CN112898363A - 一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112898363A CN112898363A CN202110097494.XA CN202110097494A CN112898363A CN 112898363 A CN112898363 A CN 112898363A CN 202110097494 A CN202110097494 A CN 202110097494A CN 112898363 A CN112898363 A CN 112898363A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phosphoramidite
- monomer solution
- deoxynucleotide
- oligonucleotide
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和应用，所述亚磷酰胺单体组合物包括dA溶液、dC溶液、dG溶液和dT溶液；所述dA溶液的浓度为0.01～0.05g/mL；所述dC溶液的浓度为0.01～0.03g/mL；所述dG溶液的浓度为0.01～0.03g/mL；所述dT溶液的浓度为0.01～0.03g/mL；所述dA溶液、dC溶液、dG溶液和dT溶液的体积比为(5～6):(4～5.1):(4～5.1):(4～5)。本发明的亚磷酰胺单体组合物配比合理，制备的寡核苷酸中简并位点的分布合理，每一个简并位点的简并度在20％～30％范围内。
Description
技术领域
本发明属于核酸的合成技术领域，涉及一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和应用，尤其涉及一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和在合成含有简并位点的寡核苷酸中的应用。
背景技术
短链DNA又称为寡核苷酸(Oligo)，通常采用高效、自动化的固相合成技术进行合成。固相合成以控制孔径玻璃球(CPG)为固相载体，以A、T、C和G四种亚磷酰胺为单体，按照3’-5’方向，经过脱保护、缩合、氧化和盖帽四个反应的循环，将目标序列逐渐连接在固相载体上(Andrew Ellington et al.,Introduction to the Synthesis and Purificationof Oligonucleotides,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,2001,A.3C.1-A.3C.22.)。Oligo按照设计的序列在合成仪上进行合成，针对具体的实验需求，一些杂交探针或PCR引物设计有简并位点，如果简并度过低会使得Oligo的特异性过高，对某些特定序列的结合度超过其他序列，从而影响实验结果。
在合成仪上合成含有简并位点的Oligo，通常采用机器混合(in-line)和手动混合(off-line)两种方式加入亚磷酰胺单体(Andrew D.Ellington et al.,Design,Synthesis,and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection,CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry,2001,9.2.1-9.2.23.)。对于简并位点较少或精度要求不高的Oligo，通常采用机器混合单体的方式进行合成，优点是操作简便，缺点也很明显：由于单体进入合成柱的顺序不同，先进入的单体优先与合成柱反应，造成Oligo的简并度较低，而这一问题在合成多简并位点的序列时会被不断放大。因此，对于简并位点较多或精度要求高的Oligo，通常采用手动混合单体的方式进行合成，根据四种单体的反应活性对添加比例进行调配，提高Oligo的简并度，有利于避免单体进入合成柱的顺序对简并度的影响。
现有文献报道的A、C、G和T四种亚磷酰胺单体在等摩尔浓度下的体积混合比例包括：3:3:2:2(Andrew Ellington et al.,Introduction to the Synthesis andPurification of Oligonucleotides,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,2001,A.3C.1-A.3C.22.)、3:3:2:2.4、1.5:1.25:1.15:1(Andrew D.Ellington et al.,Design,Synthesis,and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,2001,9.2.1-9.2.23.)和0.26:0.25:0.29:0.20(Peter J.Unrau et al.,RNA-catalysed nucleotide synthesis,Nature,1998,395(6699):260-263.)。然而，限于文献报道时的技术水平，四种单体的反应活性主要基于HPLC分析、核磁共振氢谱分析或一些生物学方法进行检测，这些方法不能直接表征合成序列的简并度，即无法直接“读”出含简并位点的Oligo，而且仅针对含有几个脱氧核苷酸位点的Oligo进行测试，得出的四种单体活性不同于含有更多简并位点、更长链的Oligo，因此结果缺乏说服力。按照现有技术报道的亚磷酰胺比例混合四种单体，合成出的Oligo简并N的简并度与25％偏差较大。
因此，有必要优化四种亚磷酰胺单体的配比、以手动混合单体的方式合成Oligo，并采用新的方法检测含简并位点的Oligo的简并度。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和应用，所述亚磷酰胺单体组合物在合理的配比下合成寡核苷酸，使寡核苷酸的简并度维持在20～30％。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种亚磷酰胺单体组合物，所述亚磷酰胺单体组合物包括腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液；
所述腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.01～0.05g/mL；
