CN112899197A - 复合微生物菌剂及其制备和在饲料添加剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物菌种及其应用，特别是指一种提高饲料转化率，降低粪便氮磷残留的复合微生物菌剂及其制备和在饲料添加剂中的应用。本发明提供了一种由异常威克汉姆酵母、植物乳杆菌以及黑曲霉组成的复合微生物菌剂及其制备方法，本发明所制备的该微生物菌剂对畜禽具有显著的诱食及增重效果，能显著提高饲料的消化率，降低粪便中的氮磷残留，经济和生态效益均十分显著。

Description

复合微生物菌剂及其制备和在饲料添加剂中的应用
技术领域
本发明涉及微生物菌种及其应用，特别是指一种提高饲料转化率，降低粪便氮磷残留的复合微生物菌剂及其制备和在饲料添加剂中的应用。
背景技术
我国是畜禽养殖大国，畜禽养殖产生的大量粪污、臭气等不仅对生态环境带来了巨大压力，也会直接影响畜禽和饲养员的健康。饲料的消化和转化率低是粪便产生量大，粪尿中氮磷残留多的重要原因；粪便中残留的有机物质成为腐败菌滋生的营养来源，造成养殖场环境恶劣、动物免疫力低，最终导致养殖效益不高。因此通过源头减量，即通过提高饲料转化率，降低粪尿中的氮磷残留量是减少养殖场环境氨臭和粪尿处理压力，实现绿色养殖的首要环节。
目前，减少粪尿氮磷残留的方法主要有饲喂低蛋白饲料，添加酶制剂、活菌制剂等。低蛋白饲料大多会影响适口性、进食量，进而影响日增重；添加酶制剂有一定效果，但成本较高；微生物具有十分丰富的酶系统，饲料发酵过程中，由于微生物的代谢作用，伴随着大量的生物转化反应，降低饲料中营养抗性因子，产生微量高活性物质，可以改善动物肠道健康，提高代谢功能。活菌制剂以其具有的促消化、提高机体免疫、降低粪尿氮磷残留、抑制腐败菌滋生等特性受到人们的重视，特别是使用简单、成本低等经济性成为目前研究和应用的热点。
原农业部颁布的《饲料添加剂品种目录》中对于饲料添加剂的类别、名称及适用范围提出了明确要求。
评价饲料或饲料添加剂一般通过饲养对比试验，从饲养天数、净增重、饲料价格、生猪销售价格及耗料量上得到多个数据，如日增重、料肉比、增重成本(即钱肉比)、扣除饲料成本后的增重效益等等。通常为养殖企业普遍接受的是价格便宜、饲料转化率高、生长速度快等直观可见的评价指标，科学评价作为评价饲料或饲料添加剂性能优劣的主要技术指标应为扣除饲料成本后的收益，即扣除饲料成本后的收益越高，产品越好。
申请人检索到的背景技术包括：
申请号为202011026640.1的专利文献中公开了一种饲料添加剂的制备方法及其应用，其主要技术思路是通过米曲霉孢子粉、酿酒酵母菌、干酪乳杆菌、丁酸梭菌多菌种组合异步发酵，并控制一定的发酵条件得到，发酵过程历期25-30天。按照4％的添加量添加至饲料中应用于猪育肥，受试动物平均日增重596g/头/天，该文献中未对粪尿氮磷残留进行说明。
申请号为202010960093.8的专利文献中公开了一种保育猪用生物发酵饲料添加剂及其制备、使用方法，其主要技术思路是由豆粕、米糠或水稻壳粉、玉米胚芽饼或玉米胚芽粕、蔗糖糖蜜和干酪乳杆菌与酿酒酵母菌组合海藻发酵液发酵制成，饲料试验结果表明，受试动物平均日增重最低为0.500kg/头/天、最高达到0.519kg/头/天，平均日采食量最低为0.784kg/头/天、最高达到0.800kg/头/天，料肉比最高为1.587、最低达到1.522，该文献中未对粪尿氮磷残留进行说明。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种复合微生物菌剂。
其中含有如下固体原菌粉质量份数的原料：
异常威克汉姆酵母或含有其的发酵液 15～28；
植物乳杆菌或含有其的发酵液 15～32；
黑曲霉或含有其的发酵液 5～15；
所述的复合微生物菌剂中异常威克汉姆酵母活菌数＞1×108cfu/g，黑曲霉活菌数＞1×108cfu/g，植物乳杆菌活菌数＞2×109cfu/g；异常威克汉姆酵母的拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus，保藏编号为CGMCC No.20654；植物乳杆菌的拉丁文名称为lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.20656；黑曲霉的拉丁文名称为Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC No.3.1454。
