CN112870346A - 一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制品制备工艺研发技术领域，公开了一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，包括病毒培养、灭活剂制备、灭活操作、浓缩及纯化、抗原乳化、疫苗配比等步骤，本发明结合佐剂、赋形剂与灭活抗原悬液的组合，实现高效诱导反刍动物，同时产生对蓝舌病病毒的免疫应答，有效去除非结构蛋白的干扰，实现了疫苗免疫和野生毒株感染的可区别鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品制备工艺研发技术领域，具体公开了一种能使反刍动物产生保护性免疫反应、可以区别疫苗免疫和野生毒株感染的蓝舌病病毒二价灭活疫苗。
背景技术
蓝舌病(BT)是由蓝舌病病毒(BTV)引起的一类由节肢昆虫作为媒介传播的非接触性病毒性传染病，主要分布在热带、亚热带和温带地区，主要感染绵羊等反刍动物，多数动物感染后呈隐性带毒，不表现临床症状，怀孕动物感染后可出现胎儿畸形、死胎和流产等症状。目前已发现蓝舌病病毒至少有27种血清型，其中我国主要流行毒株为1型和16型。
近10年来，由于全球气候变暖和海平面上升等各种因素，各种媒介昆虫的活动范围正在不断扩大，有向北方、较高海拔和寒冷地区扩散的趋势，给我国的疫病防控带来严峻的挑战。2006年欧洲8型蓝舌病病毒(BTV-8)第一次在欧洲大规模爆发流行，给法国、英国和比利时等国的牛羊养殖业造成了严重的经济损失，对畜牧业生产和人类健康构成严重威胁。据估计，全球每年由BT导致的经济损失高达30亿美元。
然而，我国蓝舌病疫苗的开发研究相对滞后，过去50多年，先后开展了BTV弱毒疫苗、灭活疫苗、重组疫苗的研究，但进展比较缓慢且不够深入，我国上世纪80年代研制成功的BTV1和BTV16型弱毒疫苗在湖北襄樊和重庆巫溪用于紧急预防，产生了很好的免疫保护效果。弱毒疫苗虽然具有良好的免疫和保护效果，但病毒的致弱机理尚不清楚，使用后存在毒力返强和与流行毒株发生基因重排的风险，疫苗应用受到极大限制。因此，灭活疫苗仍然是预防和控制蓝舌病疫情的最主要手段。
在我国，云南省畜牧兽医科学研究所于90年代应用羟胺成功对蓝舌病病毒进行灭活，但是灭活过程中对主要免疫原性抗原表位造成一定程度的损害，灭活抗原免疫效果差。国外有应用β-丙内酯对蓝舌病病毒进行灭活的报道，但国内重复该研究的效果不理想，达不到预期灭活效果，同时在蓝舌病病毒抗体普查时，无法应用非结构蛋白抗体检测方法区别野生病毒感染和疫苗免疫产生的抗体，生产工艺亟需改进。重组疫苗也有研究报道，但未见商品化产品推出。二乙烯亚胺(BEA)是一种重要的病毒灭活剂，在氢氧化钠作用下环化为BEI，BEI直接作用于病毒核酸，使病毒丧失复制能力，而保持病毒主要免疫原性，被广泛应用于口蹄疫等动物病毒的灭活。由于蓝舌病病毒具有其结构的特殊性，常规的BEI配方和灭活工艺不易于将其彻底灭活，或者灭活后免疫原性发生改变，造成免疫效果差，亟需改进蓝舌病灭活疫苗的制备工艺。
因此，如何提供一种能够有效去除非结构蛋白干扰，且可区别疫苗免疫和野生毒株感染的蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明在不显著增加生产成本的前提下，建立独特的蓝舌病病毒培养、灭活、浓缩和纯化、毒株配比工艺，改进佐剂、赋形剂与灭活抗原悬液的组合，得到蓝舌病病毒二价灭活疫苗生产工艺，解决了蓝舌病灭活疫苗免疫效果差、不可区别疫苗免疫和野生毒株感染的问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)病毒培养：BHK-21细胞分别接种单一血清型蓝舌病病毒种毒，以无血清MEM细胞培养液作为培养液进行培养，待60～80％细胞出现显著病变时缓慢倾弃病毒培养液，然后加入无血清MEM细胞培养液，刮下未脱落的细胞，收集悬液，超声波破碎后离心去除沉淀，上清液即为蓝舌病病毒悬液；
(2)制备灭活剂：在0.5～0.7％氢氧化钠溶液中加入二乙烯亚胺制备浓度为0.1mol/L的二乙烯亚胺溶液，于37℃静置1～2h，得到灭活剂，置于4℃条件下保存备用；
