260bp)；泳道2：FMDV(331bp)；泳道3：BVDV；泳道4：BCoV；泳道5：BRV；泳道6：BPIV-3；泳道7：BRSV；泳道8：BHV；泳道9：阴性对照。

图7为本发明实施例中FMDV和VSV双重RPA扩增反应灵敏度检测结果的电泳图；其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：FMDV浓度为79.5ng/μL、VSV浓度为75.5ng/μL；泳道2：FMDV浓度为7.95ng/μL、VSV浓度为7.55ng/μL；泳道3：FMDV浓度为7.95×10^-1ng/μL、VSV浓度为7.55×10^-1ng/μL；泳道4：FMDV浓度为7.95×10^-2ng/μL、VSV浓度为7.55×10^-2ng/μL；泳道5：FMDV浓度为7.95×10^-3ng/μL、VSV浓度为7.55×10^-3ng/μL；泳道6：FMDV浓度为7.95×10^-4ng/μL、VSV浓度为7.55×10^-4ng/μL；泳道7：FMDV浓度为7.95×10^-5ng/μL、VSV浓度为7.55×10^-5ng/μL；泳道8：阴性对照。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

1.引物设计与筛选

(1)在GeneBank中收集口蹄疫病毒(FMDV)和水泡性口炎病毒(VSV)这两种病毒的全基因组序列，利用MegAlign对序列进行比对分析(FMDV为52条全基因组序列，VSV为16条全基因组)，选取种内保守且种间特异的区域作为每种病毒的检测靶基因，进一步比对保守基因序列，确定拟扩增的基因序列候选区域，然后根据确定的基因序列设计引物。其中FMDV选择3D基因区域、VSV选择N基因区域进行RPA引物设计。

采用以下引物筛选原则，剔除根据引物碱基互补配对等引物一般设计要求获得的候选引物中不符合以下要求的引物，从而提高了引物筛选效率：

A.引物长度在30～35bp之间；

B.引物的TM值不作为参考，但是GC含量应在40％～60％之间；

C.引物不存在发卡结构，避免二聚体和错配；

D.引物的5'端前3个核苷酸包含胞嘧啶或鸟嘌呤，3'端最后3个核苷酸包含胞嘧啶或鸟嘌呤；

E.引物中避免出现特殊结构，例如，回文序列、长串的聚嘌呤或聚嘧啶(不超过5个)等。

筛选出的引物送上海生工合成，上、下游引物序列如下。

FMDV上游引物：

F1：5'-GTCGACGTTTTGCCTGTTGAACACATTCTTTAC-3'(SEQ.ID.NO.1)

F2：5'-CTTTACACCAGGATGATGATTGGCAGATTTTG-3'(SEQ.ID.NO.2)

F3：5'-CAGAAACGTGTGGGATGTGGACTATTCGGCC-3'(SEQ.ID.NO.3)

F4：5'-CGTGTGGGATGTGGACTATTCGGCCTTTGATGC-3'(SEQ.ID.NO.4)

F5：5'-CGGCCTTTGATGCTAACCACTGCAGCGACGCGATG-3'(SEQ.ID.NO.5)

FMDV下游引物：

R1：5'-GTGATGCGTTTGTTCTCATAGGCGTGCTCCG-3'(SEQ.ID.NO.6)

VSV上游引物：

F'1：5'-CCACCAGAGCAAGGAATGCCCGACAGCCTGATGAC-3'(SEQ.ID.NO.7)

F'2：5'-CTTCTAAGTCTCCATATTCTTCCGTCAAAAACCC-3'(SEQ.ID.NO.8)

F'3：5'-CCATATTCTTCCGTCAAAAACCCTGCCTTC-3'(SEQ.ID.NO.9)

VSV下游引物：

R'1：5'-GTCATCAGGCTGTCGGGCATTCCTTGCTCTGGTGG-3'(SEQ.ID.NO.10)