本发明中的菌种——异常威克汉姆酵母是从生猪养殖粪污中分离获得的，该菌株于2020年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，保藏编号CGMCC No.20654，保藏机构地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(简称CGMCC)。
该菌种的菌落形态及生理生化特性如下：
该菌株在在YPD培养基平皿上培养，菌落形态呈圆屋顶状，灰白色，不透明，表面平滑，边缘较整齐，粘稠；单细胞为椭圆形或纺锤形，个体大，单一或聚集分布，菌株的生理生化特征如表1，通过菌株形态学特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析，该菌株被鉴定为异常威克汉姆酵母菌，其拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus。
菌株的生长特征如下：
拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus的异常威克汉姆酵母CGMCC No.20654，可以在20℃～40℃下生长，最适温度为28～35℃，兼性厌氧，最适的pH为6.0～6.5。整个生长周期中延迟期特别短，增殖速度快，能快速进入对数期(6～30小时)，培养30小时后进入稳定期(30～54小时)，培养到54小时后逐渐进入衰退期。
表1异常威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces anomalus)的生理生化实验
项目 结果 项目 结果
糖发酵 麦芽糖 +
葡萄糖 + 蔗糖 +
麦芽糖 + 乳糖 -
蔗糖 + 淀粉 +
乳糖 - 蜜二糖 -
半乳糖 + 棉籽糖 +
蜜二糖 - 假菌丝 无
棉籽糖 + 类淀粉化合物 -
碳源同化实验 硝酸盐 +
阿拉伯糖 - 气味 浓郁果香味
注：“+”表示阳性或生长；“-”表示不生长或阴性。
该菌株的筛选方法如下：
1、菌株的分离
将采集的样品各取10g，放入到含有灭菌玻璃珠和50ml生理盐水的三角瓶中，于30℃、160转/分钟的转速下震荡2小时，静置20分钟，取上清液1ml，用无菌水稀释成10～4～10～6等不同浓度梯度，吸取不同稀释度悬液100μl涂布在YPD琼脂培养基上，30℃培养48小时，离出酵母菌47株。
2.菌株的初筛
取10mL NH3选择性培养基装于PA瓶中，高压灭菌后注入10μL体积百分比浓度为25％的氨水，将分离得到的菌株接种至培养基，在摇床上30℃、160转/分钟培养48小时，按体积百分比为3％接种量接种至PA瓶中，于30℃、160转/分钟摇床上恒温培养，观察菌液变化，若菌液浑浊表明该菌株具有利用NH3的能力。
3.菌株的复筛
通过测定氨气释放量的变化进行菌株的复筛，取200g新鲜猪粪置于体积为1L的锥形瓶中，将初选的菌株接种于YPD液体培养基培养，按猪粪质量的10％加入锥形瓶中，用保鲜膜密封后，置于30℃恒温培养箱中发酵培养3天。对照组加入等量灭菌培养基，每个处理重复3次。用气体检测仪测定NH3的释放量。
最终选得除臭效果最好的菌株Y21，对其进行进一步的鉴定。
本发明中的菌种——植物乳杆菌是从肉牛养殖场玉米秸秆青贮饲料中筛选得到，该菌株于2020年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，保藏编号CGMCC No.20656，保藏机构地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(简称CGMCC)。
该菌种的菌落形态及生长特性如下：
在MRS固体培养基上生长菌落形态为圆形，稍凸起，乳白色，菌落微小，不透明，表面光滑易挑起；单细胞呈杆状，两端圆形，无芽孢，呈单一或链状排列菌株的生理生化特征如表2，通过菌株形态学特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析，该菌株被鉴定为植物乳杆菌，其拉丁文名称为lactobacil lus plantarum。
菌株的生长特征如下：
拉丁文名称为lactobacillus plantarum的植物乳杆菌CGMCC No.20656，可以在20℃～40℃下生长，最适温度为32～40℃，兼性厌氧，最适的pH为6.0～6.5。整个生长周期中延迟期特别短，增殖速度快，能快速进入对数期(6～36小时)，培养36小时后进入稳定期(36～60小时)，培养到60小时时未见衰退期。
表2植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)的生理生化实验
项目 结果 项目 结果
革兰氏 + 蜜二糖 +
葡萄糖 + 甘露糖 +