所述胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.01～0.03g/mL；
所述鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.01～0.03g/mL；
所述胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.01～0.03g/mL；
所述腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的体积比为(5～6):(4～5.1):(4～5.1):(4～5)。
本发明中，根据四种亚磷酰胺单体的反应活性差异，精确配比四种亚磷酰胺单体的比例，确保了四种亚磷酰胺单体平均分布到每一个简并位点上。
优选地，所述腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的溶剂为有机溶剂，优选为乙腈。
优选地，所述腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.01～0.05g/mL，例如可以是0.01g/mL、0.015g/mL、0.02g/mL、0.025g/mL、0.03g/mL、0.031g/mL、0.035g/mL、0.04g/mL、0.045g/mL或0.05g/mL，优选为0.025～0.035g/mL，进一步优选为0.03～0.031g/mL。
优选地，所述胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.01～0.03g/mL，例如可以是0.01g/mL、0.015g/mL、0.02g/mL、0.025g/mL、0.027g/mL、0.0271g/mL或0.03g/mL，优选为0.025～0.03g/mL，进一步优选为0.027～0.0271g/mL。
优选地，所述鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.01～0.03g/mL，例如可以是0.01g/mL、0.015g/mL、0.02g/mL、0.025g/mL、0.029g/mL或0.03g/mL，优选为0.025～0.03g/mL，进一步优选为0.029～0.03g/mL。
优选地，所述胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.01～0.03g/mL，例如可以是0.01g/mL、0.015g/mL、0.02g/mL、0.025g/mL、0.026g/mL或0.03g/mL，优选为0.025～0.03g/mL，进一步优选为0.026～0.0262g/mL。
优选地，所述腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的体积比为(5～6):(4～5.1):(4～5.1):(4～5)，优选为(5～5.5):(4.5～5.1):(4.7～5.1):(4～4.2)。
本发明中，采用0.025～0.035g/mL腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、0.025～0.03g/mL胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、0.025～0.03g/mL鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和0.025～0.03g/mL胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液按照(5～5.5):(4.5～5.1):(4.7～5.1):(4～4.2)的体积比混合，制备的亚磷酰胺单体组合物用于合成寡核苷酸，使得多个连续的简并位点的简并度基本在20％～30％范围内，且简并位点中四种核苷酸基本控制在25％±5％的范围，结果准确度高、重复性好、实用性强。
优选地，所述亚磷酰胺单体组合物还包括分子筛。
第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的亚磷酰胺单体组合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)分别将5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N6-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺、5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N4-乙酰基-2'-脱氧胞苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺、5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N2-(N,N-二甲基甲脒)-2'-脱氧鸟苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺和5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-2'-脱氧胸苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺溶解于乙腈中，配制0.01～0.05g/mL腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、0.01～0.03g/mL胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、0.01～0.03g/mL鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和0.01～0.03g/mL胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液；
(2)将所述腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液按体积比为(5～6):(4～5.1):(4～5.1):(4～5)混合，得到所述亚磷酰胺单体组合物。
优选地，所述制备方法还包括加入分子筛的步骤。
第三方面，本发明提供了一种含有简并位点的寡核苷酸的合成方法，所述合成方法包括以下步骤：
(1’)向固相合成柱中加入固相载体，并加入亚磷酰胺单体和/或第一方面所述的亚磷酰胺单体组合物，进行寡核苷酸的固相合成反应；
(2’)将合成柱上的寡核苷酸脱保护，洗脱纯化后得到所述含有简并位点的寡核苷酸。
优选地，所述合成方法还包括利用二代测序检测寡核苷酸简并度的步骤。
优选地，所述二代测序包括Illumina测序。
优选地，合成所述寡核苷酸的非简并位点加入亚磷酰胺单体，合成所述寡核苷酸的简并位点加入第一方面所述的亚磷酰胺单体组合物。
优选地，所述纯化的方法包括高效液相色谱和/或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
作为优选技术方案，所述含有简并位点的寡核苷酸的合成方法包括以下步骤：
(1’)向固相合成柱中加入固相载体，并加入亚磷酰胺单体和/或第一方面所述的亚磷酰胺单体组合物，进行寡核苷酸的固相合成反应，合成所述寡核苷酸的非简并位点加入亚磷酰胺单体，合成所述寡核苷酸的简并位点加入第一方面所述的亚磷酰胺单体组合物；
(2’)将合成柱上的寡核苷酸脱保护，洗脱后进行高效液相色谱和/或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，得到所述含有简并位点的寡核苷酸；
(3’)利用二代测序检测寡核苷酸的简并度。
第四方面，本发明提供了一种含有简并位点的寡核苷酸，所述含有简并位点的寡核苷酸采用第三方面所述的合成方法制备得到。
优选地，所述含有简并位点的寡核苷酸的简并度为20％～30％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明根据四种亚磷酰胺单体的反应活性差异，精准调控四种单体的比例，确保简并位点的准确分布，具体地，8条48碱基的寡核苷酸的12个N简并位点的简并度在20％～30％范围，12个简并位点中四种核苷酸控制在25％±5％的范围；
(2)本发明采用二代测序方法作为验证手段，相较于现有技术的方法更准确地反映寡核苷酸简并位点的简并度，简并度的检测结果直观有效；
(3)本发明采用不同规格的合成柱和固相载体、不同的纯化方法验证亚磷酰胺单体组合物和合成方法的适用性，制备的亚磷酰胺单体组合物和构建的寡核苷酸合成方法适用于多种合成规格，实用性和重复性强。
附图说明
图1为2μmol规格下，8种含12个N简并位点的寡核苷酸经HPLC纯化后的测序分布结果；
图2为3μmol规格下，8种含12个N简并位点的寡核苷酸经PAGE纯化后的测序分布结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例制备亚磷酰胺单体组合物，包括以下步骤：
(1)将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N6-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dA单体)溶于333mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N4-乙酰基-2'-脱氧胞苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dC单体)溶于370mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N2-(N,N-二甲基甲脒)-2'-脱氧鸟苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dG单体)溶于340mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-2'-脱氧胸苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dT单体)溶于383mL乙腈；
(2)将dA溶液、dC溶液、dG溶液和dT溶液按照5.5:4.5:4.7:4.2的体积比加入到干燥试剂瓶中，并加入适量分子筛，混合均匀后得到亚磷酰胺单体组合物，贴封口膜备用。
实施例2
本实施例制备亚磷酰胺单体组合物，包括以下步骤：
(1)将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N6-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dA单体)溶于400mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N4-乙酰基-2'-脱氧胞苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dC单体)溶于400mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N2-(N,N-二甲基甲脒)-2'-脱氧鸟苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dG单体)溶于400mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-2'-脱氧胸苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dT单体)溶于400mL乙腈；
(2)将dA溶液、dC溶液、dG溶液和dT溶液按照5.5:5.1:5.1:4.2的体积比加入到干燥试剂瓶中，并加入适量分子筛，混合均匀后得到亚磷酰胺单体组合物，贴封口膜备用。
实施例3
本实施例制备亚磷酰胺单体组合物，包括以下步骤：
(1)将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N6-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dA单体)溶于285.7mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N4-乙酰基-2'-脱氧胞苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dC单体)溶于333mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N2-(N,N-二甲基甲脒)-2'-脱氧鸟苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dG单体)溶于333mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-2'-脱氧胸苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dT单体)溶于333mL乙腈；
(2)将dA溶液、dC溶液、dG溶液和dT溶液按照5:4.5:4.7:4的体积比加入到干燥试剂瓶中，并加入适量分子筛，混合均匀后得到亚磷酰胺单体组合物，贴封口膜备用。
实施例4
本实施例制备亚磷酰胺单体组合物，包括以下步骤：
(1)将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N6-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dA单体)溶于1000mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N4-乙酰基-2'-脱氧胞苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dC单体)溶于1000mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N2-(N,N-二甲基甲脒)-2'-脱氧鸟苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dG单体)溶于1000mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-2'-脱氧胸苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dT单体)溶于1000mL乙腈；
(2)将dA溶液、dC溶液、dG溶液和dT溶液按照6:5:5:5的体积比加入到干燥试剂瓶中，并加入适量分子筛，混合均匀后得到亚磷酰胺单体组合物，贴封口膜备用。
实施例5
本实施例制备亚磷酰胺单体组合物，包括以下步骤：
(1)将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N6-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dA单体)溶于200mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N4-乙酰基-2'-脱氧胞苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dC单体)溶于333mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N2-(N,N-二甲基甲脒)-2'-脱氧鸟苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dG单体)溶于333mL乙腈；
将10g 5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-2'-脱氧胸苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺(简称dT单体)溶于333mL乙腈；
(2)将dA溶液、dC溶液、dG溶液和dT溶液按照5:4:4:4的体积比加入到干燥试剂瓶中，并加入适量分子筛，混合均匀后得到亚磷酰胺单体组合物，贴封口膜备用。
实施例6
本实施例在2μmol规格的合成柱上，采用实施例1的亚磷酰胺单体组合物合成长度为48nt、中间含有连续12个N简并位点的8条结构类似的寡核苷酸，并采用高效液相色谱法进行纯化。8条寡核苷酸序列的形式为：××××××××××××××NNNNNNNNNNNN××××××××××××××××××××××，其中“×”代表寡核苷酸序列各异的位点，N代表简并位点。步骤如下：
(1)合成寡核苷酸
向2μmol合成柱中加入CPG球，将四种亚磷酰胺单体和实施例1的亚磷酰胺单体组合物分别装入合成仪的指定试剂瓶中，并采用含0.25M 5-乙硫基四氮唑(ETT)的乙腈为活化剂，含3％三氯乙酸的二氯甲烷为脱保护试剂，含10％乙酸酐/乙腈的N-甲基咪唑/吡啶/乙腈(N-甲基咪唑:吡啶:乙腈＝14:10:76)混合液为盖帽试剂，含0.05M碘的四氢呋喃/吡啶/水(四氢呋喃:吡啶:水＝70:20:10)混合液为氧化剂，在合成仪(领坤LK-48E)上合成寡核苷酸序列，在合成非简并位点时，加入四种亚磷酰胺单体之一，在合成简并位点时，加入亚磷酰胺单体组合物；
(2)气相氨解
合成完成后，向合成柱中加入200μL含20％二乙胺的乙腈溶液，静置10min，3000rpm离心1min，加入乙腈洗涤两次，每次100μL；
将带有合成柱的合成板转移至气相氨解锅中，通入氨气，待压力稳定至80～100MPsi后，打开加热开关加热至90℃，氨解2.5h；
反应结束后取出合成柱，放入烘箱中55℃干燥30min，取出降温至室温；
加入200μL乙腈洗涤两次，并用200μL 90％乙腈溶液洗涤一次，3000rpm离心1min，加400μL一级水洗脱至2mL离心管中，按照标准进行HPLC纯化。
取纯化后的寡核苷酸建立文库，进行Illumina测序。
测序结果如表1和图1所示，在合成的8条寡核苷酸中，12个简并位点的四种脱氧核苷酸比例控制在20％～30％，说明采用实施例1的亚磷酰胺单体组合物合成含有简并位点的寡核苷酸，能够保证寡核苷酸具有合理的简并度，同时8条寡核苷酸的简并度均能维持在这一水平，证明了结果的稳定性。
表1
实施例7
本实施例在3μmol规格的合成柱上，采用实施例1的亚磷酰胺单体组合物合成长度为48nt、中间含有连续12个N简并位点的8条结构类似的寡核苷酸，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯化。8条寡核苷酸序列的形式为：××××××××××××××NNNNNNNNNNNN××××××××××××××××××××××，其中“×”代表寡核苷酸序列各异的位点，N代表简并位点。步骤如下：
(1)合成寡核苷酸
