CN112898450A - 一种根皮素衍生物缓释制剂的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种根皮素衍生物缓释制剂的制备方法及应用；包括：制备的化妆品美白淡斑效果评价和根皮素衍生物缓释制剂对B16细胞内酪氨酸酶活性的测定；本发明的根皮素衍生物缓释制剂室温条件下，pH<3.0，16h内在水中或缓冲液中分解1.52％；5.5≤pH＜7.5的条件下，8h内溶出速率为99.60％，基本分解完毕；本发明的根皮素衍生物缓释制剂，增加了根皮素在水中和缓冲液中的溶解度，提高了根皮素的生物利用率，增强了根皮素在美白方面的应用，显著提高了根皮素的美白效果，达到了长效美白的效果，明显提高了根皮素的经济价值。

Description

一种根皮素衍生物缓释制剂的制备方法及应用
技术领域
本发明属于材料领域，具体涉及一种根皮素衍生物缓释制剂的制备方法及应用。
背景技术
凝胶具有三维网状结构，可吸收大量的水分或体内组织液，因其特殊的性质，水凝胶已被广泛应用于生物医学和化妆品领域。例如Deng的课题组研发出通过“Tetrazole-Alkene”反应得到的原位凝胶；Li的课题组应用席夫碱反应制备了系列淀粉基的原位凝胶；Click反应也是一类常用的制备原位凝胶的化学交联方法，但其所涉及的化学改性通常比较复杂，对聚合物的高分子骨架影响比较大。
人体表皮的基底层细胞中含4～5％的色素细胞。人类皮肤的颜色不是取决于黑色素细胞数量，而是取决于黑色素体的数量、大小、分布及黑素化程度。因此，有些美白成分通过影响黑色素体的形成、成熟及转移来达到美白的效果。
根皮素(Phloretin)学名为2,4,6-三羟基-3-(4-羟基苯基)苯丙酮，是具有二氢查尔酮类结构的黄酮类化合物。大量研究发现根皮素具有明显生物活性，如：抗氧化、抑菌、抑制酪氨酸酶活性、抑制心血管疾病等生理功效；根皮素具有强大的抗氧化活性，对DPPH、ABTS自由基清除能力及抑制脂质过氧化强于Vc；根皮素还是出色的酪氨酸酶抑制剂，因此，根皮素有双重的美白效果。
而目前没有发现有将根皮素或糖基化根皮素与壳聚糖制成根皮素衍生物缓释制剂用在化妆品中，长效发挥根皮素或糖基化根皮素在清除自由基和抗氧化等方面的美白生理功能，达到持久美白的效果。
发明内容
为了解决以上的不足，本发明是通过以下方案实现的。本发明提供了一种根皮素衍生物缓释制剂的制备方法。
本发明所述的根皮素衍生物缓释制剂的结构式，如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0002919363380000011
其中：n为1～10，m＝1～10；R1，R2为烷基或H；R3为Glu，Rha；本发明所述的R为壳聚糖。
所述的根皮素衍生物缓释制剂的结构式(Ⅰ)优选为：其中，n为2～3；m＝2～ 3；R1，R2均为烷基；R3为Glu。
所述的根皮素衍生物缓释制剂的方程式的通式为：
Figure BDA0002919363380000021
本发明所述的根皮素衍生物缓释制剂的制备步骤为：
1)将0.5～3.0g的(Ⅱ)与1.6～12.9g硫酸二甲酯溶解在50～100mL正丁醇溶液中，在55～80℃条件下，磁力搅拌，反应1.0～8.0h，得到黄色固体(Ⅱ-1)，产率80.0～99.6％。
