CN112899165A - 一种高密度贴壁细胞培养体系的细胞接种方式 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高密度贴壁细胞培养体系的细胞接种方式，包括一种“种子罐”固定床生物反应器，其内部填充有多层载体的柱形固定床生物反应器；以及细胞种子液的培养方法及其消化方法。利用本发明所述的细胞培养体系，能使用小型的生物反应系统制备大规模的细胞种子液，具有细胞悬液产量高，制备时间短，细胞状态好，工作量小，污染风险小等显著优点。
Description
技术领域
本发明属于细胞操作，具体地，本发明涉及一种高密度贴壁细胞培养体系的细胞接种方式。
背景技术
常见的高密度贴壁细胞生物反应器是“兜篮”式或“固定床”式生物反应器，在反应罐中部，有不锈钢或塑料筛网组成的“兜篮”或“固定床”，内置片状载体，细胞接种后，贴壁在片状载体上贴壁生长培养液、气体通过筛网在“兜篮”内外交换。由于难以掌握消化液的用法这一技术限制，此类反应器培养前的种子细胞制备通常使用规模较小、培养方式简单的细胞方瓶、多层瓶、滚瓶、细胞工厂等基础性贴壁培养容器，细胞在基础性培养容器中长满后，利用消化液把细胞制备成悬液，收集合并，接入生物反应器内，扩大培养。但随着生物制造产业化规模要求，生物反应器规模逐步放大，超大规模的贴壁细胞生物反应器需要更大量的细胞种子(总量约5×1010-1×1011个)，相当于1000-2000个175cm2的细胞培养瓶长满后的产量，制备这么大规模的细胞种子液，要有20-30人规模的熟练制备人员同时操作，在尽可能短的时间内完成，要面对污染、消化过度、细胞活性受损等风险，所以大规模贴壁细胞种子细胞制备渐渐成为行业内关注的难题。
因此，本领域急需一种高效的易操作的制备大规模细胞种子液的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的易操作的制备大规模细胞种子液的制备方法。
本发明的第一方面提供了一种“种子罐”固定床生物反应器的用途，其特征在于，用于制备大规模的细胞种子液，所述固定床生物反应器包括以下元件：
(a)整体封闭而内部多层连通的固定床生物培养空间；(b)物质交换模块，包括培养空间内外气体交换、培养液进出以及消化液添加通道；(c)环境调控模块，包括温度调控元件、Ph调控元件、O2/CO2浓度调控元件、和培养液浊度检测传感器；以及任选的(d)搅拌模块和/或(e)监控数据导出模块。
在另一优选例中，所述固定床生物反应器培养空间的内表面积为1-10m2，优选地为3-5m2。
在另一优选例中，所述固定床生物反应器的内部载体的表面积为1-10m2；优选地，为2.5-8m2。
在另一优选例中，所述固定床生物反应器的内部载体的表面积为4m2。
在另一优选例中，所述固定床生物反应器的工作液体积为0.5-2L；优选地，为0.8-1L。
在另一优选例中，所述环境调控模块按照设定的时间序列模式检测培养空间及培养液的环境数据。
在另一优选例中，所述时间序列模式包括等距时间模式以及自定义时间模式。
在另一优选例中，所述等距时间模式包括时间间隔为12-24小时,优选为4-6小时,更优为0.5-1小时，最优为1分钟。
在本发明的第二方面提供了一种“种子罐”培养系统，其特征在于，所述培养系统包括以下组件：
(l)如第一方面所述的固定床生物反应器；(m)一种优化的消化液；以及(n)所述消化液(m)的使用方法。
在另一优选例中，所述的培养系统还包括(o)细胞培养液。
在另一优选例中，所述的消化液为磷酸缓冲液稀释的无动物源性细胞消化液。
在另一优选例中，所述的消化液的磷酸缓冲液稀释倍数为1-10倍，优选地为2-5倍。
在另一优选例中，所述的消化液为动物源性细胞消化液。
在另一优选例中，所述的动物源性细胞消化液的成分为Trypsin干粉、螯合剂以及基础培养液。
在另一优选例中，所述的基础培养液为(o)细胞培养液。
在另一优选例中，所述的细胞消化液的终Ph值为5.3-7.8，优选地为6.0-7.0。
在另一优选例中，所述的动物源性细胞消化液不含血清。
在另一优选例中，所述的螯合剂选自：金属螯合剂。
在另一优选例中，所述的螯合剂为乙二胺四乙酸二钠。
在另一优选例中，所述的Trypsin干粉的浓度为1-10wt％，优选为2.5-5wt％。
在另一优选例中，所述的螯合剂的浓度为0.5-5wt％，优选为1-3wt％，更优选为2wt％。
在另一优选例中，所述的消化液(m)的使用方法，包括以下步骤：
(n1)在固定床生物反应器(l)中培养细胞，当细胞汇合度为60-90％(面积分数)时，放空其中的液体，得到长满细胞的空固定床生物反应器(l)；(n2)往空固定床生物反应器中导入原液体同体积的消化液(m’)；以及(n3)通过固定床生物反应器(l)的培养浊度检测传感器监测，待消化液(m’)出现浑浊后，终止消化，得到细胞种子液。
在另一优选例中，所述的细胞在固定床生物反应器(l)中贴壁生长。
在另一优选例中，所述的细胞为真核细胞。
在另一优选例中，所述的细胞来自于人、和/或非人哺乳细胞。
在另一优选例中，所述的细胞为HEK293细胞。
在另一优选例中，在固定床生物反应器(l)中培养细胞的初始细胞量为1-5×109个，优选为1.2-3×109个。
在另一优选例中，所述的终止消化指把浑浊的细胞悬液(m’)加入完全培养液中。
在另一优选例中，所述的浑浊的细胞悬液体积为每1L原始工作液获得细胞悬液500-900ml，优选地为800ml。
在另一优选例中，所述的完全培养液为含有血清的培养液。
在另一优选例中，所述的终止消化指把浑浊的细胞悬液(m’)用无菌导管导入含完全培养液的扩增罐内。
在另一优选例中，所述的消化液(m’)出现浑浊指的是，贴壁细胞被降解后悬浮于细胞悬液内。
在另一优选例中，所述进行步骤(n2)之前，加入磷酸缓冲液润洗，再放空磷酸缓冲液。
在另一优选例中，所述进行步骤(n2)之前，加入预热过的原液体同体积的磷酸缓冲液润洗，再放空磷酸缓冲液。
在另一优选例中，所述使用方法还包括步骤：
(n4)用消化液(m”)润洗，重复1、2、3、4、或5次，优选地重复至固定床生物反应器(l)内细胞被完全消化。
在另一优选例中，所述的细胞被完全消化指的是，固定床生物反应器(l)内的活细胞数量低于1×105个/ml细胞。
在另一优选例中，所述的细胞被完全消化指的是，在可见光波长范围内的条件下对比吸光度，以空白培养液为对照其吸光度为m0，细胞润洗液(m”)吸光度为m1，m1/m0的比值在0-0.1的范围内。
在另一优选例中，所述终止消化的判断方法包括细胞计数法、浊度测定法以及目测法。
在本发明的第三方面提供了一种细胞生产体系，其步骤包括以下：
(1)提供种子罐上罐细胞；
(2)将步骤(1)所得的上罐细胞使用如第二方面所述的培养系统培养，获得细胞种子液；和
(3)将步骤(2)所得的细胞种子液转入扩增管中进行大规模扩增。
在另一优选例中，所述种子罐上罐细胞包括：冻存细胞经复苏和初步扩增获得的细胞，步骤(2)中获得的细胞，和/或其他方法获得的有扩增活力的细胞。
在另一优选例中，所述细胞生产体系的全程环境为无菌环境。
在另一优选例中，所述细胞生产体系的所用操作为无菌操作。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
本发明的技术方案的优点：
1.本发明在贴壁细胞大规模培养领域，提出“种子罐”概念。
2.本发明使用小型的生物反应系统制备大规模的细胞种子液，有效控制了细胞消化程度和消化后悬液体积，保证了后期细胞大规模培养的顺利进行。
3.本发明细胞悬液产量高，培养设备规模小，生产区域单只面积小，能耗小。
4.本发明制备时间短，细胞状态好；工作量小，污染风险小。
5.本发明提供了一种消化液与消化系统，能高效消化大量细胞种子液，而对细胞的状态影响很小、存活率高、获得率高。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现使用小型的生物反应系统制备大规模的细胞种子液，即提出“种子罐”概念。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语说明
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1wt％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