R'2：5'-GTGGCGGTGCATTAGTCGTCAATCCTCCGGTAC-3'(SEQ.ID.NO.11)

(2)模板构建

受病原体来源限制，人工合成病原体基因组序列，并以这些人工合成的FMDV和VSV基因组序列作为模板(2020年6月合成)进行后续实验。

FMDV模板序列：

5'-CCCGAGGTTGAGGCTGCCTTGAAGCTCATGGAGAAAAGAGAATACAAGTTTGCTTGTCAGACCTTCCTGAAGGACGAGATTCGCCCGATGGAGAAAGTACGTGCCGGCAAGACTCGCATTGTCGACGTTTTGCCTGTTGAACACATTCTTTACACCAGGATGATGATTGGCAGATTTTGTGCACAAATGCACTCAAACAACGGACCGCAAATTGGCTCGGCGGTCGGTTGCAATCCTGATGTTGATTGGCAAAGATTTGGCACACATTTTGCCCAGTACAGAAACGTGTGGGATGTGGACTATTCGGCCTTTGATGCTAACCACTGCAGCGACGCGATGAACATCATGTTTGAGGAGGTGTTTCGCACAGAGTTCGGCTTCCACCCAAACGCTGAGTGGATTCTGAAGACTCTTGTGAACACGGAGCACGCCTATGAGAACAAACGCATCACTGTTGAGGGCGG-3'(SEQ.ID.NO.12)

VSV模板序列：

5'-CTTCTAAGTCTCCATATTCTTCCGTCAAAAACCCTGCCTTCCACTTCTGGGGGCAATTGACAGCTCTTCTGCTCAGATCCACCAGAGCAAGGAATGCCCGACAGCCTGATGACATTGAGTATACATCTCTTACTACAGCAGGTTTGTTGTACGCTTATGCAGTAGGATCCTCTGCTGACTTGGCACAACAGTTTTGTGTTGGAGATAACAAATACACTCCAGATGATAGTACCGGAGGATTGACGACTAATGCACCGCCACAAGGCAGAGATGTGGTCGAATGGCTCGGATGGTTTGAAGATCAAAACAGAAAACCGACTCCTGATATGATGCAGTATGCGAAACGAGCAGTCATGTCACTGCAAGGCCTAAGAGAGAAGACAATTGGCAAGTATGCTAAGTCAGAATTTGACAAATGA-3'(SEQ.ID.NO.13)

(3)RPA的反应体系

50μL反应体系：模板0.5μL(79.5ng/μL FMDV或75.5ng/μL VSV)、RehydrationBuffer29.5μL、10μM上游引物2.4μL、10μM下游引物2.4μL、ddH₂O 12.7μL以及280mM MgOAc2.5μL。

(4)RPA恒温扩增反应

将配好的50μL体系加入一管RPA Basic冻干粉(含重组酶)中，40℃扩增40min，冰上终止反应。

(5)依据扩增结果筛选引物

将RPA扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，FMDV引物筛选结果如图1所示，各引物对均扩增出对应条带，其中引物对F1-R1的条带最亮，因此FMDV选择引物对F1-R1进行后续实验；VSV引物筛选结果如图2所示，所有引物对均扩增出对应条带，但是其中引物对F'1-R'2和F'3-R'2扩增出非特异性条带；引物对F'2-R'2扩增出的特异性条带最亮，因此VSV选择引物对F'2-R'2进行后续实验。

2.FMDV和VSV的双重RPA检测方法建立

以人工合成的FMDV和VSV基因片段为模板，利用上述筛选出的引物组(F1-R1、F'2-R'2)进行RPA恒温扩增反应。

(1)双重RPA反应体系为50μL：FMDV和VSV模板各0.5μL、Rehydration Buffer29.5μL、10μM FMDV上、下游引物各1.1μL、10μM VSV上、下游引物各1.3μL、ddH₂O12.2μL、280mMMgOAc 2.5μL。