2)将连有冷凝管的二颈瓶置于恒温磁力加热搅拌器的水浴中，依次加入1.0 ～4.5g V/Al2O3催化剂、3.30～7.15g盐酸羟铵、25～60mL冰醋酸、10～20mL DMSO和磁力搅拌子，在18～35℃水浴中恒温搅拌20min，加入1.2～5.9g的 (Ⅱ-1)，开冷凝水，水浴温度逐渐升温至80～85℃，恒温回流、搅拌反应2～8 h后，停止反应，将反应后混合物冷却至室温，抽滤出催化剂粉末，向滤液中加入一定体积的10～15％的KOH水溶液至pH＝6～7，有黄色沉淀，抽滤得到固体(Ⅱ-2)。
3)将0.5～4.0g(Ⅱ-2)与1～5倍当量于(Ⅱ-2)的氨基脂肪酸在恒温油浴锅中进行，反应温度为60～90℃，冷凝回流，加入过量的哌啶为催化剂；随着反应的进行，体系的颜色由透明渐渐变成浑乳白色并伴有固体生成。可用乙酸乙酯初步洗涤，固体析出变多，得到糖基化根皮素(Ⅱ-3)。
4)将0.5～1.5份(Ⅱ-3)、2.0～18.6份EDC和5.5～40.3份NHS混合于圆底烧瓶，加入10～100份DMF，待所有物质溶解后，室温避光下搅拌10～26h，得到活化的(Ⅱ-3)反应液。
5)将活化的(Ⅱ-3)反应液按每4～8秒1滴的速度滴入壳聚糖的磷酸缓冲溶液中，滴加完后，需控制壳聚糖与活化的(Ⅱ-3)比例为：10～60：5，然后室温避光搅拌30min，接着3～5℃下避光搅拌直到反应完全，得到偶联的(Ⅰ) 反应液。
6)反应结束后，将偶联的(Ⅰ)反应液进行离心处理，去除不溶解的蛋白质和不溶的(Ⅱ-3)，并将上清液置于分子截留为8000～120000的透析袋中，于pH 值为7.0～7.5的磷酸盐缓冲液中，在1～4℃的条件下进行透析30～72h，每隔 4～8h换一次磷酸盐缓冲液。
7)将透析后透析袋中所得溶液，经冷冻干燥得白色固体，即为根皮素衍生物缓释制剂(Ⅰ)。
本发明所述的氨基脂肪酸(Ⅲ)所示：
Figure BDA0002919363380000031
其中n为1、2、3、4。
本发明所述的糖基化根皮素结构式如式(Ⅱ-3)：
Figure BDA0002919363380000032
其中：n为1～5。m＝1～8。R1，R2为烷基或H。R3为Glu，Rha。
在室温条件下，本发明所述的根皮素衍生物缓释制剂在pH<3.0的条件下稳定，pH>5.5时缓慢分解。
本发明所述的根皮素衍生物缓释制剂在K+溶液中缓慢形成凝胶。
本发明所述的根皮素衍生物缓释制剂用于抑制酪氨酸酶的活性。
本发明所述的根皮素衍生物缓释制剂在化妆品中的应用。
本发明所述的根皮素衍生物缓释制剂在美白洁面乳中应用。
有益效果：
本发明的根皮素衍生物缓释制剂室温条件下，pH<3.0，16h内在水中或缓冲液中分解1.52％；5.5≤pH＜7.5的条件下，8h内溶出速率为99.60％，基本分解完毕，释放包裹在缓释制剂中的活性成分。
本发明的根皮素衍生物缓释制剂，增加了根皮素在水中和缓冲液中的溶解度，提高了根皮素的生物利用率，增强了根皮素在美白方面的应用，显著提高了根皮素的美白效果，达到了长效美白的效果，明显提高了根皮素的经济价值，具有广阔的市场。
附图说明
图1根皮素衍生物缓释制剂对B16细胞内酪氨酸酶活性的抑制图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，以下的描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。为提高说明效率，本发明实施例选用结构式(Ⅰ)中：其中，n为2～3；m＝2～3；R1，R2均为烷基；R3为Glu。
实施例1根皮素衍生物缓释制剂的制备