麦芽糖 + 甘露醇 －
阿拉伯糖 + 甲基红 +
果糖 + 葡萄糖产酸 +
半乳糖 + 葡萄糖产气 －
乳糖 + 明胶液化 －
蔗糖 + 吲哚试验 －
淀粉水解 － 硝酸盐 －
产H<sub>2</sub>S －
本发明中的菌种——黑曲霉Aspergillus niger CGMCC No.3.1454系申请人自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)购入。
本发明的目的之二是提供复合微生物菌剂的制备方法。
复合微生物菌剂的制备方法是是将拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus、保藏编号为CGMCC No.20654的异常威克汉姆酵母，拉丁文名称为lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.20656的植物乳杆菌，以及拉丁文名称为Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC No.3.1454的黑曲霉接种于灭菌后且含有碳源、氮源及无机盐的培养基中进行通气培养制成复合微生物菌剂。
复合微生物菌剂的制备方法，包括如下工艺步骤：
(1)分别将拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus、保藏编号为CGMCCNo.20654的异常威克汉姆酵母，拉丁文名称为lactobacillus plant arum，保藏编号为CGMCC No.20656的植物乳杆菌，以及拉丁文名称为Aspergillus niger，保藏编号为CGMCCNo.3.1454的黑曲霉接种至液体培养基中进行培养，离心收集获得菌体，混合得复合微生物菌体；
(2)将麸皮、豆粕和红糖混合后制成发酵培养基；
(3)将步骤(1)所得的复合微生物菌体按照接种量为1％～5％的比例接种至步骤(2)所得的发酵培养基中，用无菌水调节发酵培养基的含水率至50％～60％，在温度为25℃～35℃的条件下密闭发酵3～5天，得到饲用的复合微生物菌剂。
所述的步骤(1)中培养异常威克汉姆酵母的液体培养基选用YPD培养基，培养黑曲霉的液体培养基选用PDA培养基；培养植物乳杆菌的液体培养基选用MRS培养基，异常威克汉姆酵母菌的培养条件为：温度28℃～35℃，转速为150～200转/分钟，摇床培养36～48小时；植物乳杆菌的培养条件为：温度32℃～38℃，转速为150～200转/分钟，摇床培养24～36小时；黑曲霉的培养条件为：温度25℃～30℃，转速为180～220转/分钟，摇床培养96～108小时。
申请人需要说明的是，YPD、PDA、MRS均为工业中常见的基础培养基，其中YPD培养基的成分为酵母抽提物10.0g、葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g、蒸馏水1000mL；MRS培养基的成分为蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g，蒸馏水1000mL；PDA培养基采用如下方法制备：200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL，煮沸30分钟，纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容至1000mL。
所述的步骤(1)中离心收集获得的菌体按照异常威克汉姆酵母CGMCC No.20654：植物乳杆菌CGMCC No.2065：黑曲霉CGMCC No.3.1454的质量比＝15：16：7的比例混合。
步骤(2)中的发酵培养基含有如下单位质量份的原料：
麸皮 2～4；豆粕 1～2；红糖 不超过1。
本发明的目的之三是提供复合微生物菌剂在制备饲料添加剂中的应用。
复合微生物菌剂在饲料中添加的质量百分比为2％～12％。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明中选用的菌种在《饲料添加剂品种目录》中，且符合目录中对于饲料添加剂的类别、名称及适用范围要求。
2、本发明所提供的复合菌剂是一种由多菌种构成的菌剂，与麸皮、豆粕和红糖混合发酵后，适口性好，发酵产物具有较为浓郁的香气和适中的醇酸气味，添加到饲料中对猪有显著的诱食及增重效果。经申请人试验，28天受试动物的日均耗料量可达2.50～2.61Kg/头，日均增重可达0.976～1.031Kg/头，料肉比可达2.47～2.63。