向3μmol合成柱中加入CPG球，将四种亚磷酰胺单体和实施例1的亚磷酰胺单体组合物分别装入合成仪的指定试剂瓶中，并采用含0.25M 5-乙硫基四氮唑(ETT)的乙腈为活化剂，含3％三氯乙酸的二氯甲烷为脱保护试剂，含10％乙酸酐/乙腈的N-甲基咪唑/吡啶/乙腈(N-甲基咪唑:吡啶:乙腈＝14:10:76)混合液为盖帽试剂，含0.05M碘的四氢呋喃/吡啶/水(四氢呋喃:吡啶:水＝70:20:10)混合液为氧化剂，在合成仪(领坤LK-192)上合成寡核苷酸序列，在合成非简并位点时，加入四种亚磷酰胺单体之一，在合成简并位点时，加入亚磷酰胺单体组合物；
(2)气相氨解
合成完成后，向合成柱中加入200μL含20％二乙胺的乙腈溶液，静置10min，3000rpm离心1min，加入乙腈洗涤两次，每次100μL；
将带有合成柱的合成板转移至气相氨解锅中，通入氨气，待压力稳定至80～100MPsi后，打开加热开关加热至90℃，氨解2.5h；
反应结束后取出合成柱，放入烘箱中55℃干燥30min，取出降温至室温；
加入200μL乙腈洗涤两次，并用200μL 90％乙腈溶液洗涤一次，3000rpm离心1min，加600μL一级水洗脱至2mL离心管中，按照标准进行PAGE纯化。
取纯化后的寡核苷酸建立文库，进行Illumina测序。
测序结果如表2和图2所示，在合成的8条寡核苷酸中，12个简并位点的四种脱氧核苷酸比例控制在20％～30％，说明采用实施例1的亚磷酰胺单体组合物合成含有简并位点的寡核苷酸，能够保证寡核苷酸具有合理的简并度，同时8条寡核苷酸的简并度均能维持在这一水平，证明了结果的稳定性。
表2
综合实施例6和实施例7的结果，8条寡核苷酸的12个N简并位点的简并度均在20％～30％范围，12个简并位点中四种核苷酸都控制在25％±5％的范围。
实施例8
本实施例在2μmol规格的合成柱上，分别采用实施例2～5的亚磷酰胺单体组合物合成长度为48nt、中间含有连续12个N简并位点的8条结构类似的寡核苷酸，具体步骤同实施例6。
结果发现，实施例2的简并位点的A、C、G、T的比例为23.62％:31.26％:22.37％:22.75％，实施例3的简并位点的A、C、G、T的比例为24.11％:30.05％:23.40％:22.44％，实施例4的简并位点的A、C、G、T的比例为26.44％:27.15％:19.77％:26.64％，实施例5的简并位点的A、C、G、T的比例为30.73％:22.63％:19.52％:27.12％，实施例2～3的8条寡核苷酸的12个简并位点的四种脱氧核苷酸比例控制在20％～31％范围，实施例4～5的12个简并位点的四种脱氧核苷酸比例基本控制在20％～35％范围，说明当亚磷酰胺单体组合物中A、C、G、T的比例在(5～5.5):(4.5～5.1):(4.7～5.1):(4～4.2)时，可以获得更优的简并度。
综上所述，本发明根据四种亚磷酰胺单体的反应活性差异，精确配比四种亚磷酰胺单体的比例，制备的亚磷酰胺单体组合物应用于寡核苷酸合成中，可以将四种亚磷酰胺单体平均分布到每一个简并位点上，使简并位点的简并度基本在20％～30％范围内。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种亚磷酰胺单体组合物，其特征在于，所述亚磷酰胺单体组合物包括腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液；
所述腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.01～0.05g/mL；
所述胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.01～0.03g/mL；
所述鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.01～0.03g/mL；
所述胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.01～0.03g/mL；
所述腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的体积比为(5～6):(4～5.1):(4～5.1):(4～5)。
2.根据权利要求1所述的亚磷酰胺单体组合物，其特征在于，所述腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的溶剂为有机溶剂，优选为乙腈。
3.根据权利要求1或2所述的亚磷酰胺单体组合物，其特征在于，所述腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.025～0.035g/mL，优选为0.03～0.031g/mL；
优选地，所述胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.025～0.03g/mL，优选为0.027～0.0271g/mL；
优选地，所述鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.025～0.03g/mL，优选为0.029～0.03g/mL；
优选地，所述胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的浓度为0.025～0.03g/mL，优选为0.026～0.0262g/mL；
优选地，所述腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液的体积比为(5～5.5):(4.5～5.1):(4.7～5.1):(4～4.2)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的亚磷酰胺单体组合物，其特征在于，所述亚磷酰胺单体组合物还包括分子筛。