细胞
本文所述的“细胞”、“细胞株”、“贴壁细胞”、“贴壁依赖性细胞”可以互换，均代指通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。
常用的细胞株包括：104C1转化的豚鼠胎体细胞、143TK人胸腺激酶缺陷性细胞系、1590人乳腺癌细胞系、16HBE人支气管上皮细胞、208F大鼠成纤维细胞、22RV1人前列腺癌细胞、293人胚肾细胞、293A人胚肾细胞系、293AV人胚肾细胞-用于腺病毒包装、A2780 ATCC细胞[人卵巢癌细胞]、293EE转化人胚肾293细胞、293ET ET转化人胚肾293细胞、293FT人胚肾细胞-用于慢病毒包装、A2780 ATCC细胞、293KB KB转化人胚肾293细胞、293T SV40转化的人胚肾上皮细胞、293TN人胚肾细胞--用于慢病毒包装、A2780 ATCC细胞、2B4人前列腺癌细胞、2BS人胚肺成纤维样细胞、2V6.11人胚肾细胞、311果蝇胚胎细胞、A2780 ATCC细胞、3AO人卵巢癌细胞、A2780 ATCC细胞、3T3小鼠胚胎瘤成纤维细胞、3T3-E1鼠胚成骨细胞、3T3-L1小鼠脂肪细胞、3T3-Swiss albino小鼠胚胎成纤维细胞、3T6-Swiss albino小鼠胚胎成纤维细胞、A2780ATCC细胞、4179长尾绿猴胚胎细胞、4647长尾绿猴肾细胞、4T1小鼠乳腺癌细胞、A2780 ATCC细胞、5637人膀胱癌细胞、6T-CEM人T细胞白血病细胞、769-P人肾癌细胞系、786-O人肾透明细胞腺癌细胞、A2780 ATCC细胞、7WCY1.0人APP-PS1双基因转染细胞株(CHO)、7WD10人APP基因转染细胞株(CHO))、7WML6.0人APP-PS1(M146L)双基因转染细胞株(CHO)、7WPS1人APP-PS1双基因转染细胞株(CHO)、801-D人巨细胞性肺癌细胞、810-D人巨细胞性肺癌细胞、95-C人低转移肺癌细胞、A2780 ATCC细胞、95-D人高转移肺癌细胞、973人肺腺癌细胞、9L小鼠胶质瘤细胞、A2780 ATCC细胞、9L-B人前列腺癌细胞、9L-E人前列腺癌细胞、A cc-3人涎腺腺样囊性癌细胞、A172人胶质母细胞瘤细胞、A2780 ATCC细胞、A2人腺样囊性癌细胞、A-204人横纹肌肉瘤、A2780人卵巢癌细胞、A3人T淋巴细胞白血病细胞、A2780ATCC细胞、A-375人恶性黑色素瘤细胞、A375.S2人黑色素瘤细胞、A-431人表皮癌细胞、A2780 ATCC细胞、A498人肾癌细胞、A549人肺腺癌细胞、A549/DDP A549耐药细胞、A2780ATCC细胞、A673人横纹肌癌细胞、A7d野生型人C-KIT受体细胞株、A7r5大鼠胸大动脉平滑肌细胞、A875人黑色素瘤细胞、A2780 ATCC细胞、A9小鼠皮下结缔组织细胞、AAV-293人胚肾细胞、Acc-2人涎腺腺样囊性癌细胞、Acc-3人涎腺腺样囊性癌细胞、A2780 ATCC细胞、ACC-M人唾液腺性肺癌高转移细胞、ACHN人肾癌细胞系、AE-1杂交瘤细胞抗AChE、A2780 ATCC细胞、AE-2杂交瘤细胞抗AChE、AGS人胃腺癌细胞、A2780 ATCC细胞、AL7P/HL-60R原髓细胞白血病细胞、ALAV人前列腺癌细胞、AM人腺样囊性癌细胞(高转移)、AMS3(SCF3)人干细胞因子单克隆抗体细胞株、A2780 ATCC细胞、AN3 CA人子宫内膜腺癌细胞、AnA-1小鼠巨噬细胞、Anglne人卵巢癌细胞系、APP-PS1人APP-PS1双基因转染细胞株(HEK293)、APRE-19人视网膜上皮细胞、AR42J大鼠胰腺外分泌细胞、A2780 ATCC细胞、AsPC-1人转移胰腺腺癌细胞、AtT-20小鼠垂体瘤、AZ-521人胃癌细胞、B16小鼠黑色素瘤细胞、A2780 ATCC细胞、B16BL6小鼠黑色素瘤细胞、B16-F1鼠黑色素瘤细胞系、B16F1小鼠黑色素瘤细胞、B16F10小鼠黑色素瘤高转移细胞、A2780 