将配好的50μL体系加入一管RPA Basic冻干粉中，40℃扩增40min，冰上终止反应。

(2)将RPA扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，双重RPA反应体系成功扩增出FMDV的大小为331bp的条带以及VSV的大小为260bp的条带。

(3)利用上述双重RPA反应体系，将扩增反应温度分别设置为：30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，进行RPA扩增，结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，不同反应温度下的扩增产物检测结果如图4所示，在40℃时，条带最为清晰且亮度较高，因此确定最佳反应温度为40℃。

(4)利用上述双重RPA反应体系，将扩增反应时间分别设置为：10min、20min、30min、40min、50min，在确定的最佳反应温度40℃下进行RPA扩增，扩增结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，不同反应时间下的扩增产物检测结果如图5所示，可见在30min时，条带最亮，因此确定最佳反应时间为30min。

3.检测特异性

分别以水泡性口炎病毒(VSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(BHV)的基因序列作为模板(其中，BVDV、BCoV、BRV的模板是反转录得到的病毒cDNA，按2000ng反转录，加入0.5μL；其余病毒的模板是人工合成的基因片段，模板含量30～50ng，加入0.5μL；BPIV-3扩增的目的片段位于NP基因内，BRSV扩增的目的片段位于N基因内，BHV扩增的目的片段位于gB基因内)，加入与“1.引物设计与筛选”中相同的反应体系，利用“1.引物设计与筛选”中筛选出的引物组(F1-R1、F'2-R'2)和“2.FMDV和VSV的双重RPA检测方法建立”中确定的最佳反应时间和温度进行RPA扩增，反应结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示。从图6可知，针对引物组(F1-R1、F'2-R'2)建立的RPA反应体系和反应条件能够快速准确的检测出FMDV和VSV，而不与另外6种病原体发生非特异性扩增，表明该检测方法特异性高、通用性好。

4.检测灵敏度

为了考察本发明针对FMDV和VSV建立的双重RPA检测方法的灵敏度，用nanodrop2000超微量分光光度计测得人工合成的基因模板浓度(FMDV：79.5ng/μL；VSV：75.5ng/μL)，将其进行10倍梯度稀释后作为模板，按照“1.引物设计与筛选”中筛选出的引物组(F1-R1、F'2-R'2)，以及“2.FMDV和VSV的双重RPA检测方法建立”中的双重RPA反应体系及最佳反应温度和时间进行RPA扩增，反应结束后将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图7所示。从图7可知，以上建立的双重RPA检测方法的最低检测限为1×10^-4ng/μL。

5.检测应用

由于FMDV和VSV均属于急性人兽共患传染病，且FMDV被OIE列为A类动物传染病，因此目前尚未进行实际样品的实验室检测。但是，只要采集水泡皮、水泡液、血清等常规样品，采用Trizol法提取总RNA，以反转录得到的cDNA为模板，建立反应体系，结合最佳反应条件和时间即可进行检测。考虑到前述灵敏度、特异性的实验结果，可以预期本发明针对FMDV和VSV的双重RPA检测的可行性(检测结果的判读如下)。

RPA扩增产物检测结果判读：使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，检测结果中若出现331bp条带，则待测样品来自感染FMDV的个体；若出现260bp条带，则待测样品来自感染VSV的个体；若同时出现331bp和260bp条带，则待测样品来自同时感染FMDV和VSV的个体；若无条带出现，则待测样品来自没有感染FMDV和VSV的个体。

6.本发明的优点

(1)本发明检测FMDV和VSV的方法操作简单，不需要昂贵复杂的仪器设备，可用于样本采集现场或实验室快速检测。

(2)本发明可以在一个反应体系内同时检测出FMDV和VSV，显著缩短了病原体检测时间、提高检测效率且节约了成本，具有良好的应用前景。

(3)本发明的RPA检测引物组是针对FMDV和VSV保守基因序列设计，利用该引物组对BVDV、BCoV、BRV、BPIV-3、BRSV、BHV进行检测，均未扩增出条带，表明引物组的特异性强。

(4)本发明对FMDV和VSV的检测灵敏度高，可达到10^-4ng/μL。

(5)本发明的检测结果通过核酸凝胶电泳分析进行判读，通过对RPA引物的筛选以及优化RPA反应体系，提高了检测结果的稳定性，可以同时获得两种病毒的清晰的扩增产物电泳条带，从而在降低检测成本的同时，解决了RPA检测方法稳定性不足的难题，可以有效的控制检测误差。

<110> 西北农林科技大学

<120> 口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒双重RPA检测试剂盒

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<212> DNA

<213> F1

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gtcgacgttt tgcctgttga acacattctt tac 33

<210> 2

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<212> DNA

<213> F2

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ctttacacca ggatgatgat tggcagattt tg 32

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<212> DNA

<213> F3

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cagaaacgtg tgggatgtgg actattcggc c 31

<210> 4

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<212> DNA

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cggcctttga tgctaaccac tgcagcgacg cgatg 35

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<212> DNA

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gtgatgcgtt tgttctcata ggcgtgctcc g 31

<210> 7

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<212> DNA

<213> F'1

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ccaccagagc aaggaatgcc cgacagcctg atgac 35

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<212> DNA

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cttctaagtc tccatattct tccgtcaaaa accc 34

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<212> DNA

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ccatattctt ccgtcaaaaa ccctgccttc 30

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gtcatcaggc tgtcgggcat tccttgctct ggtgg 35

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<212> DNA

<213> R'2

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gtggcggtgc attagtcgtc aatcctccgg tac 33

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<211> 464

<212> DNA

<213> FMDV模板序列

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cccgaggttg aggctgcctt gaagctcatg gagaaaagag aatacaagtt tgcttgtcag 60

accttcctga aggacgagat tcgcccgatg gagaaagtac gtgccggcaa gactcgcatt 120

gtcgacgttt tgcctgttga acacattctt tacaccagga tgatgattgg cagattttgt 180

gcacaaatgc actcaaacaa cggaccgcaa attggctcgg cggtcggttg caatcctgat 240

gttgattggc aaagatttgg cacacatttt gcccagtaca gaaacgtgtg ggatgtggac 300

tattcggcct ttgatgctaa ccactgcagc gacgcgatga acatcatgtt tgaggaggtg 360

tttcgcacag agttcggctt ccacccaaac gctgagtgga ttctgaagac tcttgtgaac 420

acggagcacg cctatgagaa caaacgcatc actgttgagg gcgg 464

<210> 13

<211> 419

<212> DNA

<213> VSV模板序列

<400> 13

cttctaagtc tccatattct tccgtcaaaa accctgcctt ccacttctgg gggcaattga 60

cagctcttct gctcagatcc accagagcaa ggaatgcccg acagcctgat gacattgagt 120

atacatctct tactacagca ggtttgttgt acgcttatgc agtaggatcc tctgctgact 180

tggcacaaca gttttgtgtt ggagataaca aatacactcc agatgatagt accggaggat 240

tgacgactaa tgcaccgcca caaggcagag atgtggtcga atggctcgga tggtttgaag 300

atcaaaacag aaaaccgact cctgatatga tgcagtatgc gaaacgagca gtcatgtcac 360

tgcaaggcct aagagagaag acaattggca agtatgctaa gtcagaattt gacaaatga 419

Claims

1.一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的双重RPA检测引物组，其特征在于：该RPA检测引物组包括口蹄疫病毒反转录本扩增引物对P1以及水泡性口炎病毒反转录本扩增引物对P2；

所述引物对P1的核苷酸序列为：

上游引物F1：5'-GTCGACGTTTTGCCTGTTGAACACATTCTTTAC-3'

