UA119699C2 - Спосіб виготовлення імплантаційного дегідратованого кісткового біоматеріалу алогенного походження - Google Patents

Abstract

Винахід стосується способу виготовлення імплантаційного дегідратованого кісткового біоматеріалу алогенного походження, який включає очищення кістки природного походження, її здрібнювання, обробку кісткових фрагментів перекисом водню та етанолом, а також сумішшю солей, упаковку та стерилізацію, де обробку кісткових фрагментів здійснюють 10 % розчином перекису водню впродовж доби об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1 зі зміною розчину 1-2 рази; з подальшою обробкою кісткових фрагментів сумішшю 96 % етанолу із діетиловим ефіром в пропорції 1:1 впродовж 8 годин, витримують кісткові фрагменти при температурі мінус 25 °С впродовж 20 годин у розчині 0,45 М NaCl, з об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1, потім витримують при температурі 25 °С впродовж 8 годин у розчині 0,1 М Na2HPO4, з об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1 з проміжним між стадіями розморожуванням, промиванням водою та висушуванням при кімнатній температурі, після чого кістковий матеріал висушують за допомогою конвекційного сушіння, пакують та піддають радіаційній стерилізації в дозі від 15 до 25 кГр.

Description

допомогою конвекційного сушіння, пакують та піддають радіаційній стерилізації в дозі від 15 до кГр.

Винахід належить до медицини, а саме до травматології та ортопедії, та призначений для отримання остеопластичного матеріалу шляхом обробки кортикально-губчатої кісткової тканини. Винахід може бути використаний як самостійно, так і як носій біологічно активних речовин, лікарських засобів та клітин для оптимізації репаративного остеогенезу за умов хірургічного лікування пацієнтів із травматичними дефектами та пухлинними ураженнями кісток, переломами, що не зрослись або консолідуються уповільнено, хибними суглобами та в інших областях відновної хірургії в якості остеопластичного матеріалу для заміщення кісткової тканини, а також в якості наповнювача при втраті об'єму кісткової тканини та біологічного опорного каркасу.

Поряд із використанням провідних методів хірургічної техніки щодо остеопластики успішний результат заміщення та відновлення значно мірою залежить від фізико-хімічних, остеокондуктивних та остеоіндуктивних властивостей імплантаційного кісткового біоматеріалу після його попередньої обробки. Ці властивості істотно різняться залежно від застосованих способів обробки на кожному з трьох основних етапів виготовлення мінералізованого кісткового матеріалу: 1) хімічна депротеїнізація та знежирення для зменшення імуногенності (руйнування та видалення основних антигенних сполук глікопротеїнів і гліколіпідів); 2) стерилізація для знезараження (забезпечення антисептики); 3) консервація для зберігання.

Відомий спосіб отримання остеопластичного матеріалу, який включає механічне очищення кістки від м'яких тканин і розпилювання губчастої кісткової тканини, обробку 1-10 95 розчином натрію хлориду 1-8 діб, розміщення матеріалу в ультразвукову ванну з 1-10 95 розчином перекису водню на 1-8 діб, глибоке очищення і знежирення методом надкритичної флюїдної екстракції при температурі 20-70"С і тиску 1000-10000 рзі протягом 30-500 хвилин, демінералізацію розчином соляної кислоти 0,5-4 М протягом 15-300 хвилин і ліофілізацію протягом 1-48 годин (Пат. 2609201 КИ МПК АбЄТІ 27/36, АбІЕ 2/28, ВО1О 15/40. Способ получения остеопластического материала / Евдокимов СВ. и др. (ВШ). - Мо 2015134550; заявл. 14.08.2015; опубл. 30.01.2017, Бюл. Мео4), Даний спосіб забезпечує проведення глибокого і безпечного очищення кісткового матриксу, збереження структури кісткового матриксу, зниження антигенності, підвищення біосумісності і остекондуктівності. Недоліком даного способу є довготривала обробка перекисом водню, що може призводити до руйнування кісткових

Зо морфогенетичних білкових факторів в отримуваному матеріалі. В результаті отримуваний матеріал буде позбавлений остеоіндуктивних властивостей.

Відомий спосіб виготовлення кісткового біосумісного матеріалу, який включає розпилювання губчастої кістки на фрагменти необхідних розмірів, обробку 6 95 розчином перекису водню впродовж 48 годин (4 рази через кожні 12 годин), центрифугування, обробку сумішшю етанолу та хлороформу (1:11) впродовж 48 годин (4 рази через кожні 12 годин), центрифугування, висушування на повітрі впродовж 24 годин, заморожування при температурі -70 "С впродовж 24 годин, ліофілізацію впродовж 48 годин, пакування у стандартний подвійний пакет та стерилізацію потоком прискорених електронів дозою 18:ж25кГр (Пат. 2172104 КО МПК АО1ТМ 1/00.