ATCC细胞、B16-Fo鼠黑色素瘤细胞系、B6YH4杂交瘤细胞支原体阳性、B82鼠细胞系、A2780 ATCC细胞、B95-8绒猴EBV转化的白细胞、BA/F3小鼠原B细胞(B类)、BALB/3T3clone A31小鼠胚胎成纤维细胞、BALL-1人B淋巴细胞急性白血病细胞、A2780 ATCC细胞、BB7.2小鼠杂交瘤B淋巴细胞、BC-1人lymphoma B淋巴细胞、Bcap-37人乳腺癌细胞、A2780ATCC细胞、BE(2)C人神经母细胞瘤细胞、BEAS-2B人正常肺上皮细胞、SW038-C2人脑胶质母细胞瘤细胞、SW038-C2-tk转染了tk基因的SW038-C2细胞、SHG-44人星形胶质细胞瘤细胞、BT-325人神经胶质瘤细胞、U251人星形胶质细胞瘤细胞、SF-295人恶性胶质瘤细胞、SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞、U87人脑胶质瘤细胞。
在本发明的实施例中，使用的细胞株为科学研究常用的细胞株，具体地为HEK293细胞。
贴壁依赖型细胞与贴壁培养
需要贴附到固体介质上才能生存和生长的细胞。大多数动物细胞在培养时，皆需贴壁。从形态上，贴壁依赖性细胞又常分为以下四种细胞：
(1)成纤维型细胞(fibrlblast或mechanocyte type)在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2-3厘米个长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。
(2)上皮型细胞此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有圆形核，细胞紧密相连单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。
(3)游走型细胞本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细腻包形态。常见于羊水细胞培养的早期。细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒清洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。因此对新使用玻璃器皿和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法。
(4)多形性细胞型(polymorphic cell type)除上述三种细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定它们的稳定形态，可统归为多形性细胞型。
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养(瓶)器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
贴壁培养的优点：1.容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。2.容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。3.当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。4.同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。适用于所有类型细胞。
贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比，扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长；传代时需要消化细胞成细胞悬液，而消化程度影响细胞的得率和活性。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
材料与方法
1.材料：
1.1 HEK293细胞：引进于中国典型培养物保藏中心，代数为第35代，为贴壁细胞。按照《中国药典》有关规定，建立了主细胞库和工作细胞库，并规定主细胞库细胞代数不超过42代，工作细胞库代数不超过45代。本实验所用细胞均低于45代。
1.2 DMEM培养基：购于invitrogen公司
1.3胎牛血清：购于维森特公司
1.4HEK293细胞培养用培养基：DMEN+10wt％胎牛血清，其中葡萄糖含量为4.5g/l。
1.5细胞消化液：购于invitrogen公司，非动物源性。
1.6细胞培养瓶：Nunc公司生产，每瓶提供表面积为175cm2。
1.7生物反应器：定制一反应器iCel lis Nane 4m2反应罐(PALL公司)，为自动化控制的全封闭培养体系，顶部由一取样口，在超净台内可无菌取出载体，消化后计数细胞量。在罐体中有一固定床装置，可将一种供细胞贴壁生长需要的片状载体放入其中，四周和上下有小孔用于液体、气体交换，底部有搅拌装置，液体从底部渗透、流穿整个载体床，从顶部涌出，形成瀑布流，与顶部通入的气体交换。
实施例1基础培养阶段
无菌条件下，复苏2支工作细胞，用DMEN+10wt％胎牛血清在表面积为175cm2的细胞培养瓶中培养，培养条件37℃，5wt％CO2，湿度90wt％，长满后用消化液消化降解，待细胞完全从培养瓶底部脱落后，用适量的DMEN+10wt％胎牛血清终止消化，并用吸管吹散，此时细胞处于单个游离状态，按传代比列分装入适量的细胞瓶内，继续培养，传至40瓶(细胞量约4×108个左右)，备用。
实施例2生物反应器阶段
2.1上述细胞长满后用消化液消化降解，待细胞完全从培养瓶底部脱落后，用适量的DMEN+10wt％胎牛血清终止消化，并用吸管吹散，此时细胞处于单个游离状态，把细胞悬液无菌地接入iCellis Nane 4m2反应罐。
2.2接入反应罐的细胞在对应的生物反应器内，以转速1cm/s，37℃，50wt％溶氧值，PH7.30的条件培养。
2.3培养期间，每天从罐内无菌取一片载体，用消化液把生长在载体上的细胞制备成细胞悬液，计数；并从罐内取出培养液，检测葡萄糖含量，计算24小时内的糖耗值。
2.4根据以上细胞计数结果和糖耗检测结果，调整培养液灌注量，保证细胞扩增、维持生长。
2.5培养4-7天，用细胞计数和葡萄糖检测结果判定细胞是否长满，如两项指标达到峰值，准备制备细胞种子液。
2.6除了气体阀门，关闭生物反应器所有控制。以下步骤除了特别注明，都需要无菌操作。
2.7放空反应罐内的培养液(约800ml)。
2.8向反应罐内导入800ml左右的细胞消化液，开启搅拌，体积可略少，但搅拌后必须形成瀑布流，流穿整个载体层。
2.9细胞在消化液的作用下逐步从载体上脱落，反应罐内的消化液逐步浑浊，待罐内细胞悬液浑浊度不在变化时(目测)，用管道导出细胞悬液，进入准备扩增的贴壁培养罐内。
2.10导入培养用培养用的培养液进入种子罐，开启搅拌，对种子罐内载体上残留的细胞进行重悬，待罐内细胞悬液浑浊度不在变化时(目测)，用管道导出细胞悬液，进入准备扩增的贴壁培养罐内。
2.11上述步骤可重复几次，具体次数可根据实际细胞量而定。
2.12种子罐内的细胞全部进入准备扩增的贴壁培养罐内后，再把罐体积补充至工作体积，运行扩增用的生物反应器，开始培养。
以上操作时可在不同时段取样计数活细胞量，用于以后的工艺控制。
实施例3传统培养与种子罐培养
分别利用现有技术使用的单层瓶和本实验提供的种子罐生物反应器，在相同条件下制备5×1010-1×1011个细胞，所需物料、设备、人员对比，如表一所示。
表1
讨论：
以实施例为例，“种子罐”中载体的表面积为4m2，相当于230个175cm2的细胞瓶的面积，但由于增加通气、灌注等手段，加上载体之间的空间延展结构，可生产近5×1010个细胞，产量相当于1000个左右175cm2的细胞瓶产量。即“种子罐”的产生的细胞数量是其他方案在培养面积相同时的5倍。
整个操作过程在一个罐体中进行，操作简单，操作时间是其他方案的1/2-1/3，降低了操作带来的污染的风险；另外，现行的方案中采取培养细胞的工艺是连续性的循环操作，中间有一个环节出现污染，则整个流程就有中止的风险。本发明不需要循环操作过程，污染风险大大降低。