1)将1.0g的(Ⅱ)与5.0g硫酸二甲酯溶解在80mL正丁醇溶液中，在70～ 80℃条件下，磁力搅拌，反应5.0h，得到黄色固体(Ⅱ-1)，产率95.3％。
2)将连有冷凝管的二颈瓶置于恒温磁力加热搅拌器的水浴中，依次加入2.1 g V/Al2O3催化剂、5.50g盐酸羟铵、35mL冰醋酸、15mL DMSO和磁力搅拌子，在25℃水浴中恒温搅拌20min，加入3.5g的(Ⅱ-1)，开冷凝水，水浴温度逐渐升温至80～85℃，恒温回流、搅拌反应3～5h后，停止反应，将反应后混合物冷却至室温，抽滤出催化剂粉末，向滤液中加入一定体积的10～15％的KOH 水溶液至pH＝6～7，有黄色沉淀，抽滤得到固体(Ⅱ-2)。
3)将2.8g(Ⅱ-2)与2.2倍当量于(Ⅱ-2)的氨基脂肪酸在恒温油浴锅中进行，反应温度为70～85℃，冷凝回流，加入过量的哌啶为催化剂。随着反应的进行，体系的颜色由透明渐渐变成浑乳白色并伴有固体生成。可用乙酸乙酯初步洗涤，固体析出变多，得到糖基化根皮素(Ⅱ-3)。
4)将0.9份(Ⅱ-3)、5.0份EDC和30.0份NHS混合于圆底烧瓶，加入20份 DMF，待所有物质溶解后，室温避光下搅拌15h，得到活化的(Ⅱ-3)反应液。
5)将活化的(Ⅱ-3)反应液按每4～8秒1滴的速度滴入壳聚糖的磷酸缓冲溶液中，滴加完后，需控制壳聚糖与活化的(Ⅱ-3)比例为：40：5，然后室温避光搅拌30min，接着3～5℃下避光搅拌直到反应完全，得到偶联的(Ⅰ)反应液。
6)反应结束后，将偶联的(Ⅰ)反应液进行离心处理，去除不溶解的蛋白质和不溶的(Ⅱ-3)，并将上清液置于分子截留为90000～110000的透析袋中，于 pH值为7.0～7.5的磷酸盐缓冲液中，在1～4℃的条件下进行透析45～60h，每隔4～8h换一次磷酸盐缓冲液。
7)将透析后透析袋中所得溶液，经冷冻干燥得白色固体，即为根皮素衍生物缓释制剂(Ⅰ)。
实施例2根皮素衍生物缓释制剂的制备
1)将2.5g的(Ⅱ)与10.5g硫酸二甲酯溶解在90mL正丁醇溶液中，在80℃条件下，磁力搅拌，反应6.0h，得到黄色固体(Ⅱ-1)，产率96.5％。
2)将连有冷凝管的二颈瓶置于恒温磁力加热搅拌器的水浴中，依次加入3.0 g V/Al2O3催化剂、7.00g盐酸羟铵、50mL冰醋酸、18mL DMSO和磁力搅拌子，在30℃水浴中恒温搅拌20min，加入3.5g的(Ⅱ-1)，开冷凝水，水浴温度逐渐升温至85℃，恒温回流、搅拌反应5h后，停止反应，将反应后混合物冷却至室温，抽滤出催化剂粉末，向滤液中加入一定体积的15％的KOH水溶液至 pH＝6～7，有黄色沉淀，抽滤得到固体(Ⅱ-2)。
3)将3.5g(Ⅱ-2)与2.0～4.0倍当量于(Ⅱ-2)的氨基脂肪酸在恒温油浴锅中进行，反应温度为85℃，冷凝回流，加入过量的哌啶为催化剂。随着反应的进行，体系的颜色由透明渐渐变成浑乳白色并伴有固体生成。可用乙酸乙酯初步洗涤，固体析出变多，得到糖基化根皮素(Ⅱ-3)。
4)将1.2份(Ⅱ-3)、15.0份EDC和35.0份NHS混合于圆底烧瓶，加入40 份DMF，待所有物质溶解后，室温避光下搅拌15～20h，得到活化的(Ⅱ-3)反应液。
5)将活化的(Ⅱ-3)反应液按每4～8秒1滴的速度滴入透明质酸的磷酸缓冲溶液中，滴加完后，需控制透明质酸与活化的(Ⅱ-3)比例为：50：5，然后室温避光搅拌30min，接着3～5℃下避光搅拌直到反应完全，得到偶联的(Ⅰ) 反应液。