Способ изготовления имплантатов из губчатой костной ткани / Лекишвили М. В. и др. (КО). -

Мо2000115228/14; заявл. 15.06.2000; опубл. 20.08.2001, Бюл. Мо23|. Даний спосіб забезпечує низьку антигенність та повну стерильність кінцевого продукту. Недоліком даного способу є використання хлороформу. Це збільшує ризик токсичності кінцевого медичного виробу та небезпеку його використання.

Відомий спосіб виготовлення губчастих кісткових трансплантатів, під час якого проводять заготовку тканин в нестерильних умовах та їх механічну обробку. Перед стерилізацією матеріал експонують в 6 95 розчині перекису водню протягом 60 хвилин з подальшим поліпозиційним відмиванням спонгіозної кістки від мієлоїдно-жирового кісткового мозку і елементів крові проточною водою під різним кутом атаки гідродинамічного струменя під тиском 8 Мпа з відстані 10 см протягом 1 хвилини. Стерилізацію проводять в суміші перекису водню та мурашиної кислоти (Пат. 2440730 СІ КО МПК АОЇТМ 11/00. Способ изготовления губчатьїх костньх трансплантатов / Демичев Н.П. и др. (КО) Ме2010125583/13; заявл. 22.06.2010; опубл. 27.01.2012, Бюл. Ме3)| Винахід дозволяє підвищити технологічність, поліпшити якість пластичного матеріалу та його остеоіндуктивні властивості, скоротити час підготовки алотрансплантата до клінічного використання. Недоліком даного способу є можлива висока антигенність за рахунок недостатнього видалення жирового компоненту шляхом фізичного впливу води під тиском. Також недоліком є зберігання пластичного матеріалу у скляних флаконах за температури -18"С, що спричиняє відповідні технічні труднощі У разі транспортування губчастих кісткових трансплантатів.

Відомий спосіб виготовлення крупноблочних ліофілізованих кісткових імплантатів, який 60 полягає в тому, що у попередньо механічно оброблених, відмитих проточною водою великих кісткових блоках, що складаються з компактного і губчастого компонентів кісткової тканини, роблять хаотично розташовані наскрізні отвори діаметром 1-3 мм. Після виливу на крупноблочні кісткові імплантати ліпосистемами та перекисом водню, низькочастотними ультразвуковими коливаннями частотою 35-10 95 кГц протягом 1-3 хвилин. Поміщають крупноблочні кісткові імплантати в камеру, в якій створюють вакуум із залишковим тиском 1-2

Па на 15 хвилин. Після відмивання крупноблочних кісткових імплантатів проточною водою і спирто-ефірним розчином 0,5-1,5 години, заморожують при температурі -60 "С, ліофілізують, герметично упаковують і стерилізують радіаційним методом (Пат. 2366173 СІ КО МПК АОТМ 1/00. Способ изготовления крупноблочньїх лиифилизированньїх костньіїх имплантатов / Волова

Л.Т. (КО) - Мо 2008119004/14; заявл. 15.05.2008; опубл. 10.09.2009, Бюл. Мое25). Спосіб забезпечує підвищення ефективності та якості очищення крупноблочних кісткових і сухожильно- кісткових імплантатів від жиру і кісткового мозку. Недоліками даного способу є низька ефективність способу за рахунок тривалості проведення процесу виготовлення кісткових біоїмплантатів, великих матеріальних і трудовитрат при виготовленні кісткових біоімплантатів, пов'язаних з використанням для ліофілізації кісткових біоїмплантатів дорогого устаткування.

