CN112831588A - 分子标记及其应用和鉴定无患子与川滇无患子种质的方法 - Google Patents
分子标记及其应用和鉴定无患子与川滇无患子种质的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112831588A CN112831588A CN202110219641.6A CN202110219641A CN112831588A CN 112831588 A CN112831588 A CN 112831588A CN 202110219641 A CN202110219641 A CN 202110219641A CN 112831588 A CN112831588 A CN 112831588A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sapindus
- soapberry
- germplasm
- molecular marker
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本发明公开一种分子标记及其应用和鉴定无患子与川滇无患子种质的方法，所述分子标记，包括引物Samuk07G0006800，Samuk02G0156900和/或Samuk01G0267400，用于鉴定无患子与川滇无患子种质；提取待测无患子或川滇无患子幼嫩叶片样品的DNA；根据SSR分子标记进行PCR扩增；毛细管电泳上机检测；对样品的原始数据进行分析，构建系统发育树；检测种质扩增产物结果判定其为无患子或川滇无患子。本发明基于基因测序仪建立的荧光标记SSR毛细管电泳检测法是荧光测序技术与SSR分子标记技术的有效结合，实现了对SSR分子标记扩增产物长度的高效和准确获取，能够区分2bp之内的差异片段，准确获得扩增产物长度，检测结果更为稳定、准确和高效。
Description
技术领域
本发明属于无患子种质鉴定领域，涉及用于鉴定无患子与川滇无患子种质的分子标记，以及该分子标记的应用，以及使用该分子标记鉴定无患子与川滇无患子种质的方法。
背景技术
无患子(Sapindus mukorossi Gaertn.)和川滇无患子(Sapindus delavayi(Franch.)Radlk.)是无患子科(Sapindaceae)无患子属(Sapindus L.)落叶乔木，在国外称肥皂果(Soapberry)，在国内也称洗手果、肥皂树、皮哨子等。无患子属在全世界共分布13个种，我国拥有4种1变种，广泛分布于我国东部、南部、西南部，为低山、丘陵及石灰岩山地常见树种，其中无患子与川滇无患子为我国无患子属的广布种。无患子与川滇无患子种仁含油率高达40％左右，油脂中油酸和亚油酸高达62.5％，C16～C20的脂肪酸占98.2％，符合现代生物质柴油各项标准，也可精炼为高档润滑油；果肉中含皂苷10～27％，是优良的天然洗涤化妆品原料，洗脱率超过90％；种壳可制作高级活性炭；国内外研究发现其种仁、果肉、根系中有极具开发潜力的抗癌、降脂、降压的功能性活性成分。因此，无患子与川滇无患子是我国集生物能源、生物化工和生物医药等于一体的多功能原料树种。
我国无患子与川滇无患子为无患子属近缘种，种质资源丰富，但表型性状相似且易受发育阶段、栽培措施及环境条件影响，仅从当代的表型难以区分，且无患子属植物遗传背景并不清晰，这给无患子属树种种质鉴定、杂交育种、新品种选育等带来了很大困难。因此本研究团队开展分子生物学SSR分子标记辅助鉴定无患子与川滇无患子种质资源，促进无患子与川滇无患子良种选育，加快种质资源的开发利用，保护无患子与川滇无患子种质资源多样性。
现有技术中还没有利用转录组测序的SSR分子标记鉴定无患子与川滇无患子种质相关的文献资料公开。
发明内容
鉴于此，本发明目的在于提供一种能够快速、准确地鉴定无患子与川滇无患子种质的分子标记。
本发明的另一目的是提供一种鉴定无患子与川滇无患子种质的分子标记的应用。
本发明的又一目的是提供一种鉴定无患子与川滇无患子种质的方法。
发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种分子标记，用于鉴定无患子与川滇无患子种质，所述分子标记为下列引物中的一对或多对序列：
Samuk07G0006800：
上游引物：5'-GAAGCCGGATCTAATGGGCA-3'；
下游引物：5'-TCACTCCAACAGCCTTGTCC-3'；
Samuk02G0156900：
上游引物：5'-TCAGCGTTGAAGAGCCACAG-3'；
下游引物：5'-AGTCTCTCAACGGTGCCATC-3'；
Samuk01G0267400：
上游引物：5'-CCAGTCTGAGGGCTGCATTT-3'；
下游引物：5'-AACAAGGGGGAGCTGTGATC-3'。
本发明还提供了一种前述分子标记的应用，用于鉴定无患子与川滇无患子种质，包括以下步骤：
1)提取待测无患子或川滇无患子幼嫩叶片样品的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据SSR分子标记进行PCR扩增；
3)毛细管电泳上机检测；
取步骤2)所得PCR产物0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测；
4)对样品的原始数据进行分析，获得不同样品扩增片段的长度；进一步分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与川滇无患子种质0/1矩阵，计算遗传距离，构建系统发育树；
5)根据检测种质扩增产物结果判定其为无患子或川滇无患子。
根据本发明分子标记的应用的一个实施方式，所述步骤2)中，SSR分子标记为下列引物中的一对或多对序列：
Samuk07G0006800：
上游引物：5'-GAAGCCGGATCTAATGGGCA-3'；
下游引物：5'-TCACTCCAACAGCCTTGTCC-3'；
Samuk02G0156900：