(3)灭活操作：向蓝舌病病毒悬液中加入灭活剂灭活，然后加入硫代硫酸钠混匀，灭活完毕，得到灭活的蓝舌病抗原悬液，置于4℃保存备用；
(4)浓缩及纯化：在灭活的蓝舌病抗原悬液中加入PEG6000和氯化钠，在4℃的条件下搅拌至充分溶解，然后进行离心操作，弃去上清液后，重悬沉淀，得到的重悬物即为浓缩及纯化后的病毒悬液；
(5)抗原乳化：将浓缩及纯化后的病毒悬液与白油-司本80混合液混匀，超声波乳化，得到乳化液；另外取浓缩及纯化后的病毒悬液，加入吐温80和硫柳汞充分混匀制成外层病毒悬液，加入到所述乳化液内，再次超声波乳化，乳化完毕得到蓝舌病单型灭活疫苗，置于4℃保存；
(6)疫苗配比：做为优选的1型蓝舌病病毒和16型蓝舌病病毒灭活抗原分别同条件按照步骤(5)乳化后获得各自血清型单型疫苗，1型蓝舌病单型灭活疫苗和16型蓝舌病单型灭活疫苗按照1:2～3(v/v)配比混匀，即成蓝舌病病毒二价灭活疫苗。
二乙烯亚胺(BEA)是一种重要的病毒灭活剂，在氢氧化钠作用下环化为BEI，BEI直接作用于病毒核酸，使病毒丧失复制能力而保持病毒主要免疫原性，被广泛应用于口蹄疫等动物病毒的灭活，由于蓝舌病病毒具有其结构的特殊性，本发明可以在保证蓝舌病病毒主要免疫原性抗原稳定性的基础上灭活病毒。
优选的，在上述一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法中，步骤(1)中所述蓝舌病病毒种毒包括蓝舌病病毒1型、2型、3型、4型、5型、7型、9型、10型、12型、15型、16型、21型、24型；所述蓝舌病病毒种毒的毒价为10-5.5～10-7/100微升，且接种量为所述BHK-21细胞的1～5％(v/v)。
本发明病毒培养、灭活、浓缩纯化方法可用于蓝舌病病毒1型、2型、3型、4型、5型、7型、9型、10型、12型、15型、16型、21型、24型共13个血清型毒株的灭活疫苗，由于中国国内目前仅发现存在这些血清型，其它血清型未进行试验，但由于蓝舌病病毒不同血清型间基本结构的类似性，因此不局限于仅能用于培养、灭活纯化这些毒株。
优选的，在上述一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法中，步骤(1)中所述培养温度为37℃，培养时间为3-4天，并且倾弃病毒培养液后所述无血清MEM细胞培养液的加入量为所述培养液体积的1/10。
优选的，在上述一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法中，所述超声波破碎时间为3-5min，所述离心时间为20min，转速为3000rpm。
优选的，在上述一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法中，步骤(3)中所述灭活剂的添加量为所述蓝舌病病毒悬液体积的6％(v/v)，且所述灭活剂的浓度为0.1mol/L；所述灭活在37℃的温箱中搅拌灭活30h，搅拌速率为100～200rpm/min。
优选的，在上述一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法中，步骤(3)中所述硫代硫酸钠的加入量为所述蓝舌病病毒悬液体积的0.6％(v/v)，且所述硫代硫酸钠的摩尔浓度为1mol/L。
优选的，在上述一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法中，步骤(3)中所述灭活过程为：加入灭活剂后置37℃温箱中搅拌灭活15小时，结束后更换容器，继续置37℃温箱中搅拌灭活10小时，再次更换容器，继续置37℃温箱中搅拌灭活5小时；合计灭活30小时后，加入硫代硫酸钠混匀，终止灭活反应。
本发明通过精准的确定灭活剂用量(6mmol/L)病毒悬液和灭活容器转移更换时间、频次，可以在保证蓝舌病病毒主要免疫原性抗原稳定性的基础上灭活病毒。
优选的，在上述一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法中，步骤(4)中所述PEG6000的添加量为所述灭活的蓝舌病抗原悬液重量的7％，所述氯化钠的添加量为所述灭活的蓝舌病抗原悬液重量的2.22％。
优选的，在上述一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法中，步骤(4)中所述重悬沉淀为：在沉淀中加入1/10(v/v)无血清MEM细胞培养液或pH为7.2-7.4的0.01M的三羟甲基氨基甲烷盐酸。
无血清MEM细胞培养液或0.01M的三羟甲基氨基甲烷盐酸的加入量以通过震荡液体吸吹的方式可完全溶解沉淀为准，可依据需要对悬液进行不同浓度的稀释。
聚乙二醇6000(PEG6000)，PEG的水溶性强，在液相介质中，其分子表面的醚键带有微弱的负电荷，可与带正电的病毒表面蛋白相连，促进病毒颗粒表面抗原的稳定性，离心可使与其相连的病毒颗粒沉淀，沉淀内加入液体后震荡后可在液体内重悬。
优选的，在上述一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法中，步骤(4)中所述离心是将溶液置于离心机内在离心力1500g离心1h，或2500g离心30min，在1500g和2500g离心力范围内，离心力加大或降低可适当缩短或延长离心时间。
优选的，在上述一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法中，步骤(5)中步骤(5)中所述白油-司本80混合液由体积比为47:3的的白油与司本80混匀，高压灭菌15min制备得到。
优选的，在上述一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法中，步骤(5)具体为：将1份浓缩及纯化后的病毒悬液与2份白油-司本80混合液混匀，超声波乳化，得到乳化液；另外在3份浓缩及纯化后的病毒悬液中加入6％吐温80(v/v)和0.01％硫柳汞(w/v)充分混匀制成外层病毒悬液，加入到所述乳化液内，再次超声波乳化，乳化完毕得到蓝舌病单型灭活疫苗，置于4℃保存。
本发明利用白油、司本80、吐温80、硫柳汞的组合作为佐剂、赋形剂和活化剂用于疫苗的制备，有利于提高蓝舌病病毒免疫效果的配方和乳化工艺。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，具有以下有益效果：
(1)按照本发明工艺，实现一次免疫可产生对两种血清型毒株及近亲血清型毒株的抗体，显著提高蓝舌病灭活疫苗免疫效率和效果。绵羊单次接种后相应毒株抗体阳性率可达可90％以上，并且抗体阳性绵羊70％及以上可有效抵抗病毒攻击；
(2)依据蓝舌病病毒特性，通过新的病毒培养方式和浓缩纯化方式的建立，实现疫苗免疫和野生毒株感染的可区别鉴别诊断；
(3)缩短BTV灭活时间，减少灭活过程中有效抗原损失：本发明通过优化和改进了灭活工艺，可在30小时内将BTV抗原彻底灭活，避免在疫苗制备过程中因灭活不彻底造成的疫病扩散的风险，有效降低灭活过程中的抗原损失；
(4)疫苗制备方法简单易行，成本低廉，实用性强：本发明对生产制备工艺、设施设备要求低，材料易于获得，操作简便，适合规模化生产的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为灭活操作中BTV灭活动力曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出一种新的蓝舌病病毒培养、灭活、纯化浓缩、配比工艺，结合佐剂、赋形剂与灭活抗原悬液的组合，实现高效诱导反刍动物同时产生对1型和16型蓝舌病病毒的免疫应答，有效去除非结构蛋白的干扰，实现疫苗免疫和野生毒株感染的可区别鉴定。
本发明所阐述的方法，应理解为不限于本发明所述的具体方法和实验条件，因为该方法和条件可改变。进一步，本文使用的术语仅是用于描述具体实施方案，而不是用来限制，下面对部分术语进行说明：
灭活：本发明所述“灭活”是指使感染性微生物丧失感染性，但同时保持其免疫原性，是本领域专业技术人员能够理解的。
免疫原性：抗原进入体内能刺激机体特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生针对该抗原的免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。
反刍动物：是指任何种类的偶蹄目且通常有角的哺乳动物，它们的胃分为四部分，这些动物包括绵羊、山羊、牛、长颈鹿和鹿。
接种：本发明所述“接种”指将灭活疫苗用注射器注射到动物的皮下或肌肉，为本领域一般专业技术人员能理解的。
以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，但是本发明的技术方案不以实施例为限。
1、1型和16型蓝舌病病毒培养
细胞培养瓶内BHK-21细胞长满单层后倾倒干净细胞培养液，适量无血清MEM细胞培养液彻底洗瓶1次并倾弃干净，每瓶接种2ml毒价为10-6左右的蓝舌病病毒种毒(1型或16型)和适量无血清MEM细胞培养液，37℃培养3-4天，待70％左右细胞出现显著病变时缓慢倾弃病毒培养液，加培养液1/10倍量无血清MEM细胞培养液，长柄无菌刮刀刮下未脱落的细胞，收集悬液并超声波破碎3-5分钟，置离心瓶内3000rpm离心20分钟，去除细胞渣，上清液即为蓝舌病病毒悬液。
病毒悬液进行进行病毒毒价测定，用无血清MEM培养液将病毒悬液稀释为10-6/100μL,4℃保存备用。1型和16型蓝舌病病毒悬液制备方法相同。I型蓝舌病病毒为Y853毒株，16型蓝舌病病毒为DH毒株，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室保存。
2、1型和16型蓝舌病病毒灭活
1)0.1M BEI灭活剂配制：配制0.175M氢氧化钠(NaOH)溶液，在该溶液内加入0.1MBEA，37℃放置2小时完成BEA的环化反应，形成0.1M的BEI溶液，置4℃保存备用。配好的试剂必须在72小时内使用方可有效。
2)蓝舌病病毒悬液中加入6％的上述灭活剂，即病毒悬液内灭活剂终浓度为6mM，同时按照青霉素钠400万单位/升、链霉素100万单位/升、两性霉素B 0.1毫克/升的量加入到病毒悬液中。充分混匀后置37℃温箱200转/分钟搅拌灭活，分别在灭活15、25小时时更换无菌灭活容器，30小时后加0.6％1M的硫代硫酸钠充分混匀，灭活完毕，置4℃保存。
另外，本发明通过优化和改进了灭活工艺，可在30小时内将BTV抗原彻底灭活，避免在疫苗制备过程中因灭活不彻底造成的疫病扩散的风险，有效降低灭活过程中的抗原损失。具体的，本发明对蓝舌病病毒悬液的灭活时间进行了相关试验，BTV灭活动力曲线如图1所示，可以发现蓝舌病病毒悬液在27小时即可实现完全灭活，为保证由于误差造成的灭活不彻底，灭活时间延长至30小时。
3、病毒浓缩纯化和乳化配比
1)将分析纯聚乙二醇6000(PEG6000)按照重量比7％的量加入到步骤1中已灭活的蓝舌病病毒悬液中，同时将分析纯氯化钠按照重量比2.22％的量加入到上述已灭活的蓝舌病抗原悬液中，置4℃空间内通过搅拌、震荡或摇晃等方式在不低于1小时、最好不超过但不局限于12小时的时间内使聚乙二醇6000和氯化钠充分溶解。
2)将上述1)中悬液置离心机内在离心力1500g离心1小时，或2500g离心30分钟，在1500g和2500g离心力范围内，离心力加大或降低可适当缩短或延长离心时间。
3)离心结束后，轻轻倒弃上清液，保留沉淀，加入少量无血清MEM细胞培养液或pH为7.2-7.4的0.01M的三羟甲基氨基甲烷(Tris)通过物理震荡或液体吸吹的方式重悬沉淀，此重悬物即为纯化后的病毒悬液。无血清MEM细胞培养液或0.01M的三羟甲基氨基甲烷的加入量以通过震荡液体吸吹的方式可完全溶解沉淀为准，可依据需要用MEM培养液对悬液进行不同浓度的稀释。本实施例依据BCA蛋白定量方法和cELISA定量方法进行抗原定量，设置1μg、5μg、10μg和50μg/头份组，同时设立空白对照组。
4、将470毫升的白油与30毫升的司本80(Span-80)混匀，高压灭菌15分钟，形成白油-司本80混合液。每一份即为一个体积单位，将2份白油-司本80混合液与1份上述纯化好的灭活病毒悬液混匀，超声波乳化。另取3份灭活病毒悬液加入8％吐温80(体积比)和1％硫柳汞，溶解混匀后，加入到上述乳化液内，再次超声波乳化。乳化好后置4℃保存，此即是制备好的蓝舌病灭活疫苗，不同含量抗原组分别制备。
1型蓝舌病病毒和16型蓝舌病病毒乳化后液体按照1:2(v/v)配比混匀，此即是制备好的蓝舌病灭活疫苗，反刍动物肌肉或皮下接种2毫升/头、只，1周后产生可抵抗蓝舌病病毒感染的抗体。
疫苗接种及攻毒试验
随机选择30只绵羊(6-12月龄)为实验动物，7天后待试验动物适应了新的饲养环境进行灭活疫苗免疫接种。30只绵羊共分为4组，分别为试验1组(10只)、试验2组(10只)、对照1组(5只)、对照2组(5只)。试验组每只绵羊肌肉注射接种2ml灭活疫苗，对照组每只绵羊肌肉注射接种2ml MEM培养液。
灭活疫苗接种21天后进行攻毒试验。攻毒毒株：1型蓝舌病病毒为Y863毒株(毒价为10-5CEID50)，16型蓝舌病病毒为DH毒株(毒价为10-4.5CEID50)，均为绵羊血液毒，由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室制备、保存。颈静脉注射1ml/只攻毒毒株，试验1组和对照1组接种1型蓝舌病病毒为Y863毒株，试验2组和对照2组接种16型蓝舌病病毒为DH毒株。
疫苗免疫效果评估
(1)抗体效果评估
灭活疫苗接种前和接种后每7天采一次血，分离血清，应用蓝舌病病毒竞争酶联免疫吸附试验抗体检测方法(BTV cELISA)进行血清抗体检测，该方法为世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测方法，操作方法和判定标准参照国标“蓝舌病诊断技术”(GB/T 18636-2017)。并且每天固定时间观察绵羊状态变化。
抗体结果显示，试验1组和试验2组抗体阳性率均为100％，疫苗免疫效果良好，对照1组和对照2组抗体阳性率为0％，对照正常。试验组和免疫组所有绵羊均未出现明显临床症状。
表1 BTV灭活疫苗试验cELISA抗体检测及临床观察结果
注:抗体抑制率≥50％判定为蓝舌病病毒抗体阳性。
(2)攻毒后临床症状和核酸检测
进行临床症状观察记录和应用real-time RT-PCR对攻毒0、1、2周采集的绵羊全血进行检测。结果显示，试验1组(接种1型蓝舌病病毒)、试验2组(接种16型蓝舌病病毒)均有7只绵羊获得完全保护，血液内无核酸检出，未出现临床症状；两组均有有3只绵羊可在血液检出核酸并不同程度出现临床症状，但转归良好。
表2攻毒实验核酸检测和临床症状观察结果
注：Ct值≤34判为蓝舌病病毒核酸阳性，否则为阴性标记为N；蓝舌病病毒症状为接种病毒后1～2周综合典型症状打分，包括体温升高、口鼻及蹄部可视粘膜发红、精神沉郁、死亡，0分为无症状，分值越高症状越明显，10分为死亡。
需要说明的是：本发明免疫效果测试是通过监测因接种本疫苗而使机体产生的细胞免疫和特异性的体液免疫实现的，这些测试是本领域技术人员已知的。或者进行攻毒试验，即通常易感动物在接种后约1至2周，抗原诱导抗体或T细胞应答发生后，用相应的可感染病毒对接种疫苗的易感动物和未接种疫苗的易感动物进行病毒感染攻击试验，监测与病毒感染相关的症状情况，或动物的死亡情况，比较接种疫苗的易感动物和未接种疫苗的易感动物间的区别，比如接种疫苗的易感动物病毒感染相关症状的明显减少，或病毒血症的减少，或与病毒感染相关的损伤的数量或严重程度的减少，或死亡的减少，也可收集血清监测由于疫苗注射而产生的抗体水平，或其它本领域技术人员已知的方法测量。
以上对本发明所提供的一种蓝舌病灭活疫苗制备方法进行了详细介绍。本文通过具体实施方式对本发明的原理和实施方式进行了阐述，以上说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的方案而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
Claims (10)
1.一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)病毒培养：BHK-21细胞分别接种单一血清型蓝舌病病毒种毒，以无血清MEM细胞培养液进行培养，待60～80％细胞出现显著病变时缓慢倾弃病毒培养液，然后再加入适量无血清MEM细胞培养液，刮下未脱落的细胞，收集悬液，超声波破碎后离心去除沉淀，上清液即为蓝舌病病毒悬液；
(2)制备灭活剂：在0.5～0.7％氢氧化钠溶液中加入二乙烯亚胺制备浓度为0.1mol/L的二乙烯亚胺溶液，于37℃静置1～2h，得到灭活剂，置于4℃条件下保存备用；
(3)灭活操作：向蓝舌病病毒悬液中加入灭活剂灭活，然后加入硫代硫酸钠混匀，灭活完毕，得到灭活的蓝舌病抗原悬液，置于4℃保存备用；
(4)浓缩及纯化：在灭活的蓝舌病抗原悬液中加入PEG6000和氯化钠，在4℃的条件下搅拌至充分溶解，然后进行离心操作，弃去上清液后，重悬沉淀，得到的重悬物即为浓缩及纯化后的病毒悬液；
(5)抗原乳化：将浓缩及纯化后的病毒悬液与白油-司本80混合液混匀，超声波乳化，得到乳化液；另外取浓缩及纯化后的病毒悬液，加入吐温80和硫柳汞充分混匀制成外层病毒悬液，加入到所述乳化液内，再次超声波乳化，乳化完毕得到蓝舌病单型灭活疫苗，置于4℃保存；
(6)疫苗配比：1型蓝舌病病毒和16型蓝舌病病毒灭活抗原分别同条件按照步骤(5)乳化后获得各自血清型单型疫苗，1型蓝舌病单型灭活疫苗和16型蓝舌病单型灭活疫苗按照1:2～3(v/v)配比混匀，即成蓝舌病病毒二价灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述蓝舌病病毒包括蓝舌病病毒1型、2型、3型、4型、5型、7型、9型、10型、12型、15型、16型、21型、24型。
3.根据权利要求1所述的一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养温度为37℃，培养时间为3～4天，并且倾弃病毒培养液后所述无血清MEM细胞培养液的加入量为所述培养液体积的1/10。
4.根据权利要求1所述的一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述超声波破碎时间为3～5min，所述离心时间为20min，转速为3000rpm。
5.根据权利要求1所述的一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述灭活剂的添加量为所述蓝舌病病毒悬液体积的6％(v/v)，且所述灭活剂的浓度为0.1mol/L；所述灭活在37℃的温箱中搅拌灭活30h，搅拌速率为100～200rpm/min。
6.根据权利要求1所述的一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述硫代硫酸钠的加入量为所述蓝舌病病毒悬液体积的0.6％(v/v)，且所述硫代硫酸钠的摩尔浓度为1mol/L。
7.根据权利要求1所述的一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述PEG6000的添加量为所述灭活的蓝舌病抗原悬液重量的5～9％，所述氯化钠的添加量为所述灭活的蓝舌病抗原悬液重量的1～4％。
8.根据权利要求1所述的一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述重悬沉淀为：在沉淀中加入液体总量1/10(v/v)的无血清MEM细胞培养液或pH为7.2-7.4的0.01M的三羟甲基氨基甲烷盐酸。
9.根据权利要求1所述的一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述白油-司本80混合液由体积比为47:3的的白油与司本80混匀，高压灭菌15min制备得到。
10.根据权利要求1或9所述的一种蓝舌病病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(5)具体为：将1份浓缩及纯化后的病毒悬液与2份白油-司本80混合液混匀，超声波乳化，得到乳化液；另外在3份浓缩及纯化后的病毒悬液中加入6％吐温80(v/v)和0.01％硫柳汞(w/v)充分混匀制成外层病毒悬液，加入到所述乳化液内，再次超声波乳化，乳化完毕得到蓝舌病单型灭活疫苗，置于4℃保存。
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