Відомий спосіб виготовлення кісткового алотрансплантата, який передбачає проведення механічної обробки та промивання заготовки з кісткового матеріалу, виконання в ній наскрізних отворів, демінералізацію в розчині соляної кислоти, консервацію демінералізованної заготовки за допомогою ліофільного сушіння, стерилізацію після завершення сушіння, яку здійснюють шляхом опромінення заготовки, поміщеної в герметичну упаковку, пучком прискорених електронів дозою 15-18 кГр протягом 16-20 с (Пат. 2147800 СІ КО МПК АОТМ 1/00. Способ изготовления костного аллотрансплантата / Лекишвили М. В. и др. (КО). - Ме99102801/14:; заявл. 17.02.1999; опубл. 27.04.2000, Бюл. Ме12|Ї. Даний спосіб забезпечує підвищення якості алотрансплантата. Недоліками цього способу є те, що використання дегідратації кісткової тканини методом сублімації (висушування із замороженого стану в умовах вакууму) робить недемінералізовану кісткову тканину крихкою, за рахунок пошкодження мікроструктури, головним чином, колагену. Також процес демінералізації кісткової тканини розчинами соляної кислоти різко знижує її механічні властивості.

Відомий спосіб отримання кісткового алоїмплантата з високими механічними

Зо властивостями. Суть методу: після механічного очищення кортикальну кістку розпилюють на пластини потрібного розміру, обробляють З 95 розчином перекису водню в ультразвуковій ванні при температурі 30 "С з дворазовою зміною розчину протягом 10-20 годин, обробляють 6 М розчином сечовини в протягом 18 годин, знежирюють і одночасно дегідратують в суміші етанолу та хлороформу (1:11) протягом 8 годин, потім двічі промивають в 96 95 етанолі з розрахунку на 1г тканини 10-15 мл етанолу, досушують в спеціальному контейнері під тиском 60-80 Торр протягом 2 годин, упаковують в подвійний пластиковий пакет і стерилізують потоком швидких електронів дозою 18-25 кГр (Пат. 2343934 СІ КО МПК АЄТІ. 27/00. Способ получения костного аллоимплантата с вьісокими механическими свойствами / Лекишвили М.В. и др. (КИ).

Мо2007131224/15; заявл. 16.08.2007; опубл. 20.01.2009, Бюл. Ме2). Спосіб забезпечує отримання кісткових алоїмплантатів з високими механічними властивостями, близькими до нативної кісткової тканини, які можуть бути використані для заміщення великих кісткових дефектів, і бути основою для інших виробів медичного призначення. Недоліками даного способу є обробка біоматеріалу хлороформом, що збільшує ризик токсичності кінцевого медичного виробу та небезпеку його використання.

Відомий спосіб отримання та консервації мінералізованого кісткового матриксу, який полягає у механічній обробці губчастої кістки від хрящової тканини, перфорацію кістки спицею, з подальшою обробкою кістки 0,8 95 розчином натрію хлориду і 0,1 95 Твін-100 протягом 6 ч, 6 95 розчином перекису водню впродовж 24 годин, замінюючи його через 6 ч, центрифугуванням при 3000 об/хв..., після чого на 12 годин зануренням в суміш етанолу і хлороформу (1:1), змінюючи

З рази через кожні 4 год., потім протягом 6 ч обробляють спирт-ефірну суміш (1: 2), провітрюють губчасту кістку в струмі повітря протягом 12 год., заморожують при -70С і ліофільно висушують. Висушену губчасту кістку поміщають в герметичний пластиковий контейнер і стерилізують потоком швидких електронів дозою 185 кГр на лінійному прискорювачі електронів

УОЗ МВ. |Пат. 2495567 СІ КО МПК АОїТМ 11/00. Способ получения и консервации минерализованного костного матрикса / Лунева С.Н. и др. (КО). Мо2012112186/15; заявл. 29.03.2012; опубл. 20.10.2013, Бюл. Мо29).

Вищеописаний спосіб дозволяє отримати препарат, який може зберігатися протягом З років, зберігаючи стерильність і біологічні властивості. Недоліками даного способу є використання хлороформу при обробці біоматеріалу, це збільшує ризик токсичності кінцевого медичного 60 виробу та небезпеку його використання.

Відомий спосіб виготовлення біоматеріалу з кісткової тканини, який включає очищення кістки природного походження, її здрібнювання до необхідних розмірів, обробку кісткових фрагментів перекисом водню, очищеною гарячою водою, з осмотичною обробкою кісткових фрагментів сумішшю із вмістом хлору, наприклад хлоридом калію чи хлоридом літію із наступним витримуванням кісткових фрагментів при наднизьких температурах до мінус 180 "С, додатково великі кісткові фрагменти очищають за допомогою ультразвуку із сумішшю з вмістом хлору, далі кісткові фрагменти витримують в розчині із вмістом фосфатовмісних або сольових розчинів, наприклад, гідрофосфату натрію, після чого кістковий матеріал промивають в розчині соляної кислоти, з послідуючим промиванням дезактиваторами соляної кислоти (Пат. 1 18016

ОА МПК АбІК 35/32, АбІЕ 2/28, Аб1ТІ 27/00, АО1ТМ 1/00, АбІР 19/00. Спосіб виготовлення біоматеріалу з кісткової тканини / Сербін М.Є. та ін. (ША). -Мо а 2016 05029; заявл. 06.05.2016; опубл. 25.07.2017, Віол. Мое14)|. Спосіб забезпечує одержання збереженого за архітектонікою кісткового біоматеріалу та чистого кісткового колагену з низькоантигенними властивостями.