上游引物：5'-TCAGCGTTGAAGAGCCACAG-3'；
下游引物：5'-AGTCTCTCAACGGTGCCATC-3'；
Samuk01G0267400：
上游引物：5'-CCAGTCTGAGGGCTGCATTT-3'；
下游引物：5'-AACAAGGGGGAGCTGTGATC-3'。
根据本发明分子标记的应用的一个实施方式，所述步骤2)中，
所述PCR扩增采用20μL反应体系：包括10-50ng模板DNA 1-2μL，正、反向引物分别为0.2μL和0.2μL，睿博兴科2×Taq Plus PCR反应混合物10μL，及适量ddH2O；
PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度52℃复性30s，72℃延伸30s，95℃变性30s，退火温度50℃复性30s，72℃延伸30s，20次循环后72℃延伸10min；4℃存储。
根据本发明分子标记的应用的一个实施方式，所述步骤3)中，上机检测所用仪器为基
因分析仪ABI 3730XL DNA analyzer、毛细管ABI 96×50cm 4331246。
根据本发明分子标记的应用的一个实施方式，所述基因分析仪参数设置如下：
模块文件:GeneMapper50_POP7_1；
运行电压:15.0kv；
进样电压:1.6kv；
进样持续时间:15sec；
温度:63DegC；
电流稳定度:30.0uA
根据本发明分子标记的应用的一个实施方式，所述PCR反应混合物为MgCl2：3mM；dNTPs：0.4mM。
根据本发明分子标记的应用的一个实施方式，所述步骤4)具体为：对样品的原始数据用GeneMarker V2.2.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度；利用软件PopGen32分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与川滇无患子种质0/1矩阵，利用Nysts软件计算遗传距离，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树。
本发明还提供了基于前述分子标记鉴定无患子与川滇无患子种质的方法，步骤如下：
1)提取待测无患子或川滇无患子幼嫩叶片样品的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据所述分子标记进行PCR扩增；
所述PCR采用20μL反应体系：包括10-50ng模板DNA 1-2μL，正、反向引物分别为0.2μL和0.2μL，睿博兴科2×Taq Plus PCR反应混合物10μL，及适量ddH2O；所述反应混合物为MgCl2：3mM；dNTPs：0.4mM；
PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度52℃复性30s，72℃延伸30s，95℃变性30s，退火温度50℃复性30s，72℃延伸30s，20次循环后72℃延伸10min；4℃存储；
3)毛细管电泳上机检测；
取步骤2)PCR产物0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测；上机检测仪器：基因分析仪ABI3730XL DNA analyzer、毛细管ABI 96×50cm 4331246；
4)电泳结束后，对样品的原始数据用GeneMarker V2.2.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度。利用软件PopGen32分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与川滇无患子种质0/1矩阵，利用Nysts软件计算遗传距离，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树；
5)根据检测种质扩增产物结果判定其为无患子或川滇无患子。
根据本发明鉴定无患子与川滇无患子种质的方法的一个实施方式，所述步骤2)中，分子标记为下列引物中的一对或多对序列：
Samuk07G0006800：
上游引物：5'-GAAGCCGGATCTAATGGGCA-3'；
下游引物：5'-TCACTCCAACAGCCTTGTCC-3'；
Samuk02G0156900：
上游引物：5'-TCAGCGTTGAAGAGCCACAG-3'；
下游引物：5'-AGTCTCTCAACGGTGCCATC-3'；
Samuk01G0267400：
上游引物：5'-CCAGTCTGAGGGCTGCATTT-3'；
下游引物：5'-AACAAGGGGGAGCTGTGATC-3'。
与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
本发明与传统形态学、孢粉学及生化鉴定相比，本SSR特异性引物鉴定技术拥有非常明显的优势：
(1)鉴定准确，可以有效判定无患子与川滇无患子种质；
(2)在生长发育不同时期和组织都能检测到，几乎不受环境影响；
(3)检测方便，检测样品仅需种质的微量叶片或其他组织，检测成本极低；
(4)SSR分子标记等位变异高、共显性遗传、稳定性好、操作简便快速。
本发明基于基因测序仪建立的荧光标记SSR毛细管电泳检测法是荧光测序技术与SSR分子标记技术的有效结合，实现了对SSR分子标记扩增产物长度的高效和准确获取，能够区分2bp之内的差异片段，准确获得扩增产物长度，检测结果更为稳定、准确和高效。
附图说明
图1是无患子与川滇无患子种质在Samuk07G0006800引物扩增后电泳图。
图2是A组SSR引物构建系统发育树。
图3是B组SSR引物构建系统发育树。
具体实施方式
下面结合具体实施例进行说明。
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
实施例1
本实施例中，发明人经过大量的试验研究，筛选得到3对SSR特异性引物。在无患子与川滇无患子种质鉴定过程中，可以选择其中1对或2对或3对作为SSR分子标记。序列信息见序列表第1至6号序列或表1。
表1筛选得到的3对SSR特异性引物信息
实施例2
本实施例是基于实施例1所述SSR分子标记在无患子与川滇无患子种质鉴定方法中的应用。
利用转录组测序的SSR分子标记鉴定无患子与川滇无患子种质的步骤如下。
1)提取待测无患子或川滇无患子幼嫩叶片样品的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据SSR分子标记进行PCR扩增；
所述PCR采用20μL反应体系：包括10-50ng模板DNA 1-2μL，正、反向引物分别为0.2μL和0.2μL，睿博兴科2×Taq Plus PCR MasterMix(MgCl2：3mM；dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)：0.4mM)10μL，及适量ddH2O；
PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度52℃复性30s，72℃延伸30s，95℃变性30s，退火温度50℃复性30s，72℃延伸30s，20次循环后72℃延伸10min；4℃存储。
所述SSR标记引物选自实施例1所述3对SSR特异性引物中的1对、2对或3对。
3)毛细管电泳上机检测；
在步骤2)中，取PCR产物0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机(基因分析仪ABI 3730XL DNAanalyzer、毛细管ABI 96×50cm 4331246)检测，具体参数见下表：
表2基因分析仪参数设置
4)电泳结束后，对样品的原始数据用GeneMarker V2.2.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度。利用软件PopGen32分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与川滇无患子种质0/1矩阵，利用Nysts软件计算遗传距离，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树。
5)根据检测种质扩增产物结果判定其为无患子或川滇无患子。
实施例3
本实施例对利用实施例1所述SSR分子标记鉴定无患子或川滇无患子的方法进行进一步详细的描述，方法的具体步骤如下。
1)利用天根高效植物基因组DNA提取试剂盒(DP320-03)提取23份我国不同省份无患子与川滇无患子(表3)种质幼嫩叶片样品的DNA。
表3无患子与川滇无患子种质信息
本实施例中，设置两组SSR特异性引物对照。实验组A组为本发明实施例1所述3对SSR特异性引物，分别是S78、S29和S14(序列信息见序列表第1至6号序列或表1)，对照组B组是发明人在完成本发明过程中大量试验数据中随机摘选的其它3对SSR特异性引物，分别是S704、S73、S105(序列信息见序列表第7至12号序列或表4)，两组特异性SSR正、反向引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。
表4 B组SSR特异性引物信息
2)以步骤1)提取的DNA为模板，分别利用上述A、B两组SSR特异性引物进行PCR扩增，所用PCR仪型号为Bio-rad T100热循环PCR仪。
所述PCR体系采用20μL反应体系：包括10-50ng模板DNA 1-2μL，正、反向引物分别为0.2μL和0.2μL，睿博兴科2×Taq Plus PCR MasterMix(MgCl2：3mM；dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)：0.4mM)10μL，及适量ddH2O；
PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度52℃复性30s，72℃延伸30s，95℃变性30s，退火温度50℃复性30s，72℃延伸30s，20次循环后72℃延伸10min；4℃存储。
3)毛细管电泳上机检测；
在步骤2)中，取PCR产物0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机(基因分析仪ABI 3730XL DNAanalyzer、毛细管ABI 96×50cm 4331246)检测，具体参数见下表：
4)电泳结束后，分别对两组样品的原始数据用GeneMarker V2.2.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度。利用软件PopGen32分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与川滇无患子种质0/1矩阵，利用Nysts软件计算遗传距离，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树。
表5无患子与川滇无患子种质A组引物扩增产物长度
表6无患子与川滇无患子种质B组引物扩增产物长度
试验结果如表5和表6所示，无患子与川滇无患子种质在两组特异性SSR引物的扩增产物差异明显。A组中，川滇无患子种质ind7-9、17-23在S78特异性引物扩增下产物均为177bp和177bp，为纯合体；在S29特异性引物扩增下产物均为168bp和168bp，为纯合体；在S14特异性引物扩增下，川滇无患子种质间产物长度有所差距，但与无患子产物长度相差明显。B组中，3对SSR特异性引物扩增产物均有所差异，种质间差异明显，但无法有效鉴定无患子与川滇无患子种质。
根据各种质扩增产物长度换算为0/1矩阵，并在Nysts软件中计算遗传距离矩阵，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树。分析结果如图2、图3所示，A组(图2)3对SSR特异性引物系统发育树将无患子与川滇无患子种质分别分为两组，上面一组包含ind1、11、2、3、10、4、14、5、12、13、6、16、15种质，均为无患子，下面一组包含ind7、21、22、23、8、9、18、19、17、20种质，均为川滇无患子，利用3对SSR特异性引物可以完全鉴定无患子与川滇无患子。B组中(图3)3对SSR特异性引物构建系统发育树，但无法有效将无患子与川滇无患子种质鉴定开，无患子与川滇无患子种质混杂在一起，表明B组3对SSR引物无法有效鉴定无患子与川滇无患子种质。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京林业大学
福建源华林业生物科技有限公司
<120> 分子标记及其应用和鉴定无患子与川滇无患子种质的方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 1
gaagccggat ctaatgggca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 2
tcactccaac agccttgtcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 3
tcagcgttga agagccacag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 4
agtctctcaa cggtgccatc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 5
ccagtctgag ggctgcattt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 6
aacaaggggg agctgtgatc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 7
acaactggca agagatcgca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 8
cacacctcca tttggctcct 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 9
tttggcaggc ctgttgatca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 10
acgtgagcaa gaccgacttt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 11
ttcttccgat tgagcgccat 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(DNA)
<400> 12
cgaatccagt ggcagtagca 20
Claims (10)
1.一种分子标记，其特征在于，用于鉴定无患子与川滇无患子种质，所述分子标记为下列引物中的一对或多对序列：
Samuk07G0006800：
上游引物：5'-GAAGCCGGATCTAATGGGCA-3'；
下游引物：5'-TCACTCCAACAGCCTTGTCC-3'；
Samuk02G0156900：
上游引物：5'-TCAGCGTTGAAGAGCCACAG-3'；
下游引物：5'-AGTCTCTCAACGGTGCCATC-3'；
Samuk01G0267400：
上游引物：5'-CCAGTCTGAGGGCTGCATTT-3'；
下游引物：5'-AACAAGGGGGAGCTGTGATC-3'。
2.一种权利要求1所述的分子标记的应用，其特征在于，用于鉴定无患子与川滇无患子种质，包括以下步骤：
1)提取待测无患子或川滇无患子幼嫩叶片样品的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据SSR分子标记进行PCR扩增；
3)毛细管电泳上机检测；
取步骤2)所得PCR产物0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测；
4)对样品的原始数据进行分析，获得不同样品扩增片段的长度；进一步分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与川滇无患子种质0/1矩阵，计算遗传距离，构建系统发育树；
5)根据检测种质扩增产物结果判定其为无患子或川滇无患子。
3.根据权利要求2所述的鉴定无患子与川滇无患子种质的分子标记的应用，其特征在于，所述步骤2)中，分子标记为下列引物中的一对或多对序列：
Samuk07G0006800：
上游引物：5'-GAAGCCGGATCTAATGGGCA-3'；
下游引物：5'-TCACTCCAACAGCCTTGTCC-3'；
Samuk02G0156900：
上游引物：5'-TCAGCGTTGAAGAGCCACAG-3'；
下游引物：5'-AGTCTCTCAACGGTGCCATC-3'；
Samuk01G0267400：
上游引物：5'-CCAGTCTGAGGGCTGCATTT-3'；
下游引物：5'-AACAAGGGGGAGCTGTGATC-3'。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤2)中，
所述PCR扩增采用20μL反应体系：包括10-50ng模板DNA 1-2μL，正、反向引物分别为0.2μL和0.2μL，睿博兴科2×Taq Plus PCR反应混合物10μL，及适量ddH2O；
PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度52℃复性30s，72℃延伸30s，95℃变性30s，退火温度50℃复性30s，72℃延伸30s，20次循环后72℃延伸10min；4℃存储。
5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤3)中，上机检测所用仪器为基因分析仪ABI 3730XL DNA analyzer、毛细管ABI 96×50cm 4331246。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述基因分析仪参数设置如下：
模块文件:GeneMapper50_POP7_1；
运行电压:15.0kv；
进样电压:1.6kv；
进样持续时间:15sec；
温度:63DegC；
电流稳定度:30.0Ua。
7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述PCR反应混合物为MgCl2：3mM；dNTPs：0.4mM。
8.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述步骤4)具体为：对样品的原始数据用GeneMarker V2.2.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度；利用软件PopGen32分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与川滇无患子种质0/1矩阵，利用Nysts软件计算遗传距离，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树。
9.一种利用权利要求1所述分子标记鉴定无患子与川滇无患子种质的方法，其特征在于，步骤如下：
1)提取待测无患子或川滇无患子幼嫩叶片样品的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据所述分子标记进行PCR扩增；
所述PCR采用20μL反应体系：包括10-50ng模板DNA 1-2μL，正、反向引物分别为0.2μL和0.2μL，睿博兴科2×Taq Plus PCR反应混合物10μL，及适量ddH2O；所述反应混合物为MgCl2：3mM；dNTPs：0.4mM；
PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度52℃复性30s，72℃延伸30s，95℃变性30s，退火温度50℃复性30s，72℃延伸30s，20次循环后72℃延伸10min；4℃存储；
3)毛细管电泳上机检测；
取步骤2)PCR产物0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测；上机检测仪器：基因分析仪ABI3730XL DNA analyzer、毛细管ABI 96×50cm 4331246；
4)电泳结束后，对样品的原始数据用GeneMarker V2.2.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度。利用软件PopGen32分析数据，获得引物多态性，将每对引物获得的等位基因利用阿拉伯数字0/1开始赋值，建立无患子与川滇无患子种质0/1矩阵，利用Nysts软件计算遗传距离，利用Clustering模块SAHN功能构建系统发育树；
5)根据检测种质扩增产物结果判定其为无患子或川滇无患子。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述步骤2)中，分子标记为下列引物中的一对或多对序列：
Samuk07G0006800：
上游引物：5'-GAAGCCGGATCTAATGGGCA-3'；
下游引物：5'-TCACTCCAACAGCCTTGTCC-3'；
Samuk02G0156900：
上游引物：5'-TCAGCGTTGAAGAGCCACAG-3'；
下游引物：5'-AGTCTCTCAACGGTGCCATC-3'；
Samuk01G0267400：
上游引物：5'-CCAGTCTGAGGGCTGCATTT-3'；
下游引物：5'-AACAAGGGGGAGCTGTGATC-3'。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110219641.6A CN112831588B (zh) | 2021-02-26 | 2021-02-26 | 分子标记及其应用和鉴定无患子与川滇无患子种质的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110219641.6A CN112831588B (zh) | 2021-02-26 | 2021-02-26 | 分子标记及其应用和鉴定无患子与川滇无患子种质的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112831588A true CN112831588A (zh) | 2021-05-25 |
| CN112831588B CN112831588B (zh) | 2021-09-17 |
Family
ID=75933904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110219641.6A Active CN112831588B (zh) | 2021-02-26 | 2021-02-26 | 分子标记及其应用和鉴定无患子与川滇无患子种质的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112831588B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102174510A (zh) * | 2011-01-06 | 2011-09-07 | 广东省农业科学院果树研究所 | 利用est-ssr分子标记构建荔枝核心种质的方法 |
| CN106350591A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-01-25 | 北京林业大学 | 构建彩叶栾树品种指纹图谱的ssr引物、所构建的指纹图谱及其应用 |
| CN108913810A (zh) * | 2018-09-30 | 2018-11-30 | 福建省农业科学院果树研究所 | 一种鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的分子标记及方法 |
-
2021
- 2021-02-26 CN CN202110219641.6A patent/CN112831588B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102174510A (zh) * | 2011-01-06 | 2011-09-07 | 广东省农业科学院果树研究所 | 利用est-ssr分子标记构建荔枝核心种质的方法 |
| CN106350591A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-01-25 | 北京林业大学 | 构建彩叶栾树品种指纹图谱的ssr引物、所构建的指纹图谱及其应用 |
| CN108913810A (zh) * | 2018-09-30 | 2018-11-30 | 福建省农业科学院果树研究所 | 一种鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的分子标记及方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CAOWEN SUN等: "Genetic diversity and association analyses of fruit traits with microsatellite ISSRs in Sapindus", 《J. FOR. RES.》 * |
| 洪莉等: "无患子种质资源多样性与亲缘关系的ISSR和SRAP分析", 《浙江农业科学》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112831588B (zh) | 2021-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210207226A1 (en) | Dna barcoding-based method for rapid identification of lycium chinensis | |
| CN108998547B (zh) | 一种用于圆口铜鱼亲子鉴定的微卫星标记方法 | |
| CN110592251B (zh) | 一个甘蓝型油菜开花期性状的主效qtl位点、snp分子标记开发及应用 | |
| CN103667275A (zh) | 油茶ssr分子标记 | |
| CN101684481A (zh) | 丹参est-ssr分子标记的制备方法、特异引物及其应用 | |
| CN108660246A (zh) | 一组马家柚InDel分子标记及其在柑橘品种种苗早期区分粗皮马家柚中的应用 | |
| CN107164476A (zh) | 一种利用issr反应体系分析草果遗传多样性的方法 | |
| CN105838785B (zh) | 与芝麻黑色种皮基因紧密连锁的ssr分子标记及应用 | |
| CN110358854B (zh) | 一个甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效qtl位点、snp分子标记开发及应用 | |
| CN108754018B (zh) | 一种刺五加目的基因ssr分子标记的筛选方法及应用 | |
| CN103243167A (zh) | 与绵羊羊毛纤维直径相关的分子标记及其应用 | |
| CN104762403B (zh) | 与大豆油脂含量显著关联的GmDGK7基因分子标记及其应用 | |
| CN112831588B (zh) | 分子标记及其应用和鉴定无患子与川滇无患子种质的方法 | |
| CN110724760B (zh) | 香樟核基因组ssr分子标记的多态性引物及其应用 | |
| CN109988863B (zh) | 用于区分不同生态型丁香的est-ssr标记及所用引物 | |
| CN107475413A (zh) | 一种筛选提高不饱和脂肪酸c20:3ω6含量长牡蛎的方法相关的snp的引物对 | |
| CN112831587B (zh) | 分子标记及其应用和鉴定无患子与毛瓣无患子种质的方法 | |
| CN107164367A (zh) | 一种高通量桃叶片基因组dna的提取方法 | |
| CN108517373A (zh) | 一个用于区分五个辣椒栽培种的InDel标记引物对及其应用 | |
| CN114752702A (zh) | 一种与油菜钙含量性状QTL紧密连锁的分子标记BnCa-2C2及其应用 | |
| CN106636327B (zh) | 一种红麻微卫星dna标记指纹图谱及其应用 | |
| Li et al. | Confirmation of natural hybrids between Gentiana straminea and G. siphonantha (Gentianaceae) based on molecular evidence | |
| CN111733272A (zh) | 来源于枸杞叶绿体的dna条形码及其鉴定枸杞种属的方法 | |
| CN111876477A (zh) | 鉴定全缘冬青种植物性别性状的分子标记引物组合及其应用 | |
| Zhu et al. | Morphological, palynological and transcriptomic-based SSR assessment of peony varieties adaptive in the Jiangnan region |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |