CN112888983A - 用于超分辨率显微的镜头组件 - Google Patents

Abstract

描述了一种用于在低温环境中对样品进行显微成像的镜头组件。具有用于接收待成像样品的平坦表面的固态沉浸式镜头安装在穿过平坦底座的平面设置的孔内。显微成像可以包括使用超分辨率光学成像技术，例如单分子定位技术。

Description

用于超分辨率显微的镜头组件

技术领域

本发明涉及用于对位于低温环境中的样品进行显微成像的镜头组件，以及构造并使用这种镜头组件的方法。例如，显微成像可以包括使用诸如单分子定位技术之类的技术的超分辨率光学成像。

背景技术

常规显微镜的分辨率由于光的衍射而受到限制，可达到的空间分辨率大致由Abbe衍射极限确定。因此，可达到的空间分辨率取决于光学参数(例如，物镜的数值孔径)，并且可以通过各种方式(例如，通过使用液体沉浸技术)增加数值孔径，其中高折射率的流体用于光学耦合物镜和待成像的样品。

在现有技术中也已开发在不改变光学配置的情况下克服光学成像系统的空间分辨率极限的各种附加技术，这些技术通常可以被称为超分辨率显微技术。这样的技术包括例如以下单分子定位技术，在该单分子定位技术中，光发射器被隔离并使用近似点扩散函数拟合它们的位置。

通常希望在低温下进行这种超分辨率显微技术，例如使得玻璃化生物样品能够在其天然状态下精确成像。因此，本发明解决了现有技术的这些方面和其他方面。

发明内容

已经发现，进一步提高超分辨率显微技术(例如，单分子定位显微技术)在低温下的分辨率由于难以使用湿式浸没物镜而更加困难，因为普通显微镜中用于湿式沉浸的流体不适用于这样的低温。因此，本发明的方面支持在低温超分辨率显微镜中使用固态沉浸式镜头(solid immersion lenses)。有利地，非平面固态沉浸式镜头可用于该目的，以进一步提高使用选择的超分辨率显微技术获得的分辨率，而没有使用湿式物镜沉浸流体的困难。

为了这些目的而使用固态沉浸式镜头提高了物镜-固态沉浸式镜头系统的数值孔径和光采集效率，从而提高了显微技术的可用分辨率。

通过这种方式将低温下的单分子定位显微技术或其他超分辨率光学显微技术与固态沉浸式镜头相结合允许在低温条件下实现几十纳米的图像分辨率，因此，它提供了适合在相关成像操作中以相似分辨率与相同样品的电子显微图像结合的图像分辨率。这两种技术之间的这种相关成像可能特别有利于使用玻璃化技术对以接近天然状态保存的生物样品进行成像。

因此，本发明提供了一种用于在低温环境下对样品进行显微成像的镜头组件，所述镜头组件包括：底座，所述底座包括穿过所述底座的孔；固态沉浸式镜头，所述固态沉浸式镜头包括用于接收待成像样品的平坦表面，所述固态沉浸式镜头安装在所述孔内。具体地，底座可以被描述为平坦底座，并且孔随后可以穿过平面，例如底座的主平面。当然，尽管可以将底座描述为平面的或大体上平面的，但这不排除一个或多个特征的可能性，例如用于处理或定位的伸出平面的元件。

具体地，固态沉浸式镜头可以是非平面固态沉浸式镜头ASIL，在光学性能方面具有如下所述的附加优点。

镜头的平面可以平行于或基本平行于底座的平面，或者平行于用于将镜头组件定位在一个或多个显微镜内的底座的平面。以此方式，例如即使在这种显微镜内镜头组件的任意轴向旋转的情况下，也仔细地控制和预测固态沉浸式镜头的光轴，从而提高了显微镜的性能和固态沉浸式镜头的使用。

通常，固态沉浸式镜头可以沿着背离底座平面的两个方向从孔延伸穿过底座。然后可以将固态沉浸式镜头固定在孔内的最大直径的区域处或附近，该区域是镜头的赤道或赤道区域。

孔可以包括在平坦底座和固态沉浸式镜头之间的圆周通道，然后平坦底座可以包括朝着固态沉浸式镜头延伸到圆周通道中的多个尖端或突起，以便对准、支撑或控制固态沉浸式镜头的位置。具体地，尖端当位于孔中时可以帮助提供镜头的准确位置，使得可以在镜头和平坦底座之间进行后续粘结，以保持该准确的位置，例如，尽管有例如例如毛细作用的流体力趋向于将镜头拉离所选位置。

尖端可以例如在整个圆周通道上延伸，或者可以稍短一些，例如在整个通道上延伸超过90％，以接触固态沉浸式镜头。

为此，可利用至少三个这样的尖端来确保相等的毛细作用力，因此不优先在任何特定方向上拉动镜头。多个尖端可以围绕圆周通道均匀地分布，即彼此以基本上相等的间隔分布，以进一步确保不优先在任何特定方向上拉动镜头。