6)反应结束后，将偶联的(Ⅰ)反应液进行离心处理，去除不溶解的蛋白- 质和不溶的(Ⅱ-3)，并将上清液置于分子截留为10000～11000的透析袋中，于 pH值为7.0～7.5的磷酸盐缓冲液中，在1～4℃的条件下进行透析45～60h，每隔4～8h换一次磷酸盐缓冲液。
7)将透析后透析袋中所得溶液，经冷冻干燥得白色固体，即为根皮素衍生物缓释制剂(Ⅰ)。
实施例3根皮素衍生物缓释制剂在不同pH溶液中的溶解缓释实验
1分析方法学的建立
检测波长的确定：分别称实施例1或2制备的根皮素衍生物缓释制剂和辅料适量，用甲醇配制成适宜浓度的溶液，并以甲醇为空白对照，于200～700nm范围内用紫外光谱仪进行扫描。结果表明在290nm处有根皮素衍生物缓释制剂的最大吸收峰；而辅料在此处对根皮素衍生物缓释制剂的测定均无干扰。因此，选定290 nm作为测定波长。标准曲线：精密称根皮素衍生物缓释制剂适量，用甲醇配制成系列浓度的溶液，于290nm处测定吸收度，以浓度(C)对吸收度(A)进行线性回归。
2根皮素衍生物缓释制剂溶出度的测定方法
称取含有根皮素衍生物缓释制剂100mg的固体颗粒。样品平行测定3份，按中国药典2015版第二部中的方法进行。溶出介质为900mL的蒸馏水，温度为37 ±0.5℃，转速为100±3rpm。分别在3、6、9、12、15min取样5mL并补入相同体积的溶出介质，样品经0.8μm微孔滤膜过滤。取滤液稀释后于290nm处测定吸收度，计算根皮素衍生物缓释制剂的溶出度。
3测定结果
标准曲线方程C＝17.3158A+0.2951,R2＝0.9933，线性范围：8.564～100.248 μg/mL。
测定根皮素衍生物缓释制剂在体外的溶出情况，结果表明，根皮素衍生物缓释制剂在体外不同的环境中的溶解度符合本发明的预期，结果见下表1。
表1根皮素衍生物缓释制剂的溶出速率
Figure BDA0002919363380000071
从表1可以看出，本发明的根皮素衍生物缓释制剂在pH＜3.0的条件下，16h 内溶出速率为1.52％；在3.0≤pH＜5.5的条件下，16h内溶出速率为11.96％；在 5.5≤pH＜7.5的条件下，8h内溶出速率为99.60％；说明本发明的根皮素衍生物缓释制剂在pH＜3.0较稳定，3.0≤pH＜5.5的条件下溶出速率增加；在5.5≤pH ＜7.5的条件下溶出速率显著增加，在8h几乎完全溶解，其持久缓释效果，可以应用在化妆品中，达到长久有效的效果。
实施例4一种美白抗衰老洁面乳
根皮素衍生物缓释制剂4％、月桂酸4％、甘油8％、氢氧化钾2％、角鲨烷 4％、月桂酰谷氨酸钠2％、单硬脂酸甘油酯4％、聚乙二醇4％、杜仲提取物2％、辣木叶提取物4％、麦门冬提取物4％、银杏叶提取物4％、EDTA二钠1％、羟苯甲酯0.2％、香精0.08％，余量为水；
制备方法和配方参照专利授权号CN105287290B，本实施例增加了4％的根皮素衍生物缓释制剂，分别减少了杜仲提取物1％、辣木叶提取物1％、麦门冬提取物1％、银杏叶提取物1％。
实施例5根皮素衍生物缓释制剂制备的化妆品的美白淡斑效果进行临床评价
选择40位年龄在23～50岁健康女性，随机分为2组，测定其脸颊的色素含量及皮肤颜色，然后发放受试化妆品。受试对象连续使用美白洁面乳样品。测试者左、右脸颊部，作对照实验，每天早晚各使用1次，洁面后敷用。在实验期间停用其他美白化妆品。连续使用7d、14d、21d、28d后，再测定各功效指标。同时询问志愿者使用受试样品后自我感觉及有无过敏现象等，记录自身前后对比；经询问统计，测试者均有良好的耐受性，无不良反应发生。