“种子罐”是指固定床生物反应器，内部3-5m2圆柱形固定床内填充8-10cm高度的载体，工作体积0.8-1L。增加通气、灌注、温度控制、pH控制、溶氧控制和搅拌系统；实际占用空间大小、生产区域、能耗是普通培养皿培养方式的十分之一。
该体系在细胞培养过程中可以形成瀑布流，一方面保证培养过程载体中营养液和气体的交换；另一方面在消化操作中使消化液与载体中的细胞充分接触，并将细胞冲刷下来，完成细胞转移。
目前大规模的细胞传代培养放大工艺的难点在于细胞消化操作，本发明的消化工艺得到比较不错的结果。技术难点主要有以下几个方面：
1)消化液浓度(胰酶浓度)的选择。市场上商品化的胰酶在使用时不能安全地消化细胞，达到工艺要求。因此需要自行配制非动物源性的胰酶消化液，采用不同的浓度进行消化，最终得到有效的消化液。
2)消化液的使用量的选择和消化终止时间的判断。选择消化液浓度，使用量两个因素，以细胞状态和细胞数量为衡量标准，进行最优化实验得到最终的消化液使用量。
3)浊度的测定。浊度是判断消化终止和冲洗终止的依据。判断消化终止和冲洗终止的方法包括细胞计数法，浊度测定法等，其中以浊度测定法最为方便快捷；浊度测定法包括目测法，分光光度法等，其中目测法(比色法)对于快速的判断消化终止有利。因此选择目测法的浊度变化来判定消化终止，并建立了分析方法。
消化过程中消化液必须与细胞完全接触才能起到消化作用，常规的细胞基础培养皿(单层瓶、多层瓶、滚瓶、细胞工厂)中，细胞生长在平直的表面，少量的消化液即可完成对细胞的覆盖。而在种子罐内，存在于兜篮或固定床内的片状载体是有空间立体结构的，完全浸没细胞，需要相当种子罐工作体积的消化液数量，该数量与反应罐体积成正比，远远大于培养皿内细胞消化所需用量，给消化过程带来不确定的风险。消化液的绝对数量和浓度决定了本次消化程度，决定了该批次的细胞种子液的活性，直接影响以后的扩大生产。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种“种子罐”固定床生物反应器的用途，其特征在于，用于制备大规模的细胞种子液，所述固定床生物反应器包括以下元件：
(a)整体封闭而内部多层连通的固定床生物培养空间；(b)物质交换模块，包括培养空间内外气体交换、培养液进出以及消化液添加通道；(c)环境调控模块，包括温度调控元件、Ph调控元件、O2/CO2浓度调控元件、和培养液浊度检测传感器；以及任选的(d)搅拌模块和/或(e)监控数据导出模块。
2.如权利要求1所述的用途，所述固定床生物反应器培养空间的内表面积为1-10m2，优选地为3-5m2。
3.一种“种子罐”培养系统，其特征在于，所述培养系统包括以下组件：
(l)如权利要求1所述的固定床生物反应器；(m)一种优化的消化液；以及(n)所述消化液(m)的使用方法。
4.如权利要求3所述的培养系统，所述的培养系统还包括(o)细胞培养液。
5.如权利要求3所述的培养系统，所述的消化液(m)的使用方法，包括以下步骤：
(n1)在固定床生物反应器(l)中培养细胞，当细胞汇合度为60-90％(面积分数)时，放空其中的液体，得到长满细胞的空固定床生物反应器(l)；(n2)往空固定床生物反应器中导入原液体同体积的消化液(m’)；以及(n3)通过固定床生物反应器(l)的培养浊度检测传感器监测，待消化液(m’)出现浑浊后，终止消化，得到细胞种子液。
6.如权利要求5所述的培养系统，所述的细胞在固定床生物反应器(l)中贴壁生长。
7.如权利要求5所述的培养系统，所述的细胞为真核细胞。
8.如权利要求5所述的培养系统，所述的终止消化指把浑浊的细胞悬液(m’)加入完全培养液中。
9.如权利要求8所述的培养系统，所述的消化液(m’)出现浑浊指的是，贴壁细胞被降解后悬浮于细胞悬液内。
10.一种细胞生产体系，其步骤包括以下：
(1)提供种子罐上罐细胞；
(2)将步骤(1)所得的上罐细胞使用如权利要求2所述的培养系统培养，获得细胞种子液；和
(3)将步骤(2)所得的细胞种子液转入扩增管中进行大规模扩增。
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