镜头组件可以包括在圆周通道内的粘合材料，该粘合材料桥接在平坦底座和固态沉浸式镜头之间。优选地，除了上述尖端之外，还提供该粘合材料，但是以特定方式涂覆粘合材料可能有利于进一步避免镜头和底座的不期望的未对准(尽管尖端的定位作用，这仍然可能发生)。具体地，粘合材料可以围绕圆周通道连续地延伸，以便为底座内的镜头提供牢固的支撑。这种粘合材料可以覆盖尖端。

固态沉浸式镜头通常可以是球形的，并具有上述的平面样品表面。然后，穿过固态沉浸式镜头的赤道横截面通常可以是圆形的。尽管可利用其他形状和形式，但孔类似地可以是圆形，并且任选地，平坦底座的外围或圆周也可以是圆形的。通过使孔口具有与要被保持在孔内的镜头的圆周基本相同的形状，有助于在整个圆周通道周围均匀地涂覆粘合材料，并且还有助于避免镜头发生未对准，例如由于未固化的粘合剂在涂覆时的流体力，以及由于在固化过程中可能发生的应变。

底座可以由金属、陶瓷和半导体形成，或者可包含金属、陶瓷和半导体中的至少一种。如果使用金属，可利用则它可以是铂或另一种生物相容性金属，尽管可利用其他金属和材料。

本发明还提供了一种使用如上所述的镜头组件的设备，例如一种用于对样品进行超分辨率光学显微的设备，包括：在固态浸没镜头的平坦表面上或与之相邻的样品；固态沉浸式镜头的平坦表面上或附近的样品；样品所处的低温环境；以及超分辨率光学显微镜，被设置为提供样品的超分辨率光学图像，例如通过固态沉浸式镜头获得的图像。

本发明还提供了所述镜头组件的制造或构造方法，例如，安装用于在低温环境下对样品进行显微成像的固态沉浸式镜头的方法，固态沉浸式镜头包括用于接收样品进行成像的平面，该方法包括：提供底座，例如大体上平面的底座，包括穿过底座的孔；将所述固态沉浸式镜头安装在所述孔内，以使圆周通道将固态沉浸式镜头和底座分开，并且使固态沉浸式镜头沿着背离底座的两个方向从孔延伸，或更具体地背离底座的主平面延伸。

如上所述，孔可以包括多个尖端或突起，并且安装步骤然后可以包括将固态沉浸式镜头定位在孔内并且与每个尖端的尖端接触或接近，使得每个尖端都朝着固态沉浸式镜头的近端部分延伸到圆周通道中，并且任选地越过或基本上越过圆周通道以接触或几乎接触固态沉浸式镜头。

安装步骤可以包括使用粘合材料将固态沉浸式镜头固定在孔内的后续步骤。然而，尽管使用尖端进行精确定位，但是这种液态的粘合材料可以在镜头上施加大的流体和固化力，从而导致镜头不期望的未对准。

因此，固定步骤可以包括以下步骤：将第一粘合材料放置在每个尖端处、每个尖端上或周围，以将固态沉浸式镜头固定到尖端处的底座上。然后可以在采取进一步的步骤之前使第一粘合材料固化。

固定步骤然后可以任选地还包括后续步骤：将第二粘合材料放置在每个尖端处、每个尖端上或周围，以将固态沉浸式镜头进一步固定到尖端处的平坦底座上，并使第二粘合材料固化。在这种情况下，第一粘合材料的固化时间可以短于第二粘合材料的固化时间，因为已经使用第一粘合剂至少部分地固定镜头，所以不太可能移动，并且更长的固化时间可利用第二粘合剂提供更牢固的结合。

无论是否如上所述使用第二粘合材料，固定步骤都可以包括后续步骤：围绕圆周通道放置第三粘合材料，例如，沿着镜头周围的通道的整个长度或至少大约90％的通道，并且允许第三粘合剂固化。具体地，可以为此目的使用低温兼容的粘合剂。

为了提供一种合适的固定机构，以提供如上所述的固态沉浸式镜头和用于粘合剂应用的平坦底座，方法还可以包括：提供一种治具或平台，该治具或平台具有在治具的上表面中形成的第一通道或沟槽，以及在第一通道的底板中形成的第二通道或沟槽。第一和第二通道可以是线性的和平行的。然后将平坦底座定位或放置在第一通道中，其底板支撑平坦底座，然后将固态沉浸式镜头放置在第二通道中，其具有在第一通道内的深度和位置，使得固态沉浸式镜头位于穿过底座的平面的孔内，例如使得固态沉浸式镜头的赤道区域位于孔内。固态沉浸式镜头可以被定向为使得镜头的平面位于第二通道的底板上。通过将第一和第二通道的底板设置为平行平面，这可以用于确保固态沉浸式镜头和平坦底座在使用粘合材料进行粘合之前也平行。

本发明还提供了使用镜头组件的方法，例如对样品进行超分辨率光学显微的方法，该方法包括：提供如上所述的镜头组件；将样品定位在固态沉浸式镜头的平坦表面上或附近；将样品定位在低温环境中；并且使用超分辨率光学显微技术通过固态沉浸式镜头对样品进行成像，以提供样品的超分辨率图像。