下游引物R1：5'-GTGATGCGTTTGTTCTCATAGGCGTGCTCCG-3'；

所述引物对P2的核苷酸序列为：

上游引物F'2：5'-CTTCTAAGTCTCCATATTCTTCCGTCAAAAACCC-3'

下游引物R'2：5'-GTGGCGGTGCATTAGTCGTCAATCCTCCGGTAC-3'。

2.一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒双重RPA检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括RPA检测引物组；所述RPA检测引物组包括口蹄疫病毒反转录本扩增引物对P1以及水泡性口炎病毒反转录本扩增引物对P2；

所述引物对P1的核苷酸序列为：

上游引物F1：5'-GTCGACGTTTTGCCTGTTGAACACATTCTTTAC-3'

下游引物R1：5'-GTGATGCGTTTGTTCTCATAGGCGTGCTCCG-3'；

所述引物对P2的核苷酸序列为：

上游引物F'2：5'-CTTCTAAGTCTCCATATTCTTCCGTCAAAAACCC-3'

下游引物R'2：5'-GTGGCGGTGCATTAGTCGTCAATCCTCCGGTAC-3'。

3.根据权利要求2所述一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒双重RPA检测试剂盒，其特征在于：所述RPA检测引物组中，各引物的工作浓度为5～20μM。

4.根据权利要求3所述一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒双重RPA检测试剂盒，其特征在于：所述RPA检测引物组中，根据引物对扩增片段的大小差异，扩增片段较小的引物对P2在建立的RPA扩增反应体系中的含量大于扩增片段较大的引物对P1在该反应体系中的含量。

5.根据权利要求3所述一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒双重RPA检测试剂盒，其特征在于：所述RPA检测引物组中，F1:R1:F'2:R'2的用量体积比为(1.1～1.2):(1.1～1.2):(1.2～1.3):(1.2～1.3)。

6.一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的双重RPA检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)从采集自待测牛的生物样品中提取RNA，以提取的RNA经反转录得到的cDNA为模板，采用RPA检测引物组在同一个反应体系中进行RPA扩增，得到扩增产物；所述RPA检测引物组包括口蹄疫病毒反转录本扩增引物对P1以及水泡性口炎病毒反转录本扩增引物对P2；

所述引物对P1的核苷酸序列为：

上游引物F1：5'-GTCGACGTTTTGCCTGTTGAACACATTCTTTAC-3'

下游引物R1：5'-GTGATGCGTTTGTTCTCATAGGCGTGCTCCG-3'；

所述引物对P2的核苷酸序列为：

上游引物F'2：5'-CTTCTAAGTCTCCATATTCTTCCGTCAAAAACCC-3'

下游引物R'2：5'-GTGGCGGTGCATTAGTCGTCAATCCTCCGGTAC-3'；

2)将扩增产物进行核酸电泳检测，若电泳结果出现331bp条带，则所述生物样品含有口蹄疫病毒；若电泳结果出现260bp条带，则所述生物样品含有水泡性口炎病毒；若电泳结果同时出现331bp和260bp的两种条带，则所述生物样品同时含有口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒。

7.根据权利要求6所述一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的双重RPA检测方法，其特征在于：所述反应体系包括5～20μM上游引物F1 1.1～1.2μL、5～20μM下游引物R1 1.1～1.2μL、5～20μM上游引物F'2 1.2～1.3μL、5～20μM下游引物R'2 1.2～1.3μL、280mmol/L MgOAc0.5～3μL、RPA缓冲液7～30μL以及≤2μL的模板。

8.根据权利要求7所述一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的双重RPA检测方法，其特征在于：所述反应体系中，模板的含量为30～100ng。

9.根据权利要求6所述一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的双重RPA检测方法，其特征在于：所述RPA扩增的反应条件为：35～40℃扩增20～30min。

10.根据权利要求6所述一种口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的双重RPA检测方法，其特征在于：所述生物样品选自血清、水泡皮或水泡液。