CN112888779A - 制备无病毒血小板裂解物材料的方法 - Google Patents

制备无病毒血小板裂解物材料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于制备活细胞培养底物的材料的制备方法。本发明进一步涉及血小板裂解物材料及其用途。本发明提出问题的解决方案基于至少两种不同处理方法与不同病毒灭活程序的组合。结合使用两种或两种以上的病毒颗粒和/或病毒成分灭活程序，可以确保灭活各种病毒(例如包膜和非包膜病毒)，从而为临床和药物应用提供安全的产品。此外，还提供一种包含血小板裂解物的血小板裂解物材料，其中所述材料是基本上不含病毒颗粒和/或病毒成分的液体或干燥材料。

Description

制备无病毒血小板裂解物材料的方法
发明背景
本发明主要涉及一种用于制备活细胞培养底物的材料的制造方法。本发明进一步涉及血小板裂解物材料及其用途。
现有技术
细胞通常在补充胎牛血清(FCS)或其他血液血清的培养基中培养，以便为细胞提供必需的生长因子。尽管实际上并不是任何类型的细胞都需要血清进行培养，但是，到目前为止，大多数敏感细胞(例如干细胞)仍然依赖于含血清的培养基。然而，鉴于潜在的异种免疫反应(例如抗-FCS抗体)、牛病原体(病毒和朊病毒)以及妨碍结果重现性的高度批次间差异性，因此在治疗应用方面，人们越来越避免使用FCS。化学定义的合成培养基现在可以在市场上买到，但它们的精确组成常常是不公开的，而且它们通常包括其他异种成分，如重组生长因子。
人血小板裂解物(HPL)由于不含任何异种成分，因此已被证明是干细胞扩增的最佳选择，不仅在基础研究中，而且在临床和治疗应用中也是如此。
WO 2017/207688 A1涉及一种三维凝胶状底物制备用材料的制备方法，其中提供血小板浓缩物并且从该血小板浓缩物收获血小板。然后，将血小板裂解得到血小板裂解物，并且然后将所述血小板裂解物冻干，从而提供干燥的血小板裂解物材料。所述冻干材料很容易在使用地点加水重构，从而提供具有全部功能的血小板裂解物凝胶，可用于培养活细胞而不受任何限制。因此，该方法有助于凝胶材料的运输，并确保血小板裂解物凝胶的保存期限更长，而对细胞培养特性没有任何影响。
从US 2013/0195959 A1可以知晓一种制备冻干血小板裂解物的方法。该文献公开了一种制备适合治疗用途或用作培养基的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：从血小板源浓缩血小板以形成血小板源的富血小板部分，以及将富血小板部分中的血小板进行裂解，从而形成多种裂解物。另一步骤包括冻干裂解物，从而在具有释放浓度的可用生长因子、细胞因子和趋化因子的组合物中形成冻干血小板裂解物。这些冻干的血小板裂解物可以以干燥形式施用或在施用前重新水化，或以凝胶形式施用。
此外，WO 2013/076507 A2公开了包含血小板裂解物的药物组合物及其治疗用途。所述组合物可用于治疗伤口。将血小板裂解物冻干，得到含有生长因子的稳定的冻干粉末，其可用于伤口愈合治疗应用，但也可用于其中对递送自然生长因子的需求增加的其它治疗应用。冻干的血小板裂解物可在培养基或生理盐水中再悬浮，过滤消毒，然后用于制备富含血小板的血浆凝胶。
然而，尽管人血小板裂解物是培养间充质干细胞(MSC)的常用补充物，与胎牛血清相比，它不存在异种免疫反应或牛病原体传播的风险，但在临床和药物应用方面仍然存在病毒污染的问题。特别是对于任何基于人源性辅助材料的临床应用来说，病毒安全性是需要考虑的主要方面之一。因此，当制备用于扩增干细胞或其他治疗上适用细胞的底物时，减少或完全消除任何病毒污染风险至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备活细胞培养底物的材料的制备方法，所述方法完全消除或至少降低任何病毒污染的风险。