3、本发明所提供的复合微生物菌剂中还富含纤维素酶、蛋白酶等消化酶类，能显著提高饲料的消化率及转化率，在不降低饲料中蛋白含量的同时创造性地通过降低粪便中的氮磷残留实现了源头治理，能调整肠道菌群结构，抑制腐败菌的生长，预防腐败发酵，减少臭味产生。经申请人试验，饲喂添加本发明饲料添加剂的饲料28天后受试动物的粪便氮、磷排泄量较对照组分别减少10.03％～13.45％，6.05％～9.00％。结果表明，在育肥猪日粮中添加本发明制备的复合菌剂，可明显减少育肥猪粪便中的氮磷残留量。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据本发明的说明书所做出的等效手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
复合微生物菌剂，其中含有如下固体原菌粉质量份数的原料：
异常威克汉姆酵母或含有其的发酵液 15；
植物乳杆菌或含有其的发酵液 15；
黑曲霉或含有其的发酵液 5；
所述的复合微生物菌剂中异常威克汉姆酵母活菌数＞1×108cfu/g，黑曲霉活菌数＞1×108cfu/g，植物乳杆菌活菌数＞2×109cfu/g；异常威克汉姆酵母的拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus，保藏编号为CGMCC No.20654；植物乳杆菌的拉丁文名称为lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.20656；黑曲霉的拉丁文名称为Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC No.3.1454。
复合微生物菌剂的制备方法，是将拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus、保藏编号为CGMCC No.20654的异常威克汉姆酵母，拉丁文名称为lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.20656的植物乳杆菌，以及拉丁文名称为Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC No.3.1454的黑曲霉接种于灭菌后且含有碳源、氮源及无机盐的培养基中进行通气培养制成复合微生物菌剂。
复合微生物菌剂的制备方法包括如下工艺步骤：
(1)分别将拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus、保藏编号为CGMCCNo.20654的异常威克汉姆酵母，拉丁文名称为lactobacillus plant arum，保藏编号为CGMCC No.20656的植物乳杆菌，以及拉丁文名称为Asper gillus niger，保藏编号为CGMCCNo.3.1454的黑曲霉接种至液体培养基中进行培养，离心收集获得菌体，混合得复合微生物菌体；
(2)将麸皮、豆粕和红糖混合后制成发酵培养基；
(3)将步骤(1)所得的复合微生物菌体按照接种量为1％的比例接种至步骤(2)所得的发酵培养基中，用无菌水调节发酵培养基的含水率至50％，在温度为25℃的条件下密闭发酵5天，得到饲用的复合微生物菌剂。
所述的步骤(1)中培养异常威克汉姆酵母的液体培养基选用YPD培养基，培养黑曲霉的液体培养基选用PDA培养基；培养植物乳杆菌的液体培养基选用MRS培养基，异常威克汉姆酵母菌的培养条件为：温度28℃，转速为150转/分钟，摇床培养48小时；植物乳杆菌的培养条件为：温度32℃，转速为150转/分钟，摇床培养36小时；黑曲霉的培养条件为：温度25℃，转速为180转/分钟，摇床培养108小时。
步骤(1)中离心收集获得的菌体按照异常威克汉姆酵母CGMCC No.20654：植物乳杆菌CGMCC No.2065：黑曲霉CGMCC No.3.1454的质量比＝15：16：7的比例混合。
步骤(2)中的发酵培养基含有如下单位质量份的原料：
麸皮 2；豆粕 1；红糖 0.01。
复合微生物菌剂在饲料中添加的质量百分比为2％。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
复合微生物菌剂，其中含有如下固体原菌粉质量份数的原料：
异常威克汉姆酵母或含有其的发酵液 28；
植物乳杆菌或含有其的发酵液 32；
黑曲霉或含有其的发酵液 15；
复合微生物菌剂的制备方法包括如下工艺步骤：