5.一种权利要求1-4任一项所述的亚磷酰胺单体组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)分别将5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N6-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺、5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N4-乙酰基-2'-脱氧胞苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺、5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N2-(N,N-二甲基甲脒)-2'-脱氧鸟苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺和5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-2'-脱氧胸苷-3'-(2-氰乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺溶解于乙腈中，配制0.01～0.05g/mL腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、0.01～0.03g/mL胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、0.01～0.03g/mL鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和0.01～0.03g/mL胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液；
(2)将所述腺嘌呤脱氧核苷酸单体溶液、胞嘧啶脱氧核苷酸单体溶液、鸟嘌呤脱氧核苷酸单体溶液和胸腺嘧啶脱氧核苷酸单体溶液按体积比为(5～6):(4～5.1):(4～5.1):(4～5)混合，得到所述亚磷酰胺单体组合物；
优选地，所述制备方法还包括加入分子筛的步骤。
6.一种含有简并位点的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括以下步骤：
(1’)向固相合成柱中加入固相载体，并加入亚磷酰胺单体和/或权利要求1-4任一项所述的亚磷酰胺单体组合物，进行寡核苷酸的固相合成反应；
(2’)将合成柱上的寡核苷酸脱保护，洗脱纯化后得到所述含有简并位点的寡核苷酸。
7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法还包括利用二代测序检测寡核苷酸简并度的步骤；
优选地，所述二代测序包括Illumina测序。
8.根据权利要求6或7所述的合成方法，其特征在于，合成所述寡核苷酸的非简并位点加入亚磷酰胺单体，合成所述寡核苷酸的简并位点加入权利要求1-4任一项所述的亚磷酰胺单体组合物；
优选地，所述纯化的方法包括高效液相色谱和/或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
9.根据权利要求6-8任一项所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括以下步骤：
(1’)向固相合成柱中加入固相载体，并加入亚磷酰胺单体和/或权利要求1-4任一项所述的亚磷酰胺单体组合物，进行寡核苷酸的固相合成反应，合成所述寡核苷酸的非简并位点加入亚磷酰胺单体，合成所述寡核苷酸的简并位点加入权利要求1-4任一项所述的亚磷酰胺单体组合物；
(2’)将合成柱上的寡核苷酸脱保护，洗脱后进行高效液相色谱和/或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，得到所述含有简并位点的寡核苷酸；
(3’)利用二代测序检测寡核苷酸的简并度。
10.一种含有简并位点的寡核苷酸，其特征在于，所述含有简并位点的寡核苷酸采用权利要求6-9任一项所述的合成方法制备得到；
优选地，所述含有简并位点的寡核苷酸的简并度为20％～30％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110097494.XA CN112898363A (zh) | 2021-01-25 | 2021-01-25 | 一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110097494.XA CN112898363A (zh) | 2021-01-25 | 2021-01-25 | 一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112898363A true CN112898363A (zh) | 2021-06-04 |
Family
ID=76119429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110097494.XA Pending CN112898363A (zh) | 2021-01-25 | 2021-01-25 | 一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112898363A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113735930A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-12-03 | 武汉奥科鼎盛生物科技有限公司 | 一种引物纯化方法 |
| CN114685572A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-07-01 | 上海百力格生物技术有限公司 | 用于mgb核酸探针合成的氧化剂组合物及探针的合成方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101133073A (zh) * | 2005-03-04 | 2008-02-27 | 集润德斯股份公司 | 寡核苷酸的合成 |
| CN108779132A (zh) * | 2016-03-13 | 2018-11-09 | 波涛生命科学有限公司 | 用于亚磷酰胺和寡核苷酸合成的组合物和方法 |
| CN109311925A (zh) * | 2016-05-12 | 2019-02-05 | 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 | 立体限定的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体与核苷或寡核苷酸的增强的偶联 |
-
2021
- 2021-01-25 CN CN202110097494.XA patent/CN112898363A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101133073A (zh) * | 2005-03-04 | 2008-02-27 | 集润德斯股份公司 | 寡核苷酸的合成 |
