CN112852823B - 一种具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的核酸适配体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的核酸适配体，属于食品安全生物技术领域。本发明利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)筛选得到具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的寡核苷酸适配体CIV6(核苷酸序列如SEQID NO.1所示)，其具有高亲和性和高特异性，为无环鸟苷类似物快速、准确、灵敏检测提供重要基础，具有广泛的应用前景。

Description

一种具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的核酸适配体
技术领域
本发明属于食品安全生物技术领域，涉及到一种具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的核酸适配体，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)筛选具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的寡核苷酸适配体，并为该核酸适配体在检测食品中、兽药中无环鸟苷类似物的应用提供科学依据和理论基础。
背景技术
阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦等抗病毒药物是一种无环鸟嘌呤核苷类似物。它们可以抑制病毒的DNA和RNA聚合酶，从而抑制病毒繁殖，对多种病有抑制作用，是单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒6(HHV-6)和巨细胞病毒(CMV)的有效药物。但是这些药物的过量使用会引起诸如肾毒性、神经毒性、静脉肿、头痛、荨麻疹、呕吐和腹泻等不良反应，出现抗药性菌株，对人体和环境产生危害。因此对食品中无环鸟苷类似物的高效检测具有现实的需求和意义。
目前针对无环鸟苷类似物的检测方法主要分为两大类：一类是以质谱和液相色谱为主的仪器检测，操作较为繁琐、仪器昂贵、检测费用高、需专门的技术人员进行操作；另一类是光谱法，操作较为简便但是特异性不高，应用条件有所局限。因此开发一种新型的快速简便的检测方式是非常必要的。
核酸适配体是指一种与抗体功能类似，可依靠特殊二级结构、空间构象以及特殊作用力同特定靶标高亲和力、特异性结合的单链寡核苷酸分子(ssDNA或RNA)，是通过指数富集配体系统进化SELEX(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment)方法得到的。适配体可以通过DNA链内碱基互补配对作用形成稳定二级结构，从而在氢键以及静电作用下自身折叠形成的复杂特殊三级结构(如发卡、茎环、G-四联体、凸环等结构)，这些为适配体与靶标作用提供了基础。所以，适配体可以依靠自身特殊结构通过芳香环、静电相互作用、范德华力、氢键作用以及形状互补等相互作用与靶标特异性结合。适配体有以下特点：特异性高，可通过适配体与靶标间特殊结合作用识别鉴定手性分子、相差一分子甲基的两种物质；亲和性好，其解离常数可以达到纳摩尔甚至皮摩尔级别；分子量范围大约为10kDa-30kDa，易于靶向治疗、无免疫原性；制作成本低，适配体通过体外筛选短时间获得，可进行大量化学合成并且纯度高，无需进行细胞实验或动物实验，批次差异小；稳定性高、适应性好，高温变性低温复性，酸碱度变化不敏感，在有机溶剂中也可保存，保质期长，可常温运输；易于修饰，可以进行荧光标记、生物素标记，也可以与纳米材料结合制备生物传感器；作用范围广，文库容量大，可与金属离子、氨基酸、核苷酸、抗生素等小分子结合，也可与蛋白质、核酸等大分子结合，甚至可以与病毒、细胞、组织或器官等生物活性个体结合。综上，适配体可以作为一种新型的分子识别元件，在食品检测、环境监测、分子成像、药物递送、疾病诊断和临床治疗等领域应用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的核酸适配体，并为该核酸适配体在检测食品中、兽药中无环鸟苷类似物的应用提供科学依据和理论基础。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的核酸适配体，所述核酸适配体选自：具有5’-TGAGCCCAAGCCCTGGTATG-n-GGCAGGTCTACTTTGGGATC-3’序列特征的核酸适配体，其中，n为TGAAAACATACTAGACGTGGCTATGTATTTTTAAATCAAT或与TGAAAACATACTAGACGTGGCTATGTATTTTTAAATCAAT序列相似度达80％以上的核苷酸序列。当n为TGAAAACATACTAGACGTGGCTATGTATTTTTAAATCAAT时，该适配体即为CIV6，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，n为TGAAAACATACTAGACGTGGCTATGTATTTTTAAATCAAT或与TGAAAACATACTAGACGTGGCTATGTATTTTTAAATCAAT序列相似度达90％以上的核苷酸序列。
进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列中，胸腺嘧啶用尿嘧啶替换。
进一步地，所述核酸适配体经过了修饰。
进一步地，所述核酸适配体经过反向dT或聚乙二醇修饰，所述反向dT或聚乙二醇修饰结合在核酸适配体的5’端或3’端。
进一步地，所述核酸适配体的各个嘧啶核苷酸的核糖2’位羟基是未被替换的，或被选自氢原子、甲氧基和/或氟原子的原子或基团替换。
进一步地，所述核酸适配体的各个嘌呤核苷酸的核糖2’位羟基是未被替换的，或被选自氢原子、甲氧基和/或氟原子的原子或基团替换。
进一步地，所述核酸适配体的5’端或3’端经过FITC、氨基、生物素或地高辛化学修饰。
进一步地，所述无环鸟苷类似物为阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦、泛昔洛韦或更昔洛韦。
本发明还提供了一种检测无环鸟苷类似物的试剂盒，所述试剂盒中含上述的核酸适配体。
本发明还提供了上述核酸适配体在检测食品或兽药中的无环鸟苷类似物中的应用。
本发明以阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦、泛昔洛韦和伐昔洛韦五种鸟嘌呤核苷类似物为靶标，采用Capture-SELEX技术筛选出具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的寡核苷酸适配体，具有稳定性高、合成方便、易标记功能基团等特点，将广泛应用于食品中无环鸟苷类抗病毒药物的快速检测。
附图说明
图1：氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒的透射电镜图(A)和傅里叶红外光谱图(B)。
图2：亲和素包被氨基化Fe3O4磁珠前后的紫外吸收图。
图3：基于Capture-SELEX技术筛选具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的寡核苷酸适配体的原理图。
图4：筛选过程中溶解曲线。
图5：候选适配体特异性图(GO偏振法(A)、GO荧光法(B))。
具体实施方式
以下结合实施例和说明书附图对本发明作进一步描述。
实施例
下面是通过Capture-SELEX技术筛选具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的寡核苷酸适配体(如图3所示)的研究。
1.合成随机单链DNA文库和引物(由大连宝生物TaKaRa公司完成)
随机ssDNA文库:
5’-TGAGCCCAAGCCCTGGTATG-N40-GGCAGGTCTACTTTGGGATC-3’
5’羧基荧光素标记上游引物：5’-FAM-TGA GCC CAA GCC CTG GTA TG-3’
5’磷酸化下游引物：5’-P-GAT CCC AAA GTA GAC CTG CC-3’
互补链Capture-P3：5’-Bio-GATCCCAAAGTAGAC-3’将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成100μM贮存液存于-20℃备用。
2.Fe3O4磁性颗粒载体的准备
(1)氨基化Fe3O4磁性颗粒的制备与表征
采用一步合成法制备Fe3O4磁性纳米颗粒：将30mL乙二醇、1g六水合三氯化铁和2g醋酸钠依次加入150mL圆底烧瓶中，磁力搅拌混匀，再加入6.5g 1,6-己二胺；在50℃水浴锅中磁力搅拌至均匀紫色胶体溶液；将溶液转移至100mL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，198℃反应6h；磁分离去除上清液，用100mL无水乙醇、100mL水分开依次洗涤磁分离3次；50℃烘箱过夜干燥。采用透射电镜和傅里叶红外对其进行表征。结果如图1所示，合成的氨基化磁珠形貌较为稳定均一，粒径大小在40-60nm，600cm-1处出现强的Fe-O振动峰，且1592、1400和1057cm-1的透过率与1,6-己二胺相匹配，表明Fe3O4磁珠上存在游离的NH2基团，Fe3O4磁性纳米颗粒在合成过程中已成功氨基化。
(2)亲和素包被磁珠
将5mg氨基化磁珠加入5mL PBS溶液超声30min，加入200μL 25％戊二醛，37℃、130rpm避光反应3h；PBS溶液清洗磁分离四次后加4.5mL PBS溶液和1mg/mL亲和素溶液(终浓度为100μg/mL)，37℃、130rpm避光反应12h。反应结束后取上清液用紫外分光光度计测定验证亲和素成功包被，磁珠用PBS缓冲液洗涤三次后避光置于4℃保存。如图2所示，亲和素包被前280nm处的吸光度为0.199，过夜包被后溶液经过磁分离，吸取上清液测得吸光度为0.068，表明亲和素已成功偶联氨基化Fe3O4磁珠。
3.无环鸟苷类似物适配体的筛选
(1)将文库和与生物素标记的Capture-P3互补链杂交互补：第一轮筛选中，ssDNA文库的投入量为1nmol，将1000pmol ssDNA文库与Capture-P3以1:2的摩尔量比加入到BB溶液中混匀(终体积为1mL)，95℃加热变性10min，置于冰中降温，在37℃杂交互补2h；
(2)将连接上生物素的文库与包被亲和素的磁珠固定：将ssDNA文库与磁珠以质量比为300:1结合，37℃、130rpm固定3h，磁分离取上清液用紫外分光光度计测定验证ssDNA固定情况，BB缓冲液(50nM Tric-HCl,5nM KCl,100nM NaCl,1nM MgCl2,pH＝7.4)清洗三次；
(3)解离结合的ssDNA：加入靶标37℃、130rpm反应2h(无环鸟苷类似物终浓度为400μM)，磁分离取上清液作为PCR扩增的模板。收集上清液作为第一轮适配体库。
(4)PCR扩增：以第一轮适配体库为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为0.5μL正向引物(10μM)，0.5μL反向引物(10μM)，0.5μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)，1μL dNTP mix(5mM)，5μL10×PCR扩增缓冲液，1μL模板和41.5μL灭菌超纯水，总体积为50μL。扩增条件为：94℃、5min，94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，以此为条件重复15个循环，72℃延伸2min，4℃冷却。
(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳验证：PCR产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。酶切后的ssDNA产物采用8％变性聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素)进行电泳，使用凝胶成像仪成像，观察电泳条带是否单一明亮，条带是否处在80bp的位置。
(6)PCR产物的纯化及酶切与酶切产物的纯化：PCR产物采用纯化试剂盒纯化，将得到的PCR产物用纯化试剂盒纯化后，纯化后PCR产物的浓度采用NanoDrop微量紫外可见分光光度计测定，并计算Lambda核酸外切酶的反应时间，使Lambda核酸外切酶能够完全切除5’端磷酸基团修饰的反向链，制备得到用于下一轮筛选的ssDNA作为次级文库。具体操作为：向纯化后的PCR产物中加入1/10体积的酶切缓冲液和2μL Lambda核酸外切酶混合均匀，在37℃下反应20min，之后75℃、10min使Lambda核酸外切酶失活，终止反应。加入溶液1/10体积3M的NaAC和2倍体积无水乙醇混匀，-20℃过夜沉淀。沉淀后溶液4℃、14000rpm离心15min弃上清后，加入200μL70％乙醇，上下颠倒混匀，4℃、14000rpm离心15min，弃上清后50℃干燥。加入1×TE缓冲液溶解作为下一轮筛选的文库。
为了提高适配体的结合能力，增加筛选压力，ssDNA文库的用量逐渐减少从1nmol到30pmol。同时，孵育时间也逐渐缩短。为提高适配体选择的特异性，分别于第6、8、11、13、14、15、16轮加入金刚烷胺、盐酸金刚乙胺、盐酸吗啉双呱和利巴韦林抗病毒药物进行了反向筛选。
4.实时定量Q-PCR溶解曲线监测适配体富集
本发明采用实时定量Q-PCR溶解曲线监测适配体在筛选过程中的富集情况。采用Applied Biosystems 7900HT实时荧光定量PCR仪测定并使用该序列监测系统进行数据分析，体系中添加SYBR green作为荧光染料。PCR方案为1：95℃变性5min；2：95℃10s；3：60℃30s，并重复2、3步骤进行40个循环，溶解曲线从软件SDS 2.4中获得，以此表征适配体筛选过程中的富集情况。如图4所示，溶解温度处于60-70℃之间的为异源性序列，随着筛选轮数增加，其峰值逐渐降低；溶解温度处于75-85℃之间的为同源性序列，随着筛选轮数增加，其峰值逐渐升高。在16轮时同源性序列峰值增加逐渐趋于平缓，与第一轮非同源性序列峰值相近，因此认为筛选进程可以终止以进行测序分析。
5.测序及序列分析
筛选结束后，分别将阿昔洛韦、吗啉双胍的第16轮PCR产物纯化送去上海生物技术公司进行高通量测序，分别得到60000条序列，利用进化树软件Mega7对前50条序列进行分析，利用Mfold在线生物信息学平台对二级结构进行分析和预测。根据序列出现次数及自由能及△G选择9条序列CIV1-CIV9作为候选适配体，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成5’端标记FAM的适配体，进行亲和性特异性分析。
6.适配体亲和力分析
本研究采用荧光偏振法和荧光法对FAM标记的适配体进行核酸适配体的结合分析。超声制备1mg/mL氧化石墨烯，置于4℃备用。
(1)GO荧光偏振法分析
适配体用BB缓冲液稀释为10、20、50、100、150和200nM一系列浓度，在95℃加热10分钟，然后冰冷却至室温，加入250μM靶标在37℃下震荡孵育1h。加入GO孵育30min，吸附ssDNA。将孵育后的溶液直接转移到96孔黑色壁黑底酶标板中，用SynergyH1多功能酶标仪测量各孔的荧光偏振值，G因子为0.95。以BB缓冲液代替靶标加入体系作为阴性对照，采用上述相同的实验步骤。实验组和阴性对照组均进行三次重复实验，并进行避光处理以保持实验中荧光偏振测量的稳定性。用GraphPadPrism7.0软件拟合归一化相对荧光偏振值(△FP)对不同适配体的非线性饱和结合曲线，并计算解离常数(Kd值)。其中△FP＝(FP0-FP)，FP为实验组的荧光偏振值，F0为阴性对照组的荧光偏振值。各适配体的解离常数Kd值如下表1所示。
表1
Figure BDA0002929985390000061
(2)GO荧光法分析
按照GO荧光偏振法，将适配体用BB缓冲液稀释成不同的浓度(10-200nM)，95℃热处理10min后，立即冰浴10min。加入GO震荡孵育20min，吸附ssDNA。加入25μM靶标孵育1h，孵育结束后在4℃条件下，13000rpm离心15min，吸取上清液至96孔黑色壁透明底酶标板中，用SynergyH1多功能酶标仪测量各孔的荧光强度，激发波长为485nm，发射波长为520nm。以BB缓冲液代替靶标加入体系作为阴性对照，采用上述相同的实验步骤，和实验组对比准确的测量加入靶标引起的荧光变化。实验组和阴性对照组均进行三次重复实验，并进行避光处理以保持实验中荧光测量的稳定性。用GraphPadPrism7.0软件拟合归一化相对荧光强度(△F)对适配体不同浓度的非线性饱和结合曲线，并计算解离常数(Kd值)。其中△F＝(F-F0)。F为实验组的荧光强度，F0为阴性对照组的荧光强度。各适配体的解离常数Kd值如下表2所示。
表2
Figure BDA0002929985390000071
7.特异性分析
选取与无环鸟苷类似物亲和力较强即Kd值较小的5条适配体进行特异性分析，序列分别为CIV1、CIV2、CIV4、CIV6、CIV8序列。
200nM适配体溶液吸取100μL，加入25mM反筛靶标孵育1h，加入最优比例的GO孵育30min，吸附ssDNA。孵育后的溶液用SynergyH1多功能酶标仪测量荧光偏振值，G因子为0.95。阴性对照为以BB缓冲液代替反筛靶标加入。
取200nM的适配体溶液100μL，加入GO震荡孵育20min，吸附ssDNA。分别加入25mM的反筛靶标，于37℃震荡孵育1h。孵育后采用上述相同的离心步骤分离，测其荧光强度。阴性对照为以BB缓冲液代替靶标加入体系。
综合考虑荧光偏振法和荧光法的结果(如图5所示)，认为CIV6适配体是针对无环鸟苷类似物的最适广谱性适配体。
因此通过SELEX技术筛选出的具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的寡核苷酸适配体CIV6具有高亲和性和高特异性，为无环鸟苷类似物快速、准确、灵敏检测提供重要基础，具有广泛的应用前景。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的核酸适配体
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgagcccaag ccctggtatg tgaaaacata ctagacgtgg ctatgtattt ttaaatcaat 60
ggcaggtcta ctttgggatc 80

Claims (3)

1.一种具有广谱性识别无环鸟苷类似物能力的寡核苷酸适配体，其特征在于，所述寡核苷酸适配体序列为5’-TGAGCCCAAGCCCTGGTATG-n-GGCAGGTCTACTTTGGGATC-3’，其中，n为TGAAAACATACTAGACGTGGCTATGTATTTTTAAATCAAT；
所述无环鸟苷类似物为阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦、泛昔洛韦或更昔洛韦。
2.一种检测无环鸟苷类似物的试剂盒，其特征在于，含权利要求1所述的寡核苷酸适配体，所述无环鸟苷类似物为阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦、泛昔洛韦或更昔洛韦。
3.权利要求1所述的寡核苷酸适配体在检测食品或兽药中的无环鸟苷类似物中的应用，其特征在于，所述无环鸟苷类似物为阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦、泛昔洛韦或更昔洛韦。
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