(1)分别将拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus、保藏编号为CGMCCNo.20654的异常威克汉姆酵母，拉丁文名称为lactobacillus plant arum，保藏编号为CGMCC No.20656的植物乳杆菌，以及拉丁文名称为Asper gillus niger，保藏编号为CGMCCNo.3.1454的黑曲霉接种至液体培养基中进行培养，离心收集获得菌体，混合得复合微生物菌体；
(2)将麸皮、豆粕和红糖混合后制成发酵培养基；
(3)将步骤(1)所得的复合微生物菌体按照接种量为5％的比例接种至步骤(2)所得的发酵培养基中，用无菌水调节发酵培养基的含水率至60％，在温度为35℃的条件下密闭发酵3天，得到饲用的复合微生物菌剂。
所述的步骤(1)异常威克汉姆酵母菌的培养条件为：温度35℃，转速为200转/分钟，摇床培养36小时；植物乳杆菌的培养条件为：温度38℃，转速为200转/分钟，摇床培养24小时；黑曲霉的培养条件为：温度30℃，转速为220转/分钟，摇床培养96小时。
步骤(2)中的发酵培养基含有如下单位质量份的原料：
麸皮 4；豆粕 2；红糖 0.98。
复合微生物菌剂在饲料中添加的质量百分比为12％。
其余内容同实施例1。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
复合微生物菌剂，其中含有如下固体原菌粉质量份数的原料：
异常威克汉姆酵母或含有其的发酵液 21；
植物乳杆菌或含有其的发酵液 24；
黑曲霉或含有其的发酵液 10；
复合微生物菌剂的制备方法包括如下工艺步骤：
(1)分别将拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus、保藏编号为CGMCCNo.20654的异常威克汉姆酵母，拉丁文名称为lactobacillus plant arum，保藏编号为CGMCC No.20656的植物乳杆菌，以及拉丁文名称为Asper gillus niger，保藏编号为CGMCCNo.3.1454的黑曲霉接种至液体培养基中进行培养，离心收集获得菌体，混合得复合微生物菌体；
(2)将麸皮、豆粕和红糖混合后制成发酵培养基；
(3)将步骤(1)所得的复合微生物菌体按照接种量为3％的比例接种至步骤(2)所得的发酵培养基中，用无菌水调节发酵培养基的含水率至55％，在温度为30℃的条件下密闭发酵4天，得到饲用的复合微生物菌剂。
所述的步骤(1)异常威克汉姆酵母菌的培养条件为：温度31℃，转速为180转/分钟，摇床培养42小时；植物乳杆菌的培养条件为：温度35℃，转速为180转/分钟，摇床培养30小时；黑曲霉的培养条件为：温度28℃，转速为200转/分钟，摇床培养102小时。
步骤(2)中的发酵培养基含有如下单位质量份的原料：
麸皮 3；豆粕 1.5；红糖 0.5。
复合微生物菌剂在饲料中添加的质量百分比为7％。
其余内容同实施例1。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
复合微生物菌剂，其中含有如下固体原菌粉质量份数的原料：
异常威克汉姆酵母或含有其的发酵液 17；
植物乳杆菌或含有其的发酵液 18；
黑曲霉或含有其的发酵液 6；
复合微生物菌剂的制备方法包括如下工艺步骤：
(1)分别将拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus、保藏编号为CGMCCNo.20654的异常威克汉姆酵母，拉丁文名称为lactobacillus plant arum，保藏编号为CGMCC No.20656的植物乳杆菌，以及拉丁文名称为Asper gillus niger，保藏编号为CGMCCNo.3.1454的黑曲霉接种至液体培养基中进行培养，离心收集获得菌体，混合得复合微生物菌体；
(2)将麸皮、豆粕和红糖混合后制成发酵培养基；
(3)将步骤(1)所得的复合微生物菌体按照接种量为2％的比例接种至步骤(2)所得的发酵培养基中，用无菌水调节发酵培养基的含水率至52％，在温度为28℃的条件下密闭发酵4.5天，得到饲用的复合微生物菌剂。
所述的步骤(1)异常威克汉姆酵母菌的培养条件为：温度29℃，转速为170转/分钟，摇床培养46小时；植物乳杆菌的培养条件为：温度33℃，转速为170转/分钟，摇床培养33小时；黑曲霉的培养条件为：温度26℃，转速为190转/分钟，摇床培养106小时。
步骤(2)中的发酵培养基含有如下单位质量份的原料：
麸皮 2.5；豆粕 1.2；红糖 0.3。
复合微生物菌剂在饲料中添加的质量百分比为4.5％。
其余内容同实施例1。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