在使用化妆品前1d和使用后7d、14d、21d、28d利用Lab色度系统光谱光度计测量皮肤颜色的变化，连续测试3次，取平均值。同时使用MEXAMETER MXl 8皮肤色素仪测皮肤黑色素含量，连续测试3次，取平均值。数据处理采用 sigmastat统计软件进行配对检验，以P<0.05具有显著意义，数据见表2，实施例组4在使用样品后7d、14d、21d、28d的黑色素含量与使用前相比均降低 (P<0.05)，其中参照专利授权号CN105287290B制备的美白面霜的黑色素含量降低较少，空白组无黑色素含量降低的表现。因此，根皮素衍生物缓释制剂能显著降低黑色素的作用。空白组不使用任何化妆品。
表2美白洁面乳使用期间受试部位黑色素变化情况
Figure BDA0002919363380000081
试验前后受试部位皮肤色度L*值的变化情况：皮肤色度L*值越大，表示皮肤颜色越浅。产品使用后第7d，皮肤色度L*值就有增加的趋势，自第21d开始，就明显大于试验前水平(P<0.05)(数据见表3)，L*值随着产品使用时间的延长呈现逐渐增加的趋势。
表3美白洁面乳使用期间受试部位L*值的变化情况
Figure BDA0002919363380000082
综上所述，由本实施例5可知，本发明的根皮素衍生物缓释制剂的美白功效显著，能够显著的提高皮肤色度，具有提亮肤色和淡化色斑的双重功效。
实施例6根皮素衍生物缓释制剂对B16细胞内酪氨酸酶活性的测定
取对数生长期B16细胞，用0.05％胰蛋白酶+0.53mmol/L EDTA溶液消化后，以新鲜培养液配成密度为6×103个/mL的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔180μL。细胞板置于CO2培养箱中孵育过夜后，每孔细胞加入终浓度为1 mmol/L的茶碱。每个样品设置4个样品浓度梯度。在96孔细胞培养板中，加入样品稀释液，并以PBS补充至20μL，分别使细胞培养板中的根皮素衍生物缓释制剂，糖基化根皮素，Vc，根皮素的终质量浓度分别为1μg/L，1mg/L，10mg /L，100mg/L。空白对照孔加入20μL PBS，混匀。细胞板置于CO2培养箱中孵育48h后，吸去培养液，加入100μL体积分数为1％的Triton X-100溶液，-80℃下放置60min。取出细胞板恢复至室温后，取10μL培养液用BCA法测定蛋白含量。另取80μL培养液，加入0.1％L-Dopa溶液50μL，37℃下孵育2h。用酶标仪于490nm处测定吸光度并计算酪氨酸酶活性抑制率。当各种样品的浓度为100mg/L时，酪氨酸酶活性抑制率结果如附图1所示：根皮素衍生物缓释制剂对于酪氨酸酶活性抑制率达到接近96.24％，而糖基化根皮素只有57.38％，根皮素只有49.14％，Vc只有44.4％，这充分说明根皮素衍生物缓释制剂具有较好的效果，达到了增加美白的效果。

Claims (6)

1.一种根皮素衍生物缓释制剂的制备方法，其特征在于，所述的根皮素衍生物缓释制剂的结构式，如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0002919363370000011
其中n为1～10；m＝1～10；R1，R2为烷基或H；R3为Glu，Rha；所述的R为壳聚糖；
所述的根皮素衍生物缓释制剂的方程式的通式为：