所述目的通过提供一种用于制备活细胞培养底物的材料的制备方法得以实现，所述方法包括：
-提供血小板裂解物，以及
-使所述血小板裂解物经历至少两种不同的处理，每种处理能够使病毒颗粒和/或病毒组分失活，从而提供无病毒或至少病毒减少的血小板裂解物材料。
本发明提出问题的解决方案基于至少两种不同处理方法与不同病毒灭活程序的组合。结合使用两种或两种以上的病毒颗粒和/或病毒成分灭活程序，可以确保灭活各种病毒(例如包膜和非包膜病毒)，从而为临床和药物应用提供安全的产品。由于每个病毒灭活程序通常只灭活一种病毒或最多灭活几种病毒，因此不同灭活程序的组合显著提高了安全性。因此，根据本发明的方法，提供了一种扩增干细胞或其他治疗上适用细胞的安全的血小板裂解物材料，并且没有或至少显著降低了病毒污染的风险。
在本发明的有利实施例中，所述处理包括从由巴氏杀菌、干热、蒸汽热、紫外线照射、γ射线照射、X射线照射、电子束照射、纳滤和溶剂/洗涤剂处理组成的组中选择的至少两种不同的处理。基本上，所述处理程序的选择取决于待灭除的病毒类型(dsDNA、ssDNA、ssRNA等)和待处理材料的组成(高蛋白含量、低蛋白含量、无蛋白等)。然而，对于血小板裂解物，上述规定的处理被证明是有效灭活病毒颗粒和/或病毒成分的最有效和最温和的程序。
巴氏杀菌：一种用温和的热量(即低于100℃)处理材料的方法，例如，加热溶液中的生物分子，通常在60℃进行。
干热：一种例如在冷冻干燥后，通常在80℃或更高的温度下加热干燥材料的方法。
蒸汽热：一种例如在冷冻干燥后，优选在60℃或80℃加热干燥材料，然后重新引入水分的方法。
紫外线照射：一种向材料施用紫外线(UV)的方法，优选在100-280nm(UVC)或315-400nm(UVA)波长下进行。
γ射线照射：一种采用γ射线照射来处理液体、冷冻或冻干材料，从而使病毒灭活或杀菌的方法。γ射线是由原子核的放射性衰变产生的穿透性电磁辐射，其波长通常比X射线短。
X-射线：X射线照射(X射线、X-照射、伦琴照射)是另一种电磁辐射形式，其波长大多在0.01至10纳米之间，对应于30皮赫兹至30埃赫兹(3×1016Hz至3×1019Hz)和100eV至100keV的能量。
电子束照射：一种用真空管中负极(阴极)发射的电子流(阴极射线)处理材料的方法。
纳滤：一种基于膜过滤的方法，该方法使用纳米尺寸的通孔，该通孔穿过通常具有50nm或更小有效孔径，优选1-10纳米孔径的膜，以从流体(液体或气体)中分离出固体。
S/D处理：溶剂/洗涤剂(S/D)处理是指一种在溶液中处理材料的方法，通常使用有机溶剂(例如磷酸三丁酯)和洗涤剂(例如吐温80或Triton X-100)。
所述血小板裂解物可以是液体，其中使所述液体血小板裂解物经历所述处理。或者，血小板裂解物可在处理前先干燥，从而提供干燥的血小板裂解物材料，其中干燥的血小板裂解物材料随后经历所述处理。
在本发明的一个有利实施例中，通过冷冻干燥血小板裂解物。处理之前的这种有利步骤包括冻干血小板裂解物，从而形成干燥的粉末状血小板裂解物材料。令人惊讶地是，冻干步骤对所得底物的性质没有任何影响，并且通过在质量控制条件下延长保质期而提供了更稳定的补充剂。也就是说，冻干血小板裂解物材料很稳定，并且可以长期储存。此外，冻干材料容易运输，因此底物的全部组成都可以运送到使用地点。使用者不需要在使用地点完成生产血小板裂解物底物的整个过程。相反，血小板裂解物材料是在生产设施的标准化和受控条件下生产，然后将无病毒的干燥血小板裂解物材料作为即用型材料交付给用户，用户很容易对其进行重构。
本实施例的优点基于冷冻干燥(冻干)和病毒灭活血小板裂解物的组合。冷冻干燥的裂解物可以在环境温度条件下储存，而不是将可溶形式在冷冻条件(-20摄氏度或以下)下储存，其中与液态相比，冻干提高了材料的稳定性。本发明方法的优点在于，与水合形式相比，冻干的人血小板裂解物可以以较低剂量方式进行病毒灭活。例如，根据本发明，辐照可用于病毒灭活。辐照剂量较低，因此人血小板裂解物中被辐照破坏的必需生长因子和其他蛋白质的数量降低。人类血小板裂解物的性能，例如，就细胞生长而言，仍然会受到影响，但与处理水合形式所需的高剂量辐照相比，其受影响程度显著降低。因此，提供了一种比常规病毒灭活产品更安全、更高性能的人血小板裂解物产品。一般来说，冷冻干燥增加了保存生长因子、细胞因子、趋化因子和其他内容物的好处，同时在储存、运输和物流方面也表现出更多的优势，而辐照增加了有效灭活病毒颗粒和/或病毒成分(如病毒RNA和DNA)的优势，对血小板裂解物成分的损害更小。
总的来说，本发明提供了一种制备用于培养和扩增适于治疗用途的活细胞的底物的方法以及用于临床和治疗用途的无病毒或病毒减少的人血小板裂解物(hPL)。本发明的方法提供了用于治疗应用的安全产品，而对细胞培养属性没有任何影响，并且便利了储存和运输，同时保存期限更长和稳定性更高，而对性能没有任何影响。
为了方便起见，干燥的血小板裂解物材料可以进行研磨，优选在处理之前进行，以便获得粉末。
在本发明的另一个有利实施例中，将液体添加到干燥的血小板裂解物材料中，从而获得重构的血小板裂解物材料。可通过添加水、盐水或液体培养基使无病毒干燥血小板裂解物材料重新水化。例如，可以将至少一种培养基组分添加至重新水化的血小板裂解物材料中，以使所得底物适应待扩增细胞的特定需要。培养基组分可以包括例如用于细胞培养的标准化培养基组合物，优选达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，特别是DMEM低葡萄糖培养基(DMEM-LG)。因此，可以提供不含病毒或至少病毒减少的底物，其包含细胞培养必需的生长因子和所需要的所有营养素，而没有不希望的血清成分。
在本发明的另一个有利实施例中，血小板从血小板浓缩物中得到并随后通过冻融过程(freeze-thaw process)裂解。例如，可以将采集的血小板单位在-80℃下冷冻两次，并分别在37℃下重新解冻融化。
该目的还通过提供一种包含血小板裂解物的血小板裂解物材料来实现，所述材料是基本上不含病毒颗粒和/或病毒成分的液体或干燥材料。可以将无病毒或至少病毒减少的液体材料制备成可直接在使用地点使用的即用型材料。该无病毒或至少病毒减少的干燥材料稳定且可以长期储存。此外，干燥材料容易运输，全部底物都可以运送到使用地点。使用者不需要在使用地点完成生产血小板裂解物底物的整个过程。相反，无病毒或至少病毒减少的干燥血小板裂解物材料是在生产设施中在标准化和受控条件下生产，然后将其作为即用型材料交付给用户，用户很容易对其进行重构。
例如，血小板裂解物材料可包含1-50％血小板裂解物，优选1-40％血小板裂解物，更优选1-30％血小板裂解物，更优选1-20％血小板裂解物，更优选5-15％血小板裂解物，尤其是约10％血小板裂解物。
在本发明的一个有利实施例中，血小板来自人类血液。使用人血小板裂解物尤其有益于培养人细胞(例如，人间充质干细胞)，而不存在异种免疫反应或(非人类)病原体传播的风险。
在本发明的优选实施例中，血小板裂解物材料是粉末。
本发明的另一方面是本发明所述血小板裂解物材料，特别是本发明所述方法制备的血小板裂解物材料用于制备临床和/或治疗应用的扩增活细胞用无病毒或至少病毒减少的底物的用途。特别是，本发明涉及用于治疗应用的更安全类型的(人)血小板裂解物的开发以及适合治疗用途或用于扩增临床或治疗应用活细胞用细胞培养基的无病毒或至少病毒减少的底物的制备方法。
所制备的无病毒或至少病毒减少的底物可以是液体底物或三维凝胶状底物。本发明的液体或凝胶状底物可有利地用作细胞治疗的药物组合物。特别是，本发明所述在液体中培养或包埋在凝胶中的细胞，优选干细胞，尤其是间充质基质细胞(MSC)，可移植到活体动物或人体中用于细胞替换、组织修复等。或者，可以将本发明所述的底物移植和/或注射到动物或人体中，以便为周围组织或血液的细胞提供合适的底物。本发明所述材料可以用于治疗例如关节炎、坏死或与受损组织有关的其他疾病。
培养或扩增的活细胞可以是例如间充质干细胞。例如，培养或扩增的细胞是干细胞或祖细胞，特别优选是间充质干细胞，特别是间充质基质细胞。在本发明的另一个示例性实施例中，所述细胞是中胚层细胞，优选成纤维细胞或间充质基质细胞。但是，显然，也可以培养其他类型的细胞，例如，源自外胚层或内胚层谱系的细胞，或甚至原代细胞。
本文所述术语“冻干”是指包括在不经过液态的情况下将水从冷冻状态转化为气态的“冻干”过程。冻干过程在含水材料保持冷冻的同时除去其中的水分。冻干的基本过程包括以下步骤：冷冻、一次干燥(升华)和二次干燥(解吸)。首先，将溶解和/或悬浮物质在低温(例如，-60℃)下冷冻。缓慢冷冻会产生较大的晶体，使升华物质得以逸出。有些产品形成玻璃状材料，在冷冻过程中可能需要退火。退火，首先降低温度，然后升高温度，然后再降低温度，将成分锁定在原位，然后使晶体生长。冷冻时间从1小时到24小时不等，具体取决于应用场景。然后，在第2步(一次干燥)中，通过真空抽出水或稀释剂，形成多孔的干燥“饼”。升华在真空下进行，产品温度低于其临界温度。这通常是最长的过程。在一次干燥周期结束时，产品的水分含量为3-5％。最后的干燥步骤(二次干燥)将去除残留的未冷冻水分子。这是通过加热产品来完成的。二次干燥后产品的水分含量是大约0.5％。
本文所述术语“辐照”是指通过将适于使病毒颗粒或病毒组分失活的任何类型的辐射(射线)施加到所述材料上对材料进行处理。辐照可以包括例如γ射线、热射线、UV射线、X射线和电子射线。
例如，可以使用本发明的方法灭活以下病毒：
BEV(牛肠病毒)：一种用作甲型肝炎病毒模型的无包膜单链RNA病毒。
BVDV(牛病毒性腹泻病毒)：一种用作丙型肝炎病毒模型的包膜单链RNA病毒。
CMV(巨细胞病毒)：一种包膜双链DNA病毒，通常与细胞相关。
柯萨奇病毒：一种无包膜单链RNA病毒。
CPV(犬细小病毒)：一种无包膜单链DNA病毒。
EBV(爱泼斯坦-巴尔病毒)：一种包膜双链DNA病毒，通常与细胞相关。
EMCV(脑心肌炎病毒)：一种无包膜单链RNA病毒。
HAV(甲型肝炎病毒)：一种无包膜单链RNA病毒。
HBV(乙型肝炎病毒)：一种包膜双链DNA病毒。
HCV(丙型肝炎病毒)：一种包膜单链RNA病毒。
HDV(丁型肝炎病毒)：一种需要同时感染乙型肝炎病毒的缺陷病毒。
HIV(人类免疫缺陷病毒)：一种包膜单链RNA病毒。
HSV(单纯疱疹病毒)：一种包膜双链DNA病毒，通常与细胞相关。
HTLV 1和2(人类T细胞嗜淋巴病毒，1型和2型)：一种包膜单链RNA病毒，通常与细胞相关。
脊髓灰质炎病毒：一种无包膜单链RNA病毒。
PPRV(猪伪狂犬病病毒)：一种包膜双链DNA病毒。
PPV(猪细小病毒)：一种无包膜单链DNA病毒。
PRV(伪狂犬病病毒)：一种包膜双链DNA病毒。
辛德毕斯病毒：一种包膜单链RNA病毒。
SLFV(塞姆利基森林病毒)：一种包膜单链RNA病毒。
牛痘病毒：一种包膜双链DNA病毒。
水泡性口炎病毒：一种包膜单链RNA病毒。
西尼罗病毒：一种包膜单链RNA病毒。
然而，任何其它病毒也可通过本发明的方法灭活。
将参照实例进一步对本发明进行详细说明。
本发明的示例性和优选实施例的说明
间充质基质细胞(MSC)是一种具有重要生物学意义的细胞群，其能够支持造血功能，能够在体外沿间充质和非间充质细胞系分化，能够抑制同种异体反应，并且似乎具有非免疫原性。这些特性表明了间充质基质细胞在细胞治疗中的新作用。
经书面同意后，使用亚琛大学伦理委员会批准的指南从髋关节骨折后的股骨头分离出MSC。用PBS冲洗骨骼碎片，然后在Biocoll(德国柏林Biochrom AG)上通过密度梯度法分离出单核细胞(MNC)。将细胞在纤连蛋白包被的细胞培养皿(奥地利Kremmünster的Greiner)中用达尔伯克改良伊格尔低葡萄糖培养基(DMEM-LG；奥地利帕兴PAA公司)和2mML-谷氨酰胺(美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich公司)和100U/mL青霉素/链霉素(pen/strep；瑞士巴塞尔Lonza公司)培养。如所描述的，在培养基中添加FCS(德国波恩HyClone公司)或HPL。培养基每周更换两次。当融合细胞达到80％时，用胰蛋白酶消化细胞，在Neubauer计数室(德国沃特海姆Brand公司)中进行计数，然后以104个细胞/cm2重新接种。从第一代开始计算累积种群倍增。
从健康献血者的血小板单位产生人血小板裂解物(HPL)，如Horn等人所述(2010)。特别是，HPL是使用Trima Accel采集系统(德国加尔兴CaridianBCT公司)单采产生的。这种血小板浓缩物在补充有柠檬酸-葡萄糖(ACD)(1:11v/v)的200mL血浆中的血小板含量为2.0至4.2×1011血小板。将血小板单位等分，在-80℃下冷冻两次，在37℃下重新解冻，并在4℃下以2600g离心30分钟以去除细胞碎片并以等量汇集。上清液通过0.22μm GD/X PVDF过滤装置(德国达塞尔Whatman公司)过滤，任选补充2U/mL肝素以避免凝胶化，并在-80℃下储存。
将细胞在细胞培养皿(奥地利Kremmünster的Greiner公司)中用达尔伯克改良伊格尔低葡萄糖培养基(DMEM-LG；PAA公司)和2mM L-谷氨酰胺(美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich公司)和100U/mL青霉素/链霉素(pen/strep；瑞士巴塞尔Lonza公司)培养。如说明书中所描述的，在培养基/底物中上添加HPL。将细胞在含有5％二氧化碳的潮湿环境中于37℃培养，每周更换培养基两次。
通过噻唑蓝溴化四唑(MTT)法评估细胞增殖。如说明书所描述的，将MSC接种在96孔板(3000个细胞/孔)上，培养基/底物中添加0、1、5、10或20％的HPL。培养7天后，用PBS(PAA公司)洗涤细胞，并用1mM MTT(Sigma-Aldrich公司)PBS溶液培养3.5h。舍弃多余的溶液，并用4mM HCl异丙醇溶液(均购自德国卡尔斯鲁厄Roth)溶解晶体。使用Tecan Infinite2000酶标仪(瑞士
Figure BDA0003003221930000061
的Tecan Trading公司)在波长590nm处测量光密度(OD)。
示例
人血小板裂解物的产生：
血小板单位由亚琛大学医学院输血医学研究所在有效期后(采集5天后)友情提供。血小板单位通过使用Trima Accel采集系统(德国加尔兴CaridianBCT公司)单采产生，在补充了柠檬酸-葡萄糖(ACD)(1:11v/v)的200mL血浆中包含2.0–4.2×1011个血小板。将45mL的等分样品在-80℃下冷冻两次，并在37℃下重新解冻，然后在2600×g下离心30分钟。上清液通过0.2μm GD/X PVDF过滤器(德国达塞尔Whatman公司)过滤，并在-80℃下储存直至使用。这项研究的实验采用三个HPL池进行，每个池由四个献血者的裂解物组成，但使用单个献血者来源的HPL也观察到类似的结果。HPL主要由A型血型组成，但系统分析并未显示血型的任何影响。
培养基和HPL凝胶：
培养基由达尔伯克改良伊格尔低葡萄糖培养基(DMEM-LG；奥地利帕兴PAA公司)和2mM L-谷氨酰胺(美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich公司)以及100U/mL青霉素/链霉素(pen/strep；瑞士巴塞尔Lonza公司)和HPL(10％，如果未另外说明的话)组成。细胞在组织培养塑料(TCP；奥地利Kremmünster的Greiner公司)上培养。对于凝胶制备，将不含肝素的含HPL的细胞培养基加入到细胞培养板中。由于培养基中含钙，引发了凝血级联反应，HPL-培养基在37℃下在1小时内凝胶化。即，纯的或稀释的血小板裂解物在约37℃下自发凝胶化，而无需添加任何凝血诱导剂，例如凝血酶和/或葡萄糖酸钙。所得的HPL-凝胶用作细胞培养底物，并用相同数量的MNC接种。为了进行比较，如前所述，使用由80％胶原蛋白G(在12mM HCl中的3mg/mL I/III型胶原蛋白；德国柏林Biochrome公司)组成的凝胶。在6孔板或T75组织培养瓶(德国朗根塞尔博德市Nunc Thermo Fisher Scientific公司)中于37℃培养细胞。
从骨髓中分离人间充质基质细胞：
通过塑料粘附从单核细胞(MNC)中分离出MSC。简而言之，将股骨头假体置换患者的股骨头碎片用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗。随后，通过Ficoll密度梯度离心法(Biocoll分离液，密度1.077g/l，德国柏林Biochrom AG公司)分离MNC，并用PBS洗涤两次。然后，将至少5×105个MNC重悬浮在6孔板中TCP、HPL凝胶或胶原-凝胶上的培养基中。将细胞在37℃，5％CO2的湿空气中培养。48小时后进行第一次培养基更换，以除去非贴壁细胞。此后，每周进行两次半-培养基更换，并按如下所述进一步传代MSC。
冷冻干燥：
冷冻是通过将凝胶置于冻干烧瓶中，并在通过机械制冷、干冰和和甲醇，或液氮冷却的壳式冷冻柜中旋转烧瓶来实现。在更大的规模上，冷冻可以使用冷冻干燥机完成。在这一步中，重要的是将材料冷却到其三相点以下，即材料的固相和液相可以共存的最低温度。这确保了在以下步骤中将发生升华而不是熔化。晶体越大，越容易冻干。为了得到更大的晶体，应将产品缓慢冷冻或在温度上下循环(退火)。冷冻温度在-50℃至-80℃之间。
在一次干燥阶段，降低压力(至几毫巴的范围)，向冷冻凝胶提供足够的热量使冰升华。在此一次干燥阶段，材料中大约95％的水被升华。此阶段可能很慢，因为如果加入过多热量，则材料的结构可能发生改变。在此阶段，通过施加部分真空来控制压力。真空加速了升华，使其可用作精细的干燥过程。此外，冷的冷凝器室和/或冷凝器板为水蒸气提供了在其上重新凝固的表面。冷凝器温度通常低于-50℃(-60°F)。
二次干燥阶段旨在除去未冻结的水分子，因为冰已经在一次干燥阶段去除。在这个阶段，将温度升高到比一次干燥阶段更高，甚至可以超过0℃，以打破水分子和冷冻材料之间形成的任何物理-化学相互作用。在这一阶段，也可以降低压力以促进解吸(例如，在微巴或几分之一帕斯卡的范围内)。
冷冻干燥过程完成后，在密封材料之前，用惰性气体(如氮气)破坏真空。操作结束时，产品的最终残留水含量极低，大约为1％至4％。
非专利文献
Horn,P.；Bokermann,G.；Cholewa,D.；Bork,S.；Walenda,T.；Koch,C.；Drescher,W.；Hutschenreuther,G.；Zenke,M.；Ho,A.；Wagner,W.:Comparison of IndividualPlatelet Lysates for Isolation of Human Mesenchymal Stromal Cells.Cytotherapy12:888-898；2010.

Claims (15)

1.一种用于制备活细胞培养底物的材料的制备方法，所述方法包括：
-提供血小板裂解物，以及
-使所述血小板裂解物经历至少两种不同的处理，每种处理能够使病毒颗粒和/或病毒组分失活，从而提供无病毒或至少病毒减少的血小板裂解物材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述处理包括从由巴氏杀菌、干热、蒸汽热、紫外线照射、γ射线照射、X射线照射、电子束照射、纳滤和溶剂/洗涤剂处理组成的组中选择的至少两种不同的处理。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述血小板裂解物是液体，所述液体血小板裂解物经历所述处理。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述血小板裂解物在处理前先干燥，从而提供干燥的血小板裂解物材料，所述干燥的血小板裂解物材料经历所述处理。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述血小板裂解物通过冻干干燥。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中对所述干燥的血小板裂解物材料进行研磨，以获得粉末。
7.根据权利要求4、5或6所述的方法，其中将液体添加到干燥的血小板裂解物材料中，从而获得重构的血小板裂解物材料。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述血小板从血小板浓缩物中得到并随后通过冻融过程裂解。
9.一种血小板裂解物材料，包含血小板裂解物，其中所述材料是基本上不含病毒颗粒和/或病毒成分的液体或干燥材料。
10.根据权利要求9所述的血小板裂解物材料，其包含1-50％血小板裂解物，优选1-40％血小板裂解物，更优选1-30％血小板裂解物，更优选1-20％血小板裂解物，更优选5-15％血小板裂解物，尤其是约10％血小板裂解物。
11.根据权利要求9或10所述的血小板裂解物材料，其中所述血小板来自人类血液。
12.根据权利要求9、10或11所述的血小板裂解物材料，其中所述材料是粉末。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的血小板裂解物材料，特别是根据权利要求1至8中任一项所述方法制备的血小板裂解物材料，在制备用于扩增临床和/或治疗应用的活细胞的无病毒或至少病毒减少的底物中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述底物是液体底物或三维凝胶状底物。
15.根据权利要求13或14所述的用途，其中所述细胞是间充质干细胞。
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