Недоліками даного способу є використання хлороформу, що збільшує ризик токсичності кінцевого продукту та небезпеку його використання.

Найбільш близький до винаходу, що заявляється, є спосіб виготовлення біоматеріалу з кістки природного походження, який передбачає механічне очищення та здрібнювання кістки до фрагментів необхідного розміру, щонайменше дворазова обробка 10 95 розчином перекису водню Н2О»2 впродовж 24 годин, промивання проточною водою впродовж 45 хвилин, висушування на повітрі, обробка сумішшю етанолу та діетилового ефіру (11) впродовж 8 годин, промивання проточною водою впродовж 45 хвилин, висушування на повітрі, обробка 0,45 М розчином натрію хлориду Масі при температурі -25 "С впродовж 20 годин, розморожування та промивання дистильованою водою, обробка 0,1 М розчином натрію фосфорнокислого двозамісного Ма»НРОї при температурі -25"С впродовж 8 годин, розморожування та промивання дистильованою водою, насичення розчином цефтриаксону (у 0,995 Масі з додаванням диметилсульфоксиду) та аскорбіновою кислотою, пакування у стерильні пакети, зберігання при температурі -25 "С (Пат. 108813 ОА МПК АбІК 35/32, АЄТЕ 2/28, АбІ1Р 19/00,

АОТМ 1/00, АЄТІ. 27/00. Спосіб виготовлення біоматеріалу з кісткової тканини / Корж М.О. та ін. (ОА). - Ме а 2014 03313; заявл. 25.11.2014; опубл. 10.06.2015, Бюл. Мо 111.

Ко) Даний спосіб виготовлення біоматеріалу із кісткової тканини є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю і результатом, який може бути досягнутим, тому його обрано за прототип.

Прототип і винахід, що заявляється, мають такі спільні ознаки: підготовка первинного матеріалу, обробка первинного матеріалу 10 95 розчином перекису водню, обробка сумішшю етанолу та діетилового ефіру (111), обробка 0,45 М розчином натрію хлориду Масі при температурі -25 "С, обробка 0,1 М розчином натрію фосфорнокислого двозамісного МагНРО»Х4 при температурі -25 "С. Але, відомий спосіб має такі недоліки: зберігання препаратів потребує морозильної камери з температурою мінус 25"С та постійного контролю над процесом зберігання; виникають відповідні технічні труднощі при транспортуванні пластичного матеріалу.

Окрім того, обробка біоматеріалу хлороформом - збільшує ризик токсичності кінцевого медичного виробу та небезпеку його використання.

В основу винаходу поставлено задачу підвищити якість клінічних та експлуатаційних властивостей імплантаційного дегідратованого кісткового біоматеріалу алогенного походження шляхом зниження антигенних властивостей кісткової тканини при високому терміні зберігання та спрощеній технології підготовки імплантату до клінічного використання.

Задачу, яку поставлено в основу "винаходу, вирішують тим, що у відомому способі виготовлення імплантаційного дегідратованого кісткового біоматеріалу, який включає очищення кістки природного походження, її здрібнювання, обробку кісткових фрагментів перекисом водню, сумішшю етанолу з ефіром, а також сумішшю солей, упаковку та стерилізацію, згідно з винаходом, обробку кісткових фрагментів здійснюють 10 95 перекисом водню в перебігу доби, об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1 зі зміною розчину 1-2 рази; обробку кісткових фрагментів виконують сумішшю 96 95 етанолу із діетиловим ефіром в пропорції 1:11 в перебігу 8 годин, витримуванні кісткових фрагментів при температурі мінус 25 "С у перебігу 20 годин у розчині 0,45 М Масі, з об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1, з послідуючим витримуванням при температурі мінус 25 "С в перебігу 8 годин у розчині 0,1 М МагНРО», з об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1, після чого кістковий матеріал висушують за допомогою конвекційного сушіння, пакують та піддають радіаційній стерилізації в дозі від 15 до 25 кГр.