Figure FDA0002919363370000012
所述的根皮素衍生物缓释制剂的制备步骤为：
1)将0.5～3.0g的(Ⅱ)与1.6～12.9g硫酸二甲酯溶解在50～100mL正丁醇溶液中，在55～80℃条件下，磁力搅拌，反应1.0～8.0h，得到黄色固体(Ⅱ-1)，产率80.0～99.6％；
2)将连有冷凝管的二颈瓶置于恒温磁力加热搅拌器的水浴中，依次加入1.0～4.5g V/Al2O3催化剂、3.30～7.15g盐酸羟铵、25～60mL冰醋酸、10～20mL DMSO和磁力搅拌子，在18～35℃水浴中恒温搅拌20min，加入1.2～5.9g的(Ⅱ-1)，开冷凝水，水浴温度逐渐升温至80～85℃，恒温回流、搅拌反应2～8h后，停止反应，将反应后混合物冷却至室温，抽滤出催化剂粉末，向滤液中加入一定体积的10～15％的KOH水溶液至pH＝6～7，有黄色沉淀，抽滤得到固体(Ⅱ-2)；
3)将0.5～4.0g(Ⅱ-2)与1～5倍当量于(Ⅱ-2)的氨基脂肪酸在恒温油浴锅中进行，反应温度为60～90℃，冷凝回流，加入过量的哌啶为催化剂；随着反应的进行，体系的颜色由透明渐渐变成浑乳白色并伴有固体生成；可用乙酸乙酯初步洗涤，固体析出变多，得到糖基化根皮素(Ⅱ-3)；
4)将0.5～1.5份(Ⅱ-3)、2.0～18.6份EDC和5.5～40.3份NHS混合于圆底烧瓶，加入10～100份DMF，待所有物质溶解后，室温避光下搅拌10～26h，得到活化的(Ⅱ-3)反应液；
5)将活化的(Ⅱ-3)反应液按每4～8秒1滴的速度滴入壳聚糖的磷酸缓冲溶液中，滴加完后，需控制壳聚糖与活化的(Ⅱ-3)比例为：10～60：5，然后室温避光搅拌30min，接着3～5℃下避光搅拌直到反应完全，得到偶联的(Ⅰ)反应液；
6)反应结束后，将偶联的(Ⅰ)反应液进行离心处理，去除不溶解的蛋白质和不溶的(Ⅱ-3)，并将上清液置于分子截留为8000～120000的透析袋中，于pH值为7.0～7.5的磷酸盐缓冲液中，在1～4℃的条件下进行透析30～72h，每隔4～8h换一次磷酸盐缓冲液；
7)将透析后透析袋中所得溶液，经冷冻干燥得白色固体，即为根皮素衍生物缓释制剂(Ⅰ)；
所述的氨基脂肪酸的结构式如式(Ⅲ)所示：
Figure FDA0002919363370000021
其中n为1、2、3、4；
所述的糖基化根皮素结构式如式(Ⅱ-3):
Figure FDA0002919363370000022
其中：n为1～5；m＝1～8；R1，R2为烷基或H；R3为Glu，Rha。
2.根据权利要求1所述的一种根皮素衍生物缓释制剂的制备方法，其特征在于，所述的根皮素衍生物的结构式(Ⅰ)中：n为2～3；m＝2～3；R1，R2均为烷基；R3为Glu；所述的R为壳聚糖。
3.根据权利要求1或2所述的一种根皮素衍生物缓释制剂的制备方法，其特征在于：所述的根皮素衍生物缓释制剂在K+溶液中缓慢形成凝胶。
4.一种根皮素衍生物缓释制剂的应用，其特征在于：所述的根皮素衍生物缓释制剂在化妆品中的应用。
5.根据权利要求4所述的一种根皮素衍生物缓释制剂的应用，其特征在于，所述的根皮素衍生物缓释制剂在美白洁面乳、美白面膜中应用。
6.根据权利要求4或5所述的根皮素衍生物缓释制剂的应用，其特征在于，所述的根皮素衍生物缓释制剂用于抑制酪氨酸酶的活性。
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