| CN108779132A (zh) * | 2016-03-13 | 2018-11-09 | 波涛生命科学有限公司 | 用于亚磷酰胺和寡核苷酸合成的组合物和方法 |
| CN109311925A (zh) * | 2016-05-12 | 2019-02-05 | 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 | 立体限定的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体与核苷或寡核苷酸的增强的偶联 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BEAUCAGE, SERGE L.，等: "Introduction to the Synthesis and Purification of Oligonucleotides", CURRENT PROTOCOLS IN NUCLEIC ACID CHEMISTRY, pages 194 * |
| HALL, B.，等: "Design, Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection", CURRENT PROTOCOLS IN NUCLEIC ACID CHEMISTRY, pages 9 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113735930A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-12-03 | 武汉奥科鼎盛生物科技有限公司 | 一种引物纯化方法 |
| CN114685572A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-07-01 | 上海百力格生物技术有限公司 | 用于mgb核酸探针合成的氧化剂组合物及探针的合成方法 |
| CN114685572B (zh) * | 2022-06-02 | 2022-08-30 | 上海百力格生物技术有限公司 | 用于mgb核酸探针合成的氧化剂组合物及探针的合成方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6197555B1 (en) | Nucleotide compounds including a rigid linker | |
| US6664112B2 (en) | Methods for improving the sequence fidelity of synthetic double-stranded oligonucleotides | |
| JP4638032B2 (ja) | 浅溝バインダに共役結合されたヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーション及び不一致識別 | |
| CN112898363A (zh) | 一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和应用 | |
| JP2003507024A (ja) | Ｐｎａ−ｄｎａキメラの３’末端でのポリメラーゼ伸長 | |
| EP2739638A1 (en) | Compositions and methods relating to nucleic acid nano-and micro-technology | |
| KR19980080494A (ko) | 개질된 프라이머 | |
| EP1538221B1 (en) | Oligonucleotides containing molecular rods | |
| JP2010248084A (ja) | 新規洗浄溶媒を用いるオリゴヌクレオチド合成法 | |
| CN114657232A (zh) | 一种用于提高靶向捕获效率的通用封闭试剂及其应用 | |
| CN109641931B (zh) | 核糖核酸h-磷酸酯单体的合成方法和使用了该单体的寡核苷酸合成 | |
| US6653462B2 (en) | Nucleotide compounds including a rigid linker | |
| Jäschke et al. | Synthesis and analytical characterization of RNA-polyethylene glycol conjugates | |
| JP2000512843A (ja) | 安定性が２個のハイブリッドされた核酸分子の塩基組成に僅かしか依存しないハイブリッド複合体の形成方法 | |
| JP2022536157A (ja) | 改変された酸化プロトコルを使用してオリゴヌクレオチドを調製するための方法 | |
| CN115010770B (zh) | 使用混合脱保护剂合成rna核酸的方法 | |
| CN114014902B (zh) | 一种二聚核苷酸及其合成方法 | |
| CN116536308A (zh) | 测序封闭剂及其应用 | |
| CN112888699B (zh) | 测序用核苷酸的制备方法 | |
| CN107937503B (zh) | 一种对引物测序的方法 | |
| CN117362371A (zh) | 一种核酸合成的方法 | |
| WO2020102980A1 (zh) | 测序用核苷酸的制备方法 | |
| Mundus et al. | [8] Structure determination by directed photo-cross-linking in large RNA molecules with site-specific psoralen | |
| Higgins et al. | The ATP analogue containing a methylene group in place of the 5′ oxygen serves as a substrate for bacteriophage T3 RNA polymerase | |
| CN117567536A (zh) | 荧光标记核苷酸在dna合成测序以及单分子测序中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |