CN112858686B - 一组用于预测口腔种植体周围炎的龈沟液标志物及其应用和试剂盒 - Google Patents

一组用于预测口腔种植体周围炎的龈沟液标志物及其应用和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一组用于预测口腔种植体周围炎的龈沟液标志物及其应用、试剂盒及试剂盒的制备方法，属于生物医药技术领域。本发明所述标志物包括IL‑1α、IL‑1β、IL‑21、HGF、VEGF‑A、GRO‑α和IL‑8中一种或两种以上。利用本发明提供的生物标志物或者其制备得到的试剂盒进行口腔种植体周围炎的预测，具有检测快速、准确、费用低等优点，应用前景广阔。

Description

一组用于预测口腔种植体周围炎的龈沟液标志物及其应用和 试剂盒
技术领域
本发明属于医药生物类，具体地说，涉及一种用于预测口腔种植体周围炎的龈沟液标志物、用于检测的液相芯片试剂盒及其制备方法。
背景技术
种植修复作为缺失牙患者的一项重要治疗手段，在临床的应用愈加广泛。延长种植体的使用寿命对于保障患者口腔健康和提高种植修复的临床效果有重要意义。研究证实，种植修复体与天然牙周围组织结构有许多共同特征，同时也存在组织结构差异，例如：胶原纤维含量，成纤维细胞数量，免疫炎症细胞组分及数量，毛细血管结构和数量等存在差异；种植体与牙槽骨紧密结合，不存在牙周膜等任何软组织结构等。相关组织结构的差异使种植修复体比天然牙更易受到菌斑及应力的影响，一旦组织发生炎症，其进展也更为迅速。而种植体周围黏膜炎和种植体周围炎的发生会影响种植体的修复效果, 甚至会导致种植修复的失败。研究统计，种植体周围黏膜炎和种植体周围炎的平均患病率分别为43％和22％。如果在种植修复体出现临床指标可判定的炎症反应前,能够做到早发现，早诊断和早治疗，将有利于提升种植修复的成功率，同时提高种植体的使用寿命。
龈沟液(gingival crevicular fluid,GCF)作为人体渗出液，由牙龈组织或牙周组织渗入到龈沟或牙周袋中，与牙周组织健康关系密切。随着炎症的发生和进展龈沟液内炎症成分表达量升高，而细胞因子作为免疫炎症反应的先行者，其在龈沟液内的表达能很好反映周围组织健康状态和炎症趋势，可为临床疾病的诊断带来客观证据。目前，临床上对于牙周疾病或者种植体周围疾病的诊断主要依靠临床指标(如，探诊深度，牙龈出血指数，牙齿/种植体松动度等)和X线数字减影技术。虽然可以准确诊断临床疾病，但疾病已经进入临床病损阶段，缺乏对疾病早期预警和发现的能力，无法减少疾病的发生和在早期阻断病程。结合龈沟液生物标志物的临床应用前景以及种植修复的普及，对缺失牙进行种植修复咬合功能重建后，对种植体周围龈沟液 (peri-implant crevicular fluid,PICF)内细胞因子进行检测，可以在一定程度反应种植体周围组织微环境状态的变化，并为做到早发现，早诊断和早治疗提供可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一组用于预测口腔种植体周围炎的龈沟液标志物及其应用和试剂盒以及试剂盒的制备方法。
本发明提供了一组用于预测口腔种植体周围炎的龈沟液标志物，所述标志物包括IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8中的一种或两种以上。
根据本发明所述的生物标志物，其中作为优选地，所述口腔种植体周围炎包括口腔种植体周围炎及其所导致牙周疾病。
本发明还提供了上述技术方案所述的标志物在制备用于预测口腔种植体周围龈沟液内的炎症的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于预测口腔种植体周围炎的试剂盒，所述试剂盒中包括：分别包被有IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8 中的一种或两种以上的捕获抗体的编码微球，生物素分别标记的IL-1α、IL-1β、 IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8中的一种或两种以上的检测抗体，链霉亲和素标记的藻红蛋白。
本申请对试剂盒中各组分含量不做特别限定，本领域技术人员可以根据检测的实际情况进行组分含量的配比调整。进一步，优选地，本申请试剂盒的各组分相同体系下的用量关系如下：
羧基微球：0.4×106～1.6×106个；
捕获抗体：IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8捕获抗体各30～70μg；
检测抗体：IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8检测抗体各0.6～1.4mg；
生物素：0.6～1.4mg；
链霉亲和素标记的藻红蛋白：本申请不作特别限定，本领域常规市售产品或采用本领域常规方法制备得到均可，用量可以参照市售产品说明书或本领域常规方式添加，本申请在此不做特别限定。
优选的，所述IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8捕获抗体的克隆号分别为ILA9-H18、ILB1-H67、eBio3A3-N2、24612.111、16F1、 48415和6E7-C11-C9。
优选的，所述IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A和IL-8检测抗体的克隆号分别为ILA8-H12、ILB1-H6、eBio2B2-G20、0.N.326、P802B和 3IL8-H10，所述GRO-α的检测抗体为多克隆抗体。
优选的，所述编码微球包括羧基微球。
优选的，所述生物素包括N-羧琥珀酰亚氨活化生物素。
本发明还提供上述任一所述试剂盒的制备方法，所述制备包括以下步骤：
制备包被捕获抗体的编码微球：将IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、 GRO-α和IL-8中的一种或两种以上的捕获抗体分别与对应的编码微球偶联，分别得到包被有IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8中的一种或两种以上的捕获抗体的编码微球；
制备生物素标记的检测抗体：分别在IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、 GRO-α和IL-8中的一种或两种以上的检测抗体上连接生物素，得到分别被生物素标记的IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8中的一种或两种以上的检测抗体。
有益效果：
本发明提供了一组用于预测口腔种植体周围炎的龈沟液标志物，所述标志物为IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8中的一种或两种以上。实验表明，对“口腔种植体周围炎”发生风险高的口腔种植患者，其血清中IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8的基线浓度均显著高于“口腔种植体周围炎”发生风险低的患者。
利用本发明提供的IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8 中的一种或两种以上的生物标志物或者其制备得到的试剂盒进行口腔种植体周围炎的预测，具有检测快速、准确、费用低等优点，应用前景广阔。
附图说明
图1-7依次为检测龈沟液中生物标志物IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、 VEGF-A、GRO-α和IL-8的标准曲线示意图；
图8液相芯片试剂盒检测到IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8浓度显著高于未发生口腔种植体周围炎的患者；
图9患者龈沟液中IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8 动态的浓度变化预测口腔种植体周围炎示意图；
图10为IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α、IL-8对应口腔种植体周围炎预测的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，每个细胞因子对应的曲线下面积(AUC)和95％置信区间(95％CI)见图示。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
用于IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α、IL-8生物标志物检测的液相芯片试剂盒的制备。
1，试剂盒组成：
(1)7-plex包被微球：含有分别包被了IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、 GRO-α、IL-8捕获抗体的编码微球；
(2)7-plex生物素标记检测抗体：用生物素分别标记的IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α、IL-8检测抗体；
(3)链亲和素藻红蛋白。
其中，IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α、IL-8捕获抗体的克隆号分别为ILA9-H18、ILB1-H67、eBio3A3-N2、24612.111、16F1、48415、 6E7-C11-C9；
IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、IL-8检测抗体的克隆号分别为 ILA8-H12、ILB1-H6、eBio2B2-G20、0.N.326、P802B、3IL8-H10，GRO-α的检测抗体为多克隆抗体。
2，试剂盒的制备方法包括以下步骤：
(1)相应捕获抗体包被相应微球
a.取羧基微球用漩涡振荡器振荡微球悬液20s,使微球混合均匀；
b.取羧基微球1.1×106个，转移到离心管中，≥8000g离心2min，沉淀微球；
c.移走上清，加入dH2O 100μL，用漩涡振荡器振荡20s重悬微球，≥8000g离心2min，沉淀羧基微球；移走上清，加入100mmol/L，pH值6.2 的磷酸二氢钠盐溶液80μL，用漩涡振荡器振荡20s，重悬洗涤的羧基微球；
d.加入50mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺10μL，用漩涡振荡器轻轻地振荡；
e.加入50mg/mL的1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺10μL，用漩涡振荡器轻轻振荡；
f.室温孵育20min，每隔10min用漩涡振荡器轻振，≥8000g离心2min，沉淀活化的羧基微球；
g.移走上清，加入50mmol/L，pH值5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)，漩涡振荡器振荡20s，重悬活化的羧基微球，≥8000g离心2min，沉淀洗涤后的羧基微球；重复该步骤2次，用50mmol/L，pH值5.0的MES洗涤2次，加入50mmol/L，pH值5.0的MES，用漩涡振荡器振荡20s，在混匀的微球中分别加入55μg IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α、IL-8捕获抗体，用50mmol/L，pH值5.0的MES定容至500μL，用漩涡振荡器混匀；于室温置于摇床上孵育2h，≥8000g离心2min，沉淀偶联好的微球；
h.移走上清，加入PBS-TBN 300μL，漩涡振荡器振荡30s；于室温置于摇床上孵育30min，≥8000g离心2min，沉淀偶联好的微球；
i.移走上清，加入PBS-TBN 1mL，漩涡振荡器振荡30s，≥8000g离心 2min，沉淀偶联好的微球；重复该步骤l次，用PBS-TBN洗涤2次；
j.加入PBS-TBN 1mL，重悬偶联好且经过洗涤的微球，即得IL-1α、IL-1β、 IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8捕获抗体与微球的偶联体；
k.用细胞计数器计数微球的数量，浓度为2.5×105个/mL；将偶联好的微球置于4℃避光保存；
(2)相应检测抗体的生物素化
l.分别将1mg的IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α、IL-8 检测抗体用0.1mol/L，pH值8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释到1mg/mL，终体积为1mL；
m.交互用0.1mol/L，pH值8.0的碳酸氢钠缓冲液对蛋白质充分透析；
n.用1mL二甲基亚砜溶解N-羟琥珀酰亚氨活化生物素1mg；
o.分别向1mL的IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α、IL-8 检测抗体溶液中加入1g/L的NHSB溶液120μL；在室温下持续搅拌，保温2-4h；
p.加入1mol/L NH4Cl溶液9.6μL，在室温下搅拌10min，在4℃下对 PBS充分透析，以除去游离的生物素；将样品上1mL的分子筛柱，以PBS 缓慢洗脱，收集1mL/管，蛋白质在1～3mL之间洗脱；样品加入终浓度为 0.5g/L的叠氮钠及1.0g/L BSA；将结合产物置于4℃避光保存。
实施例2
IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α、IL-8液相芯片试剂盒在预测口腔种植体周围炎中的应用。
1，实验目的：
证明IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α、IL-8的在种植修复一周后龈沟液内浓度在发生种植体周围炎患者中高。
2，实验对象：
(1)在知情同意及满足纳入条件的前提下，选择入组病例，记录个人基本信息。种植修复患者队列来自于首都医科大学附属北京口腔医院36例患者。
(2)提取患者入院时行种植义齿修复后1周龈沟液，标本至于-80℃冰箱中保存。
3，试剂准备
采用实施例1中制备的试剂盒：
(1)Beads：将所需Beads(微球)超声30秒，涡旋1min，然后各取出60μL 加入MixingBottle，剩余体积用Bead Diluent补足3mL，充分混匀，2～8℃贮存一个月。
(2)Quality Control：用250μL蒸馏水分别溶解对照1和2(即常规市售重组蛋白)，颠倒多次使其充分混匀，静止5-10min，然后分别移入两个试管中，-20℃贮存一个月。
(3)Standard：用250μL蒸馏水溶解Standard，颠倒多次使其充分混匀，静止5～10min，然后移入试管中，标记为Antigen standard vial。然后另取7 个试管，分别标记为S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7。在S2，S3，S4，S5， S6，S7中分别加入150μL Assay缓冲液。将Antigen standard vial管中液体转移200μL至S1中。将S1中液体取出50μL转移至S2中，轻柔吹打混合10次。将S2中液体取出50μL转移至S3中，轻柔吹打混合10次。将S3 中液体取出50μL转移至S4中，轻柔吹打混合10次。将S4中液体取出 50μL转移至S5中，轻柔吹打混合10次。将S5中液体取出50μL转移至S6中，轻柔吹打混合10次。将S6中液体取出50μL转移至S7中，轻柔吹打混合10次，-20℃贮存一个月。
(4)Wash Buffer：将10×WB放置室温，使其中盐分充分溶解，30mL WB+270mL蒸馏水将其配成1×(1倍)，4℃保存一个月。
(5)Serum Matrix：向SM中加入1mL蒸馏水使其充分溶解，静止10min，然后移入试管里，-20℃贮存一个月。
4，实验流程：
(1)向96孔板中每孔加入200μL Wash Buffer，室温摇十分钟润洗，然后直接倒掉，充分擦干。
(2)分别加入25μL；
@Serum Matrix到Background、Standard和Control；
@Assay Buffer到样品孔；
@Assay Buffer到Background；
@Standard和Control到各自位置；
@样品到对应样品孔；
@Beads到每个孔，4℃避光过夜振荡孵育。
(3)洗板机洗2遍。
(4)每孔加25μL检测抗体，室温避光摇1h。
(5)每孔加25μL SAPE，室温避光摇30min。
(6)洗板机洗2遍，最后每孔加150μL鞘液上机(Luminex系统)检测。
5，实验结果：
用液相芯片试剂盒来预测口腔种植体周围炎，检测患者龈沟液中的IL-1α、 IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α、IL-8的浓度此7种血清生物标志物的浓度是根据机器读取的荧光值及对应的标准曲线计算得来，7种血清生物标志物的标准曲线见图1至图7及表1。各标准曲线中的截断值(Cut-off) 都是30％Bias(表示暂不显示)。表1中，Fit：表示符合度，Cut-off:30％Bias：代表暂时不展示；LLOQ：代表最低值；ULOQ：代表最高值。
表1 7种血清生物标志物的标准曲线参数
Figure GDA0003191676180000081
Figure GDA0003191676180000091
实验结果表明，口腔种植体周围炎患者IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、 VEGF-A、GRO-α和IL-8的浓度显著高于未发生口腔种植体周围炎的患者，具体结果如图8所示；利用患者龈沟液中IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF- A、GRO-α、IL-8动态的浓度变化进行口腔种植体周围炎预测见图9.利用患者龈沟液中IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α、IL-8进行口腔种植体周围炎预测的受试者工作特征曲线(ROC曲线)见图10，曲线下面积(AUC)和95％置信区间(95％CI)见图示。
实验结果表明，对口腔种植体周围炎患者龈沟液中IL-1α、IL-1β、IL-21、 HGF、VEGF-A、GRO-α、IL-8浓度的检测，可实现对患者出现口腔种植体周围炎风险的准确预测，预测准确率分别为(0.722，0.726，0.639，0.611， 0.620，0.669，0.649)。
虽然，本申请中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一组标志物IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8在制备用于预测口腔种植体周围炎的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中包括:分别包被有IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8的捕获抗体的编码微球，生物素分别标记的IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8的检测抗体，链霉亲和素标记的藻红蛋白。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8捕获抗体的克隆号分别为ILA9-H18、ILB1-H67、eBio3A3-N2、24612.111、16F1、48415和6E7-C11-C9。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A和IL-8检测抗体的克隆号分别为ILA8-H12、ILB1-H6、eBio2B2-G20、0.N.326、P802B和3IL8-H10，所述GRO-α的检测抗体为多克隆抗体。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述编码微球包括羧基微球。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生物素包括N-羧琥珀酰亚氨活化生物素。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒通过以下方法制备：
制备包被捕获抗体的编码微球：将IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8的捕获抗体分别与对应的编码微球偶联，分别得到包被有IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8的捕获抗体的编码微球；
制备生物素标记的检测抗体：分别在IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8的检测抗体上连接生物素，得到分别被生物素标记的IL-1α、IL-1β、IL-21、HGF、VEGF-A、GRO-α和IL-8的检测抗体。
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