例如，超分辨率光学显微技术可以是单分子定位光学显微技术。

本发明还提供了相关成像的方法，例如，包括以下步骤：执行如上所述的超分辨率光学显微的方法，以提供样品的超分辨率光学图像；对样品进行电子显微镜或X射线显微，以提供样品的另外的图像；并且将每个样本的超分辨率光学图像和另外的图像相关，以提供样本的相关图像。

当在本文档中提到低温环境时，这种环境可以提供以下至少一种：低于200开尔文的温度；低于133开尔文的温度；低于100开尔文的温度；低于77开尔文的温度；使用液氮进行维持；或使用氮蒸气进行维持。

附图说明

现在将通过示例的方式、参考附图描述本发明的实施例。

图1和图2以透视图和平面图示出了体现本发明的镜头组件，为清楚起见，省略了通常也使用的粘合材料；

图3对应于图2，但也示出了粘合材料。

图4提供了使用图1至图3的镜头组件对位于低温环境中的样品进行超分辨率显微的设备的示意图。

图5示出了使用治具对准镜头组件的部件；

图6提供了一种包括使用粘合材料的用于构造镜头组件的方法的流程图；并且

图7提供了使用镜头组件进行相关成像的方法的流程图。

具体实施方式

现在参考图1，以透视图示出了镜头组件10，该镜头组件用于在低温环境中对样品进行显微，例如超分辨率光学显微。在图2中示出了相应的平面图，并且图3示出了也处于适当位置的下述粘合材料的相应的平面图。为了清楚起见，图1和图2中省略了通常在这些布置中使用的粘合材料。

用于成像或使用显微镜进行其他分析的样品(在这些图中未示出)可以位于与固态沉浸式镜头14的平面12相邻或接触的位置。具体地，并且如图1所示，它可以提供为非平面固态沉浸式镜头(ASIL)，其采用下面将更详细讨论的截头球形镜头的形式。镜头组件还包括平坦底座20，其具有相对的且通常平行的主面24、26，在图1中分别示出为上表面和下表面，但是要注意，可以以任何选择的方向使用镜头组件。平坦底座20和主面在平坦底座的主平面中延伸。平坦底座设有穿过底座20的平面的孔22，并且固态沉浸式镜头被安装或固定在该孔内。

如图1所示，固态沉浸式镜头14可以沿着背离底座的主平面的两个方向从孔22延伸，在图1中示出为从底座的平面向上和向下延伸。具体地，可以将固态沉浸式镜头14安装成使得固态沉浸式镜头的赤道区域固定在孔内。

固态沉浸式镜头14可以安装在孔内，使得固态沉浸式镜头的平面12平行于或基本平行于底座的主平面，例如基本平行于平坦底座的一个或两个相对的主面24、26。基本上平行可以是，例如，与相对的面24、26和/或主平面中的一个或两个平行的在约1度以内或在约0.1度以内。当将镜头组件安装在合适的显微镜设备内时，这使用户对平面12的取向具有高度的信心。

图1所示的平坦底座20的外周在平面上是圆形的，并且孔22也是圆形的并且位于平坦底座的中心。然而，可利用用于平坦底座的外周的其他形状以及用于孔的其他形状和位置，例如，根据需要，这些形状可以是正方形、矩形、其他多边形的形式、不规则形状等等。底座通常可以由例如单种材料(例如属、陶瓷或半导体)形成，但是例如可以在层、涂层中使用两种或更多种不同的材料，或者增加功能性特征。如果将生物样品与镜头组件一起使用，则生物相容性材料(例如铂)可以优选用于平坦底座的材料。还可以优选的使用具有特定热膨胀系数的材料作为底座，该热膨胀系数接近于固态沉浸式镜头材料，并且任选地也接近用于将镜头粘合到底座上的粘合剂的材料，尤其是下面描述的第三粘合剂。

如果需要，图中所示的平坦底座可以通过平坦底座的主平面内或延伸出的其他特征和结构来增强，例如有助于处理、安装或校准镜头组件和已安装的固态沉浸式镜头的位置的结构，或有助于激光加工或取向的结构。

固态沉浸式镜头由多个尖端28或刺突支撑在孔中，该尖端或刺突从孔22的外周延伸到圆周通道30中，该圆周通道围绕固态沉浸式镜头14的圆周在镜头和平坦底座之间延伸。在图1和2中，提供了三个这样的尖端，但是可利用三个以上的尖端，例如四个、五个或六个。尖端优选地设置成当将固态沉浸式镜头放置在选定位置的孔中时(例如，在镜头的赤道区域处接触)，使其几乎接触固态沉浸式镜头的圆周，例如，在整个圆周通道上延伸至少90％的距离，但是当将镜头放置在孔内时，尖端可以形成为稍长一些，以便实际接触甚至变形。

尖端通常可以形成为圆锥形或尖头形，尽管可利用其他形状和形式，并且通常可以各自在其基部周围仅围绕孔的外围延伸一小部分距离，例如，每个尖端28的外周不超过5％。

尽管尖端28可用于将固态沉浸式镜头14对准并定位在孔22内，但是它们并不旨在在处理和使用完整的镜头组件期间将镜头保持在适当的位置。因此，如图3所示的粘合材料32也设置在圆周通道30内，以便通过在平坦底座中的孔的外周与固态沉浸式镜头之间桥接来更好地将镜头固定在位。粘合材料32可以以此方式围绕通道的圆周连续地延伸，可以覆盖尖端，并且还可以基本上填充通道的深度，并且如果需要，可以任选地完全填充甚至延伸到通道外。如以下更详细讨论的，可以将粘合材料提供为在制造过程的不同阶段涂覆的两种或更多种不同的粘合材料，例如，首先在尖端28附近涂覆第一粘合材料，然后在圆周通道30周围涂覆至少第三粘合材料。

图中所示的镜头组件的一些典型尺寸可以是：平坦底座的直径在大约2至6mm的范围内，固态沉浸式镜头的直径为约0.5至3mm，并且平坦底座的厚度为约0.1至0.4mm。每个尖端从孔的外周朝着或朝着固态沉浸式镜头的延伸长度以及因此圆周通道30的近似宽度可以例如为约5至20μm。

构造镜头组件以使镜头组件的外部尺寸和形状总体上与典型的电子显微镜栅格的尺寸和形状相对应是有利的，尽管通常也使用其他直径，但它们通常以直径约为3毫米的圆形和平面形式提供。以此方式，具有相关样品位于固态沉浸式镜头14的平面12上的特定镜头组件10可以更容易地用于光学显微镜和电子显微镜的两种操作，例如，在这两种技术之间的相关成像过程中，例如在使用超分辨率显微技术的情况下。

图4示出了用于在低温环境42中对样品40进行光学显微术，并且更具体地是超分辨率光学显微术的设备。镜头组件10在此以横截面示出。如上所述，样品40位于与镜头组件10的固态沉浸式镜头14的平面12相邻或接触的位置。

一个或多个光源46用于形成通常在例如通过分束器52传递到物镜50之前利用探测光学器件48调节或控制的探测光。物镜50对准固态沉浸式镜头14，以将探测光传送到样品，并且从样品收集图像光，以传递到一个或多个成像元件54，例如CCD或CMOS相机。从样品40通过固态沉浸式镜头14到一个或多个成像元件54的图像光的路径可以借道分束器52和图像光学器件56。

至少样品40被包含在低温环境42内，但是固态沉浸式镜头14和镜头组件10中的一些或全部也可以方便地被包含在低温环境内。低温环境可能会使样品的温度低于200开尔文，低于133开尔文，低于100开尔文，或低于77开尔文，或者可替代地可以定义为通过使用液氮或氮蒸气或其他冷冻剂进行维护，例如，这种致冷剂接近或接触样品40和/或固态沉浸式镜头14。

样品40可以是例如生物或其他材料的薄样品或薄膜，或包含生物或其他材料的薄样品或薄膜，例如一种或多种细胞、细胞器、膜等。可替代地，样品可以由较厚的样品元件(例如由生物材料形成的元件)或由非生物材料(例如待研究的无机材料块)形成的表面区域提供，例如包括量子点。如图4所示，样品可以与固态沉浸式镜头14接触，或者可以稍微偏离镜头表面，尽管通常小于约100nm。

图4的布置用于在低温环境42中对样品40执行超分辨率显微。超分辨率显微镜用于获得超过所用光学装置的衍射极限的样品的图像分辨率。在图4的布置中，例如，超分辨率显微镜超越包括物镜50和固态沉浸式镜头14的布置的衍射极限。

可利用多种不同的超分辨率显微技术，但此技术通常可以是单分子定位技术。典型地，成像元件54在这种技术中用于对样品40依次成像多次，其中在每个图像中仅表示样品中分子的小且不同的子集。这样，可以在每个图像中分别识别被视为单个点的单分子，因此，其位置定位要比光学装置的衍射极限更好，例如，通过将预期点扩展函数的曲线拟合到每个分子的检测图像，然后定位相应的质心。通过对多个此类图像重复该过程，可以构建更高分辨率样本图像。自然界中只有少数几种类型的分子(例如量子点、有机染料和荧光蛋白)能在原始状态下以时间分辨方式成像。大多数样品都需要额外步骤，才能用荧光发射器标记，从而在照明时产生波动强度。

在某些此类技术中，可以用光学发射器(例如荧光发射器)标记样品的单个分子，并且以引起这些发射器间歇性荧光事件的方式使用或控制探针光，使得每个图像中只有一小部分发射器正在发射。在一些特定实施方案中，超分辨率显微技术可以是随机光学重建显微技术，通常被称为STORM。适用于与本发明一起使用的这种STORM技术的一些特定实施方式参见如Bo Huang等人(Science319,810(2008),"Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy”)和DooryKim等人(PLos ONE 10(4):e0124581,April 2015,"Correlative stochastic opticalreconstruction microscopy and electron microscopy”)。

在制备这种荧光成像技术的样品时，可以按照与其他荧光成像技术大部分相同的方式执行样品染色和标记。许多Alexa Fluor和Atto染料(例如Alexa Fluor 647)可用于STORM成像。除有机染料外，许多荧光蛋白(例如mEOS和PAmCherry)也适用。

然而，本发明可以与各种其他超分辨率显微技术(例如结构照明显微镜(SIM)和受激发射损耗(STED)显微镜)一起使用，以在样品需要被定位在低温环境中的情况下提升图像分辨率。

安装在平坦底座内的固态沉浸式镜头14可以更具体地是非平面固态沉浸式镜头(ASIL)。这样的ASIL的特征可以在于基本上是厚度为r+r/n的截头球形镜头(如图4所示)，其中r是球半径，n是球镜头的材料的折射率。这与半球形固态沉浸式镜头的不同之处在于，基本上平面的截断表面的位置在半球形情况下提供了r的镜头厚度。基本上与样品接触的半球形固态沉浸式镜头可以与物镜50结合使用以提供数值孔径，该物镜具有仅物镜50的数值孔径的n倍。相反，与物镜50组合的非平面固态沉浸式镜头可以实现数值孔径，该数值孔径具有仅物镜50的数值孔径的n2的倍数，直至最大值n。

当然，固态沉浸式镜头仅需要由在各个光学装置中光学使用的表面限定，使得尽管远离待成像的样本的弯曲表面通常基本上是球形的，并且靠近待成像的样本的表面通常是基本平坦的，非平面固态沉浸式镜头的其他部分不一定需要完成图1所示的球形或理想的截头球体。

此外，尽管可利用球形的弯曲表面来实现SIL或ASIL，但是可利用非球形的表面，例如参见Brunner等人(2004)(“Diffraction-based solid immersion lens”,Journal ofthe Optical Society of America,A2(7):1186-1191)和Cohn等人(2002)(“Transientphotoinduced diffractive solid immersion lens for infrared microscopy”,Applied Physics Letters,81(19):3678-3680)。

非平面固态沉浸式镜头还可以提供比半球形固态沉浸式镜头大的有效视场，尽管色差会有一些增大，但这可以通过物镜50和ASIL 14之间的间距对不同波长的光的微小变化来补偿。例如，在Lin Wang等人(Applied Optics,Vol.49,No.31,6160-6169)中讨论了这种像差和设计注意事项。

在图4的布置中利用固态沉浸式镜头或ASIL所导致的数值孔径的增加直接取决于镜头中所用材料的折射率。可利用因此可以利用高折射率的材料，例如折射率为2.2的二氧化锆。镜头的尺寸可以被选择以在例如视场和像差效果的因素之间协调。如果使用球面直径约3毫米的ASIL，并且材料为二氧化锆，则镜头深度约2.18毫米。

利用固态沉浸式镜头14(或更具体地为ASIL)对低温环境42的样品40进行超分辨率显微(如图4所示)允许在光学成像装置中实现更高数值孔径，并且因此在利用成像元件54检测特征的超分辨率定位中的精度更高。一种实现较高数值孔径的替代方式是利用湿物镜，使高折射率沉浸式流体的主体接触湿物镜和样品之间的光学空间接触并与之桥接。但这些高折射率浸没液不耐受与低温环境(通常是待研究样品的性质所必需的)相关的低温，例如，待成像的样本中的目标结构是细胞内细胞器，或者需要玻璃化才能成功完成超分辨率成像过程的其他生物结构。因此，在进行超分辨率显微时，使用固态沉浸式镜头的本发明既提供了比使用湿沉浸式镜头可获得的更高的数值孔径，又提供了低温耐受性。相比之下，根据DIN/ISO的规定，典型显微镜浸油的标准化温度约23摄氏度。某些特殊应用的浸油可以用于18°、20°或37℃的温度。

干物镜50的工作距离应足够长以容纳固态沉浸式镜头14。对于典型的工作布置，合适的镜头可以是50倍Mitutoyo Plan Apo无限远校正长焦WD物镜(NA 0.55，工作距离13mm)。

根据瑞利准则，物镜50和非平面固态沉浸式镜头的组合的光学分辨率为：

d＝0.61λ/(n² NA)

这里，λ是采集的图像光的波长，n是ASIL材料的折射率，NA是干物镜的数值孔径。注意，n2和NA的乘积取n的最大值。

然后可以利用定位精度评估基于检测图像中单分子的超分辨率技术的分辨率性能：

σ＝d/√N

这里，N是从每个单分子收集的光子数。因此，这种超分辨率技术的定位精度可以表示为：

σ＝0.61λ/(n² NA√N)

例如，给定光波长为500nm，保守光子数为1000，典型工作布置的定位精度为15nm。

在本发明的镜头组件中使用的固态沉浸式镜头或ASIL可以是可商购的，例如，购自Knight Optics(https：/www.knightoptical.com)或购自AWI(http://www.awi-industries.com)。可以通过激光切割或其他工艺(例如微加工、光蚀刻或光刻)从一片合适的材料(例如一片铂金属)上方便地形成平坦底座，该切割过程包括形成尖端28。

然后，可以通过使固态沉浸式镜头14与平坦底座20在所需位置对准(例如使用图5所示的治具布置)来构造或组装以上讨论的镜头组件10，然后按照以下讨论并如图6所示分多个阶段执行粘合过程。

图5示出了如何使用这里以横截面示出的治具70来对准平坦底座20和固态沉浸式镜头14。治具70包括第一沟槽72，该第一沟槽具有优选平坦的底板74，并且具有足以将平坦底座20容纳在第一沟槽72内的宽度。例如，第一沟槽可以刚好比平坦底座稍宽，并且第一沟槽72的侧壁76可以在沿着沟槽的长度的方向上(进入/离开图平面)平行。

治具70还提供第二沟槽80，该第二沟槽优选地位于第一沟槽的底板74中央，并且提供更深的底板82，该底板也优选是平坦的，并且具有足以容纳固态沉浸式镜头的宽度，例如，使得固态沉浸式镜头的平坦表面12停放在底板82上。第二沟槽可以比第二沟槽的顶部处的固态沉浸式镜头稍宽一些，以提供紧密配合。

第一沟槽和第二沟槽的深度被配置成使得固态沉浸式镜头12当位于第二沟槽中时并且平坦底座当位于第一沟槽中时相对于彼此精确地定位在期望的位置和取向上。具体地，第一沟槽72的底板74的平面和第二沟槽的底板82的平面可以是平行的或基本平行的(例如，以大于1度或大于0.1度的公差)，为了确保完成后，固态沉浸式镜头的平面平行于平坦底座的主平面，或者平行于平坦底座的下表面24和上表面26中的至少一个。

还可以通过提供第二沟槽80的适当深度来设置固态沉浸式镜头的位置，根据该位置，镜头的哪个部分与尖端28接触或非常接近。例如，固态沉浸式镜头的赤道或最宽周长可能会与尖端接触，并且位于与平坦底座相邻的位置，这可以提供最安全的位置来将镜头固定并安装到一起，尽管如有需要，其他位置也是可行的。当镜头和底座正确定位时，每个尖端28应在底座和镜头之间的圆周通道30上延伸，以使镜头与每个尖端接触或非常接近。

通过使所有第一沟槽和第二沟槽的侧壁平行，使这些沟槽延伸以在治具的一端敞开，并且任选地延伸以在治具的两个相对端敞开，执行对准过程的用户可以在下面讨论的进一步粘结操作之前和期间，通过肉眼或使用合适的光学装置更容易地沿着沟槽看到平坦底座和固态沉浸式镜头，以检查正确的对准。例如，镜头的球形表面很难从上方看到镜头是否平放在第二沟槽中，可利用沿第二沟槽底部的视线检查，并且从治具的端部看到的侧视图也可用于确保底座平放在第一沟槽中，并且确保镜头正确地定位在底座内。

类似地，可利用机器视觉系统自动进执行这种检查，该机器视觉系统也可以从治具上方检查镜头和底座的位置。

还可在第一沟槽和第二沟槽之间的边界处设置另外的槽口90，使得在镜头和底座之间的圆周通道位于这些沟槽90上方，而不是直接在第一沟槽的底板上方。这些槽口然后降低了放置到圆周通道中的粘合材料也粘合到治具70上的可能性。

已经提供了平坦底座20和固态沉浸式镜头14的准确相对位置，例如，使用图5或类似的治具，固态沉浸式镜头通过尖端28(未在图5中示出)被保持在平坦底座的孔22内的合适的中心位置。然后可利用一种或多种粘合材料将镜头更牢固地固定在适当的位置，例如，使用以下所述的方法以及如图6的流程图所示的方法。粘合材料通常可以通过手或机器通过适当的小喷嘴或使用抹刀或其他载体(例如稀薄的头发或睫毛)来涂覆，并且任选地在视觉辅助例如立体显微镜的引导下涂覆。

如图6所示，第一步102包括将固态沉浸式镜头14和平坦底座20相对于彼此精确地定位在期望的位置和取向上。然后在步骤104中，在每个尖端处涂覆第一粘合材料，以便在光圈的外周和与尖端相邻的镜头之间粘合，并且允许干燥或固化，以便在这些区域中将镜头初步粘合到平坦底座上。因为固态沉浸式镜头很小，所以可以通过第一粘合剂的表面张力和其他流体作用将其容易地从孔22内的期望位置拉开。仅在尖端附近涂覆相对少量第一粘合材料可最大程度地减少这种影响，使得，当第一粘合材料已经充分固化时，镜头就足够牢固地固定在位，以允许涂覆其他粘合材料，而不会有镜头被另一粘合材料拉出位置的危险。例如，在图6的第二步骤中涂覆的第一粘合材料的体积可以小于在后续步骤中涂覆的其他粘合材料的体积的20％，或小于10％。

还期望在每个尖端处使用相似量的第一粘合材料，以便在每个尖端处的镜头上的粘合剂的拉力作用之间提供力的平衡或均衡，例如由于粘附力和/或表面张力。

当第一粘合材料已充分固化时，可以在一个或多个其他步骤中涂覆其他粘合材料，如图6所示。在某些情况下，可以执行也仅在尖端附近涂覆第二粘合材料的步骤106。在这种情况下，第一粘合剂可以是比第二粘合剂固化更快的粘合剂，例如第一粘合剂而言小于约五分钟，并且第二粘合剂而言小于约几小时。

在例如在步骤104中以及任选地在步骤106中，在尖端附近涂覆粘合材料之后，在图6的步骤108中，沿着平坦底座和固态沉浸式镜头之间的圆周通道30的大部分或全部长度涂覆第三粘合材料。由于任何间隙都可以在使用过程的冷却过程中引起热收缩问题并提供粘结的潜在失效部位，因此可能需要涂覆粘合剂以使其连续且沿圆周通道无间隙。例如，可以涂覆足够体积的第三粘合材料以填充通道。

该第三粘合材料优选地是低温相容性胶，特别是当在低温条件下使用时为了热稳定性而选择。这样的低温相容性胶包括可从Henkel AG以Loctite品牌购买的Stycast导热环氧密封剂(例如，参见http://www.loctite.co.uk)。一种此类合适的产品是与Catalyst23LV固化剂一起使用的Stycast 2850FT，例如可购自Lakeshore CryotronicsInc.。

通常，用于涂覆在通道30的整个圆周上的粘合材料可以具有比第一或第二粘合材料更慢的固化粘合剂，例如在升高的温度下加热固化数小时。

如果需要的话，上述第一和第二粘合材料也可以是低温相容性胶，例如合适的环氧密封剂，尽管对于这些材料，低温兼容的需求可能更低。如果需要，如上所述或如图6所示，可以将相同的粘合材料用于两个或多个粘合阶段。

使用将固态沉浸式镜头固定在平坦底座内的这些描述的方法(包括使用上述的尖端结构)使得能够更精确地固定镜头，同时降低了在涂覆粘合材料期间发生与预期位置的偏移的不希望的风险。

本发明可用于对样品实施相关成像，其中使用以上讨论的并在图4中说明的低温超高分辨率显微技术获取的图像数据与使用电子显微镜和/或X射线显微镜获取的图像数据进行组合或关联，而电子显微镜和/或X射线显微镜也对处于低温环境中的一个或多个样品进行了处理。为此，图7是示出相关成像方法的流程图。

在图7的步骤300中，例如，如本文中其他地方更详细地讨论的那样，制备了样品，该样品与固态沉浸式镜头14的平面12接触或紧邻，例如包括在如上所述的镜头组件10中的ASIL。然后可以将镜头组件加载到合适的低温恒温器中，以将样品保持在低温环境42内。

然后，为了获得样品的超分辨率图像数据360，样品经过如本文其他部分所述的低温超分辨率显微技术。

已经获得超分辨率图像数据360，然后在图7的步骤330中对样品执行电子显微技术，以便获得样品的电子显微镜图像数据370。方便地，已准备好使样品与用于超分辨率显微镜步骤320的固态沉浸式镜头接触或相邻，固态沉浸式镜头和镜头组件可以在电子显微步骤330期间继续充当样品的支撑物，而不会对样品造成明显的干扰。如果在超分辨率显微过程中镜头组件位于低温恒温器内，则镜头组件可以保留在同一低温恒温器中，以转移到电子显微镜装置中并在其中使用。

电子显微镜布置可提供各种不同类型的电子显微镜以对样品进行成像，如扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)布置。对于一些这样的技术，在超分辨率显微镜步骤320之前和在电子显微镜步骤330之前，进一步制备样品会是合适的。如果需要，可颠倒图7的超分辨率显微镜和电子显微镜阶段，和/或其他显微镜阶段，例如包括相同或不同显微镜、超分辨率显微镜和电子显微技术的其他成像阶段。可利用例如X射线显微技术(例如软X射线显微技术)以及电子显微技术或代替电子显微技术。

在已经获得相同样品的超分辨率图像数据360和电子显微镜图像数据370之后，(例如)可利用基准标记或特征检测算法对准或关联图像数据对，使得样品中的结构特征重合。然后，如果需要，可利用这种对准将超分辨率图像数据360和电子或X射线显微镜图像数据370进行组合以形成样本的组合或相关图像380。

与超级显微镜图像360或单独考虑的电子或X射线显微镜图像相比，样品的这种组合或相关图像380可以提供显著的有益效果。例如，相关的光和电子或X射线显微镜在细胞超微结构的背景下，提供了一种分子分布和特定生物分子的组织的多模态成像解决方案。

通过提供更适合在超分辨率光学显微镜装置和电子显微镜装置中使用并且被构造成在低温下健壮的镜头组件，可以使这种相关成像更加可靠和方便。

尽管已经描述了本发明的特定实施方案，但是本领域技术人员将理解，可以在不脱离本发明范围的情况下进行各种修改和变化。

例如，也可利用所描述的设备和方法实现单分子定位显微镜，其他已建立的超分辨率显微技术，例如结构照明显微镜、受激发射损耗(STED)显微镜、超分辨率径向波动(SRRF)技术、超分辨率光学波动成像(SOFI)以及可逆的可饱和光学线性荧光跃迁(RESOLFT)技术。

Claims (24)

1.一种用于在低温环境下对样品进行显微成像的镜头组件，所述镜头组件包括：

平坦底座，所述平坦底座包括穿过底座的平面的孔；以及

固态沉浸式镜头，所述固态沉浸式镜头包括用于接收样品以进行成像的平坦表面，

所述固态沉浸式镜头安装在所述孔内。

2.根据权利要求1所述的镜头组件，其中，所述固态沉浸式镜头是非平面固态沉浸式镜头ASIL。

3.根据权利要求1或2所述的镜头组件，其中，所述镜头的平坦表面平行于所述底座的平面。

4.根据前述权利要求中任一项所述的镜头组件，其中，所述固态沉浸式镜头沿着背离所述底座的平面的两个方向从所述孔延伸。

5.根据权利要求4所述的镜头组件，其中，所述固态沉浸式镜头的赤道区域被固定在所述孔内。

6.根据前述权利要求中任一项所述的镜头组件，其中，所述孔包括在所述平坦底座和所述固态沉浸式镜头之间的圆周通道。

7.根据权利要求6所述的镜头组件，其中，所述平坦底座包括多个尖端，所述多个尖端朝着所述固态沉浸式镜头延伸到所述圆周通道中并且任选地接触所述固态沉浸式镜头。

8.根据权利要求6或7所述的镜头组件，还包括在所述圆周通道内的粘合材料，所述粘合材料桥接在所述平坦底座和所述固态沉浸式镜头之间。

9.根据权利要求8所述的镜头组件，其中，所述粘合材料围绕所述圆周通道连续地延伸。

10.根据前述权利要求中任一项所述的镜头组件，其中，穿过所述固态沉浸式镜头的赤道横截面是圆形的，所述孔是圆形的，并且任选地其中，所述平坦底座的圆周是圆形的。

11.根据前述权利要求中任一项所述的镜头组件，其中，所述底座由以下各项中的至少一种形成：金属、铂、陶瓷和半导体。

12.一种用于对样品进行超分辨率光学显微的设备，包括：

根据前述权利要求中任一项所述的镜头组件；

位于所述固态沉浸式镜头的平坦表面上或附近的样品；

所述样品所处的低温环境；以及

超分辨率光学显微镜，被设置为通过所述固态沉浸式镜头获得所述样品的超分辨率光学图像。

13.一种安装固态沉浸式镜头的方法，所述固态沉浸式镜头用于在低温环境下对样品进行显微成像，所述固态沉浸式镜头设有用于接收待成像的样品的平坦表面，所述方法包括：

提供平坦底座，所述平坦底座包括穿过所述底座的平面的孔；并且

将所述固态沉浸式镜头安装在所述孔内，以使圆周通道将所述固态沉浸式镜头和所述平坦底座分开，并且使所述固态沉浸式镜头沿着背离所述底座平面的两个方向从所述孔延伸。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述孔包括多个尖端，并且安装步骤包括将所述固态沉浸式镜头定位在所述孔内，与所述尖端中的每一个接近或接触，使得每个尖端延伸到所述圆周通道内或穿过所述圆周通道。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述安装步骤包括后续步骤：使用粘合材料将所述固态沉浸式镜头固定在所述孔内。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述固定步骤包括以下步骤：将第一粘合材料置于所述尖端中的每一个上，以将所述固态沉浸式镜头固定到所述尖端处的所述平坦底座上，并且使所述第一粘合材料固化。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述固定步骤包括以下步骤：将第二粘合材料放置在所述尖端中的每一个上，以将所述固态沉浸式镜头进一步固定到所述尖端处的所述平坦底座上，并且允许所述第二粘合材料固化，其中，所述第一粘合材料的固化时间比所述第二粘合材料的固化时间短。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，所述固定步骤包括后续步骤：沿着所述圆周通道的长度放置第三粘合材料，并且允许第三粘合剂固化。

19.一种方法，包括：

提供一种治具，所述治具具有第一线性通道和第二线性通道，所述第一线性通道形成在所述治具的上表面上，所述第二线性通道平行于所述第一线性通道并形成在所述第一线性通道的底板；

将所述平坦底座定位在所述第一线性通道中；

将所述固态沉浸式镜头定位在所述第二线性通道中，使得所述固态沉浸式镜头位于穿过所述底座的平面的孔内；以及

执行根据权利要求13至18中任一项所述的步骤。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述治具设有槽口，所述槽口沿着所述第一线性通道和第二线性通道之间的每个边界形成在所述第一线性通道的底板上。

21.一种对样品进行超分辨率光学显微的方法，包括：

根据权利要求1至11中任一项或通过执行根据权利要求13至20中任一项所述的步骤，提供镜头组件；

将所述样品定位在所述固态沉浸式镜头的平坦表面上或附近；

将所述样品定位在低温环境中；以及

使用超分辨率光学显微技术通过所述固态沉浸式镜头对所述样品进行成像，以提供所述样品的超分辨率图像。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述超分辨率光学显微技术是单分子定位光学显微技术。

23.一种相关成像的方法，包括以下步骤：

执行根据权利要求21或22所述的步骤，以提供所述样品的超分辨率光学图像；

对所述样品进行电子显微镜或X射线显微，以提供所述样品的另外的图像；并且

将每个样本的超分辨率光学图像与所述另外的图像相关，以提供所述样本的相关图像。

24.根据前述权利要求中任一项所述的设备或方法，其中，所述低温环境是以下各项中的至少一种：低于200开尔文的温度；低于133开尔文的温度；低于100开尔文的温度；低于77开尔文的温度；使用液氮进行维持；以及使用氮蒸气进行维持。

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