复合微生物菌剂，其中含有如下固体原菌粉质量份数的原料：
异常威克汉姆酵母或含有其的发酵液 26；
植物乳杆菌或含有其的发酵液 30；
黑曲霉或含有其的发酵液 12；
复合微生物菌剂的制备方法包括如下工艺步骤：
(1)分别将拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus、保藏编号为CGMCCNo.20654的异常威克汉姆酵母，拉丁文名称为lactobacillus plant arum，保藏编号为CGMCC No.20656的植物乳杆菌，以及拉丁文名称为Asper gillus niger，保藏编号为CGMCCNo.3.1454的黑曲霉接种至液体培养基中进行培养，离心收集获得菌体，混合得复合微生物菌体；
(2)将麸皮、豆粕和红糖混合后制成发酵培养基；
(3)将步骤(1)所得的复合微生物菌体按照接种量为4％的比例接种至步骤(2)所得的发酵培养基中，用无菌水调节发酵培养基的含水率至58％，在温度为33℃的条件下密闭发酵3.5天，得到饲用的复合微生物菌剂。
所述的步骤(1)异常威克汉姆酵母菌的培养条件为：温度33℃，转速为190转/分钟，摇床培养38小时；植物乳杆菌的培养条件为：温度36℃，转速为180转/分钟，摇床培养28小时；黑曲霉的培养条件为：温度28℃，转速为210转/分钟，摇床培养98小时。
步骤(2)中的发酵培养基含有如下单位质量份的原料：
麸皮3.5；豆粕1.8；红糖0.7。
复合微生物菌剂在饲料中添加的质量百分比为9.5％。
其余内容同实施例1。
为验证本发明中的复合微生物菌剂添加至饲料中对于猪的育肥、减少粪便中总氮和总磷残留等技术效果，申请人设计并进行了如下试验：
一、生产性能指标测定
1、试验时间：2019年12月；
2、试验场所：河北省辛集市某养殖公司猪场；
3、试验器材：实施例1～5制备的含有复合微生物菌剂的饲料，称重设备；
4、试验过程：平均气温20℃，实验周期28天。育肥猪共120头，体重约50Kg，随机分成6组，每组20头。其中试验组1～5分别饲喂对应添加实施例1～5所制备的含有复合微生物菌剂的饲料，对照组饲喂常规饲料。饲喂管理按照自由采食方法进行，提供充足清洁饮水，每天一次猪舍清扫。试验开始前7天为预饲期，在试验开始和结束时早晨空腹个体称重，计算每头猪的日增重、日耗料量和料肉比；
5、试验结果如表3；
表3生产性能指标测定结果
项目 对照组 试验组1 试验组2 试验组3 试验组4 试验组5
猪头数 20 20 20 20 20 20
试验前平均体重(Kg/头) 53.25 52.83 51.27 48.39 49.98 50.70
饲喂后平均体重(Kg/头) 74.45 79.33 79.21 76.24 78.71 79.57
平均日增重(Kg/头/天) 0.757 0.946 0.998 0.995 1.026 1.031
总耗料量(Kg) 1352 1403 1412 1462 1445 1428
平均日耗料量(Kg/头/天) 2.41 2.50 2.52 2.61 2.58 2.55
料肉比 3.19 2.65 2.53 2.63 2.51 2.47
6、试验结论
由表3的数据可知，实施例1～5制备得到的饲料添加剂具有很好的诱食性，能够有效提高育肥猪的采食量，同时在促进猪生长方面也有着显著的效果,生长速度更快，料肉比明显降低。
二、粪便中总氮和总磷残留比较
1、试验时间：2019年12月；
2、试验场所：河北省辛集市某养殖公司猪场；
3、试验器材：实施例1～5制备的含有复合微生物菌剂的饲料，粪便采集设备；
4、试验过程：在河北省辛集市某养殖公司猪场进行。平均气温20℃，实验周期28天。育肥猪共120头，随机分成6组，每组20头。其中试验组1～5分别饲喂实施例1～5所制备的含有复合微生物菌剂的饲料，对照组饲喂常规饲料。饲喂管理按照自由采食方法进行，提供充足清洁饮水，每天一次猪舍清扫。试验开始前七天为预饲期，在试验的第26、27、28天连续3天，在每天早晨喂料前，每组取约300g新鲜粪便用于检测粪便中全氮和总磷残留量；
5、试验结果如表4；
表4粪便中氮、磷排泄量
对照组 试验组1 试验组2 试验组3 试验组4 试验组5
氮排泄量(g/天/头) 11.95 10.35 10.46 10.75 10.71 10.40
磷排泄量(g/天/头) 4.14 3.79 3.80 3.89 3.86 3.77
氮减排率(％) - 13.45 12.51 10.03 10.39 12.97
磷减排率(％) - 8.46 8.15 6.05 6.69 9.00
某养分减排率＝(对照组某养分排泄量-试验组某养分排泄量)÷对照组某养分排泄量×100％
6、试验结论
由表4的数据可知，在育肥猪日粮中采用实施例1～5所制备的含有复合微生物菌剂的饲料可有效减少育肥猪粪便中的氮磷含量,增加了生猪养殖的生态效益。

Claims (8)

1.复合微生物菌剂，其特征在于其中含有如下固体原菌粉质量份数的原料：
异常威克汉姆酵母或含有其的发酵液 15～28；
植物乳杆菌或含有其的发酵液 15～32；
黑曲霉或含有其的发酵液 5～15；
所述的复合微生物菌剂中异常威克汉姆酵母活菌数＞1×108cfu/g，黑曲霉活菌数＞1×108cfu/g，植物乳杆菌活菌数＞2×109cfu/g；异常威克汉姆酵母的拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus，保藏编号为CGMCC No.20654；植物乳杆菌的拉丁文名称为lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.20656；黑曲霉的拉丁文名称为Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC No.3.1454。
2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于是将拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus、保藏编号为CGMCC No.20654的异常威克汉姆酵母，拉丁文名称为lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.20656的植物乳杆菌，以及拉丁文名称为Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC No.3.1454的黑曲霉接种于灭菌后且含有碳源、氮源及无机盐的培养基中进行通气培养制成复合微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
(1)分别将拉丁文名称为Wickerhamomyces anomalus、保藏编号为CGMCC No.20654的异常威克汉姆酵母，拉丁文名称为lactobacillus plant arum，保藏编号为CGMCCNo.20656的植物乳杆菌，以及拉丁文名称为Asper gillus niger，保藏编号为CGMCCNo.3.1454的黑曲霉接种至液体培养基中进行培养，离心收集获得菌体，混合得复合微生物菌体；
(2)将麸皮、豆粕和红糖混合后制成发酵培养基；
(3)将步骤(1)所得的复合微生物菌体按照接种量为1％～5％的比例接种至步骤(2)所得的发酵培养基中，用无菌水调节发酵培养基的含水率至50％～60％，在温度为25℃～35℃的条件下密闭发酵3～5天，得到饲用的复合微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中培养异常威克汉姆酵母的液体培养基选用YPD培养基，培养黑曲霉的液体培养基选用PDA培养基，培养植物乳杆菌的液体培养基选用MRS培养基，异常威克汉姆酵母菌的培养条件为：温度28℃～35℃，转速为150～200转/分钟，摇床培养36～48小时；植物乳杆菌的培养条件为：温度32℃～38℃，转速为150～200转/分钟，摇床培养24～36小时；黑曲霉的培养条件为：温度25℃～30℃，转速为180～220转/分钟，摇床培养96～108小时。
5.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中离心收集获得的菌体按照异常威克汉姆酵母CGMCC No.20654：植物乳杆菌CGMCC No.2065：黑曲霉CGMCC No.3.1454的质量比＝15：16：7的比例混合。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中的发酵培养基含有如下单位质量份的原料：
麸皮2～4；豆粕1～2；红糖不超过1。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的复合微生物菌剂在制备饲料添加剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的复合微生物菌剂在制备饲料添加剂中的应用，其特征在于复合微生物菌剂在饲料中添加的质量百分比为2％～12％。
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