Технічний ефект винаходу досягають за рахунок синергізму сукупності етапів способу, порядку їх виконання та умов, при яких кожен із етапів може бути виконаним. бо Спосіб виконують таким чином.

1. Видалення з поверхні кісткових фрагментів м'яких тканин, хряща, окістя, здрібнювання кістки. 2. Обробка кісткових фрагментів 10 95 перекисом водню НгО: впродовж доби. Об'єм розчину до об'єму тканини 5:1. Розчин замінюють 1-2 рази. Після закінчення часу експозиції, тканину промивають 1 годину під проточною водою та висушують марлею. Етап забезпечує видалення елементів крові та первинну стерилізацію кісткового матеріалу. 3. Обробка кісткових фрагментів сумішшю 96 95 етилового спирту із діетиловим ефіром у співвідношенні 1:1 впродовж 8 годин. Обробку виконують у герметично зачиненому ексикаторі, у витяжній шафі, за допомогою магнітної мішалки. Після закінчення часу експозиції тканину промивають 1 годину під проточною водою, висушують марлею та провітрюють кісткові фрагменти протягом 12 годин. Етап забезпечує видалення жирових компонентів - ліпідів, ліпопротеїдів і т.д. та вторинну стерилізацію. 4. Витримування кісткових фрагментів при температурі -25 "С впродовж 20 годин в розчині 0,45 М Масі. Об'єм розчину до об'єму тканини 5:1. Після закінчення часу експозиції розморожують та відмивають тканину у дистиляті. Етап забезпечує зниження антигенних властивостей за рахунок екстракції неколагенових білків. 5. Витримування кісткових фрагментів при температурі -25 "С впродовж 8 годин в розчині 01 М МагНРО». Об'єм розчину до об'єму тканини 5:1. Після закінчення часу експозиції розморожують та відмивають кістковий матеріал у дистиляті. Етап забезпечує зниження антигенних властивостей за рахунок екстракції неколагенових білків, що залишилися.

Після проведення кісткового матеріалу через етапи вищеописаної переробки на виході отримують біоорганічну фазу (мінеральна частина кістки плюс колаген), що далі є основою для отримання імплантаційного дегідратованого кісткового біоматеріалу.

Фрагменти кісткового матеріалу висушують за допомогою конвекційного сушіння впродовж 4-5 діб.

Кістковий біоматеріал пакують у подвійну упаковку, яка складається із зовнішнього комбінованого пакету та поліпропіленового флакону, маркують та піддають радіаційній стерилізації в дозі від 15 до 25 кГр.

Після стерилізації імплантаційного дегідратованого кісткового біоматеріалу проводиться

Зо мікробіологічне досліджування в бактеріологічній лабораторії. Чотири зразки з кожної партії передають на бактеріологічний посів. Стерильним вважається відсутність зростання колоній на поживних середовищах.

У випадку встановлення факту росту мікрофлори препарати даної партії вилучають і утилізують.

Одержаний із кісткової тканини біоматеріал алогенного походження зберігає нативну структуру кісткового колагену та просторову організацію кісткової тканини, що необхідно для її наступної клітинної колонізації, підвищення приживлення за рахунок зниження антигенних характеристик та підвищення тим самим біосумісності і біоінтеграції.

Винахід промислово придатний, освоєний в лабораторних умовах, результати випробувань доводять практичну цінність одержаного кісткового біоматеріалу алогенного походження.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Спосіб виготовлення імплантаційного дегідратованого кісткового біоматеріалу алогенного походження, який включає очищення кістки природного походження, її здрібнювання, обробку кісткових фрагментів перекисом водню та етанолом, а також сумішшю солей, упаковку та стерилізацію, який відрізняється тим, що обробку кісткових фрагментів здійснюють 10 95 розчином перекису водню впродовж доби об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1 зі зміною розчину 1-2 рази; з подальшою обробкою кісткових фрагментів сумішшю 96 95 етанолу із діетиловим ефіром в пропорції 1:11 впродовж 8 годин, витримують кісткові фрагменти при температурі мінус 25 "С впродовж 20 годин у розчині 0,45 М Масі, з об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1, потім витримують при температурі 25 "С впродовж 8 годин у розчині 01 М МагНРО», з об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1 з проміжним між стадіями розморожуванням, промиванням водою та висушуванням при кімнатній температурі, після чого кістковий матеріал висушують за допомогою конвекційного сушіння, пакують та піддають радіаційній стерилізації в дозі від 15 до 25 кГр.