CN112831323A - 蜡样芽孢杆菌B-28在修复重金属Cr污染环境方面的应用 - Google Patents

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CN112831323A CN202110014957.1A CN202110014957A CN112831323A CN 112831323 A CN112831323 A CN 112831323A CN 202110014957 A CN202110014957 A CN 202110014957A CN 112831323 A CN112831323 A CN 112831323A
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范瀚允
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Abstract

本发明提供了蜡样芽孢杆菌B‑28在修复重金属Cr污染环境方面的应用，对植物接种B‑28菌株能显著降低植物根际硝酸铵提取态Cr和DTPA提取态Cr的含量，并显著降低植物各组织中的Cr含量，促进植物叶片中叶绿素含量增加以及根部CAT和POD酶活性增强，显著提升植物各组织的生物量，提供了一种植物‑微生物联合钝化Cr以促进植物生长的新方案。

Description

蜡样芽孢杆菌B-28在修复重金属Cr污染环境方面的应用
技术领域
本发明涉及重金属污染生物修复技术领域，更具体地，涉及蜡样芽孢杆菌B-28在修复重金属Cr污染环境方面的应用。
背景技术
铬(Cr)由于其高迁移率及高生物毒性的特点，对我国农田土壤造成持续污染，并严重威胁农产品安全。在众多土壤铬污染处理技术中，植物-微生物联合钝化技术作为一个颇具前景的方向，是指通过植物根系吸收吸附，根系分泌物络合等方式减少和稳定化土壤中的重金属，同时接种微生物既能辅助钝化土壤中的重金属，还能增强植物对重金属的耐受性，而植物释放的根系分泌物能为微生物的生长提供良好的营养物质。植物-微生物联合钝化技术被证实可以有效减少土壤中铅、砷、镉、铬、铜和锌的迁移率，减轻污染场地的生态风险。
中国发明专利CN105925507B提供了一种具有重金属钝化和促进植物生长功能的蜡样芽孢杆菌B19，此菌株可高效分解难溶性磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝以及重金属为镉，但是具有钝化重金属Cr和促进植物生长功能的蜡样芽孢杆菌未见报道。
发明内容
本发明旨在提供蜡样芽孢杆菌B-28在修复重金属Cr污染环境方面的应用，本发明前期从玉米根际土壤中分离得到的一株蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)B-28，该菌株已于2020年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCCNO：61089，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该蜡样芽孢杆菌B-28可显著降低植物根际硝酸铵提取态Cr和DTPA提取态Cr的含量，并显著降低植物各组织中的Cr含量。
本发明的首要目的是提供蜡样芽孢杆菌B-28在修复重金属Cr污染环境方面的应用。
本发明的另一目的是提供蜡样芽孢杆菌B-28在阻控植物对重金属Cr吸收中的应用。
本发明的另一目的是提供蜡样芽孢杆菌B-28在钝化重金属Cr方面的应用。
本发明的另一目的是提供一种阻控植物对重金属Cr吸收的方法。
本发明的再一目的是提供一种修复重金属Cr污染的微生物制剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了蜡样芽孢杆菌B-28的进一步应用，本发明将有绿色荧光蛋白基因的质粒PNW33成功转导入菌株B-28中，并在菌株体内稳定表达，将转导后的菌株接种到植物根际土，结果表明菌株B-28均能在植物根际稳定定殖。通过砂培实验、土培实验以及摇瓶实验，发现该菌株能够通过官能团络合或吸附Cr从而降低水溶态Cr浓度，显著地降低Cr生物有效性，使得玉米对Cr吸收减少，玉米各组织中Cr含量均明显下降；同时，该菌株能显著促进玉米叶片叶绿素含量的增加和根部CAT和POD酶活性的增强，从而促进玉米各组织生物量的增长；因此，该菌株在修复重金属Cr污染土壤、阻控植物对重金属Cr吸收和促进植物生长方面具有非常广阔的应用前景。
因此，以下应用均在本发明保护范围内：
蜡样芽孢杆菌B-28在修复重金属Cr污染环境方面的应用。
蜡样芽孢杆菌B-28在阻控植物对重金属Cr吸收中的应用。
蜡样芽孢杆菌B-28在钝化重金属Cr方面的应用。
所述修复重金属Cr污染为钝化重金属Cr；所述阻控植物对重金属Cr吸收为钝化重金属Cr以阻控植物对重金属Cr的吸收。
此外，本发明还提供一种阻控植物对重金属Cr吸收的方法，是在植物根际接种蜡样芽孢杆菌B-28和/或其菌液。
优选地，所述植物为移苗14～16天后的植物。
最优选地，所述植物为移苗15天后的植物。
优选地，所述接种频次为每隔7～60天接种一次。
最优选地，所述接种频次为每隔7天接种一次。
优选地，所述植物为玉米。
本发明还提供一种修复重金属Cr污染的微生物制剂，所述微生物制剂包括蜡样芽孢杆菌B-28和/或其菌液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了蜡样芽孢杆菌B-28在修复重金属Cr污染方面的新应用，接种B-28菌株能显著降低植物根际硝酸铵提取态Cr和DTPA提取态Cr的含量，并显著降低植物各组织中的Cr含量，促进植物叶片叶绿素含量的增加和根部CAT和POD酶活性的增强，显著提升植物各组织的生物量，提供了一种植物-微生物联合钝化Cr以促进植物生长的新方案。
附图说明
图1为pNW33N质粒载体图谱。
图2为菌株B-28的GFP标记结果，其中b和c为GFP标记的B-28菌株，d和e为无GFP标记的B-28菌株。
图3是GFP标记的B-28菌株在玉米根部的定殖情况。
图4是土培实验不同条件下玉米组织Cr含量。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
供试材料
(1)供试菌株及质粒
供试菌株为本发明的发明人前期从玉米根际土壤中分离得到的一株蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)B-28，该菌株已于2020年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCCNO：61089，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
含有pIM1773-PRHIII-sfGFP-pNW33N质粒(pNW33N)的大肠杆菌E.coliDH5α购买自addgene质粒平台，pNW33N质粒图谱如图1所示，其具有氯霉素抗性基因及绿色荧光蛋白基因。
菌落PCR反应引物：
F：5′-CCCGGGTGATTCTAATGAAGAAAGCAGACAAGTAAGCC-3′，
R：5′-CCCGGGATTTCGAATCGTGCCAGCCCTTCAAACTTCCCA-3′。
(2)培养基、缓冲液和抗生素
LB肉汤培养基：10gNaCl，10g胰蛋白、5g酵母提取物和1LH2O，pH7.2。
LBS培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母提取粉、10gNaCl，91.1g山梨糖醇和1LH2O，pH7.2。
LB琼脂培养基：10gNaCl，10g胰蛋白、5g酵母提取物和20g琼脂，pH7.2。电击缓冲液：250mM蔗糖，1mMMgCl2.6H2O，1mMHEPE缓冲液，10％甘油，pH7.0。氯霉素(Cm，50mgmL-1，Solarbio)，工作浓度5μgmL-1。
(3)盆栽实验及供试土壤及理化性质
盆栽实验使用的土壤采集自广东韶关市某Cr污染的农田土壤。采集的新鲜土壤剔除较大石块后自然干，过0.2mm筛并充分混匀备用。土壤总铬浓度为2.33mgkg-1，超过国家农用地土壤风险管控标准(0.3mgkg-1)7.8倍；有效态(DTPA提取)Cr浓度为0.358mgkg-1；硝酸铵提取态Cr浓度为38.6μgkg-1。土壤pH值5.98，速效K(CH3COONH4提取)浓度为118mgkg-1，速效P浓度(NaHCO3提取)为35.7mgkg-1，有机质含量为33.2gkg-1，阳离子交换量(CEC)为19.5cmol+kg-1。将混匀后的土壤于灭菌锅中灭菌(121℃，2h)以消除土壤中的微生物，即为灭菌土壤。
实施例1供试菌株的绿色荧光蛋白基因转导
1、实验方法
(1)质粒DNA提取和质粒脱盐
采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)从含有pNW33质粒的大肠杆菌中提取pNW33质粒，质粒提取的步骤参照试剂盒说明书。
0.1mol-1葡萄糖和1％琼脂糖在水中融化取1mL至1.5mL微量离心管中，然后将一个0.5mL微量离心管插入1.5mL微量离心管中。固化后，取出0.5mL微量离心管，然后将质粒DNA样品转移到脱盐锥中，在冰上脱盐2h。最后，收集质粒DNA采用超微量紫外-可见光分光光度计(ThermoFisherNanoDropOne)测定质粒DNA浓度并保存在4℃。
(2)菌株B-28感受态制备及质粒转化
本研究采用高渗透压电穿孔方法进行菌株的质粒转化。菌株的感受态制备具体步骤为：将B-28菌株接种至灭菌的100mL LB培养基中，置于恒温震荡培养箱中过夜培养(180rpm、30℃)后取出，接种1mL菌液至100mLLBS培养基中，震荡培养至OD600＝0.5后加入3％甘露醇作为弱壁剂，并继续震荡培养1h。
将菌液转移至50mL离心管中，将离心管插入碎冰中放置10min，然后于4℃离心机中，3000g离心10min，随后用40mL电击缓冲液(使用前需预冷)洗涤菌体沉淀4次，最后用1mL的电极缓冲液重悬菌体并分装100μL至1.5mL微量离心管中，得到感受态细胞备用。将100μL感受态细胞与1ug质粒DNA轻轻吹吸混匀，然后轻轻转移至预冷的2mm电击杯中，在电击仪(Bio-RadGenePulserXcell)中以25μF电容、200Ω电阻、2.5kV电压下电击，然后立即加入1mL无氯霉素的LBS培养基中，随后30℃、180rpm培养2h后取出，均匀涂布在含Cm的LB平板培养基中，将平板在30℃过夜培养，通过荧光显微镜寻找发光的菌落进行验证。
(3)菌株的转化结果验证
将转化后的菌落进行菌落PCR验证质粒转化结果。菌落PCR扩增体系包括：12.5μLPrimeSTARMaxPremix2×，1μLprimerF，1μLprimerR，1μLDNA模板，9.4μLddH2O。PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环35次，72℃后延伸10min。扩增完成后采用凝胶电泳实验检测条带长度。
2、实验结果
质粒转后的菌落PCR结果如图2(a)，由图可知，转化后的菌株大约在800bp处出现目的条带，而未转化的菌株则无目的条带，这表明pNW33N质粒已经成功转导至B-28菌株中。图2(b和c)为GFP标记的B-28菌株，图2(d和e)为无GFP标记的B-28菌株。由图可知，在蓝光的照射下，B-28菌落发出明显的绿色荧光，并且菌落形态与未转导菌株一致。实验结果表明，具有GFP基因的pNW33N质粒已经成功转导至B-28菌株中，并能在菌株中稳定表达。
实施例2菌株B-28在玉米根部定殖状况测定
1、实验方法
本研究通过土壤盆栽试验，研究在不同接菌频率下，菌株在玉米根部的定殖情况及其对玉米生长和Cr吸收的影响。所述接菌为接种实施例1转导pNW33N质粒的B-28菌株。
(1)土壤盆栽实验设计
土壤盆栽试验共8个处理，分别为：M0(不接菌，灭菌土壤种植)；M1(7天接菌一次；灭菌土壤种植)；M2(每30天接菌一次；灭菌土壤种植)；M3(60天接菌一次；灭菌土壤种植)；Y0(不接菌，不灭菌土壤种植)；Y1(7天接菌一次；不灭菌土壤种植)；Y2(每30天接菌一次；不灭菌土壤种植)；Y3(60天接菌一次；不灭菌土壤种植)。各处理4个平行，共32盆；每盆4kg土壤，种植玉米前分别添加0.44g尿素和0.88g磷酸二氢钾，随后稳定7天。试验于温室进行，试验期间白天平均气温为35℃，湿度45％，夜间气温为25℃，湿度60％。
玉米种子使用前用10％H2O2消毒0.5h，然后用无菌水清洗种子2次，并浸泡24h以促进种子发芽。浸泡后的玉米种子播种于铺满湿润石英砂的育苗板中，盖上吸水纸，保持黑暗环境以保证种子萌发。待玉米种子长出两片绿叶后选取长势相同的玉米苗移植至盆中，移苗5d后使每盆剩余3株长势均匀的幼苗。育苗及砂培盆栽实验均于植物人工气候培养箱中进行，湿度设置为65％，日间时长14h，温度为30℃，光照强度为20000lux；夜间时长10h，温度为25℃，无光照。每天浇50mL 30％霍格兰营养液。移苗15天后开始接菌处理，将菌液以每株10ml的量接种至玉米根际周围。试验期间M1和Y1处理分别共接菌8次，M2和Y2处理分别共接菌2次，M3和Y3处理分别共接菌1次。
(2)菌株定殖状况测定
为了观察GFP标记的B-28菌株在玉米根部的定殖情况，先将收获的新鲜根系用无菌水洗净，采用激光共聚焦显微镜(LSM880BasicOperation)在激发光450-480nm下观察根表面B-28菌株产生的绿色荧光，而根的自发浅色荧光可明显与绿色荧光区分。
以上结果表明：将有绿色荧光蛋白基因的质粒PNW33成功转导入菌株B-28中，并在菌株体内稳定表达。盆栽实验发现，各处理下菌株B-28均能在玉米根际稳定定殖。在接菌频率最高的M1(7天接菌一次；灭菌土壤)和Y1(7天接菌一次；不灭菌土壤)处理中，菌株的定殖数量最多。
2、实验结果
由图3可知，未接种B-28菌株的M0和Y0处理组中，玉米根部表面均未观察到绿色荧光菌落，而在不同接种频率处理中，玉米根部表面均能观察到B-28菌落发出的绿色荧光。其中M1和Y1处理组均接种B-28菌株8次，最后一次接种时间为玉米收获7天前，因此在根表面的绿色荧光菌落较多，这表明玉米根部能够吸引菌株B-28在根部表面定殖。M3和Y3处理的最后一次接菌时间为玉米收获60天前，其根部表面绿色菌落少于M1及Y1处理，这表明菌株B-28在玉米根部定殖数量少于M1和Y1处理，但是能在玉米根部表面稳定定殖。
实施例3接菌对玉米叶绿素含量及抗氧化酶活性的影响
1、栽培和接种方法同实施例2中的土壤盆栽实验设计方法。
2、实验结果
土壤盆栽实验下，不同处理对玉米叶片叶绿素含量及根部抗氧化酶活性的影响结果如表1。其中M0、M1、M2和M3分别表示灭菌土处理中，不接菌、每7天接菌、每30天接菌和每60天接菌处理。Y0、Y1、Y2和Y3分别表示不灭菌土处理中，不接菌、每7天接菌、每30天接菌和每60天接菌处理。
表1土培实验玉米叶片叶绿素含量及根部抗氧化酶活性
Figure BDA0002886432100000071
不同大写字母表示灭菌或不灭菌土壤下，不同接菌频率具有显著差异(p<0.05，T-test)，不同小写字母表示相同接菌频率下，灭菌和不灭菌土壤处理具有显著差异(p<0.05，Duncan's test，n＝4)。
从表1可以看到，相比不接菌处理，不同频率的接种处理均能不同程度地提高玉米叶片叶绿素a/b、总叶绿素的含量和根部POD酶活性。
灭菌土处理组中，与不接菌处理对比，不同频率接菌能显著提高玉米叶片叶绿素a含量12.5～36.7％，叶绿素b含量12.8～25.5％，POD酶和CAT酶活性也不同程度地提高。
不灭菌土处理中，与不接菌处理对比，不同频率接菌能显著提高玉米叶片叶绿素a含量26.9～88.2％，叶绿素b含量18.8～72.1％，抗氧化酶的活性相应增高。其中每7天接菌处理组M1和Y1的叶绿素a含量分别增加36.7％和87.3％；叶绿素b含量分别增长25.5％和61.8％；CAT酶活性增加了83.6％和95.5％；POD酶活性分别增长35.2％和38.3％。
总体而言，接种B-28菌能显著提高玉米叶片叶绿素a和叶绿素b的含量，以及促进玉米根部CAT和POD酶活性的增强，从而促进玉米各组织生物量的增长。
实施例4接菌对玉米生物量的影响
1、栽培和接种方法同实施例2中的土壤盆栽实验设计方法
待玉米生长95天后进行收获。在收获时先测量玉米植株的高度，抖动玉米根系，从而将根际砂分离，用去离子水洗净并于0.5mMCaCl2中浸泡0.5h以去除玉米根表附着的Cr，用吸水纸擦拭表面以去除根表附着的水分。玉米组织分为根、茎、叶、玉米粒和玉米穗轴分别称取鲜重，并各保留部分新鲜样品立即用液氮猝灭保存于-80℃冰箱(海尔DW-86L626)，用于植物酶活性及叶绿素测定，将剩余的组织样品装入信封并置于恒温烘箱中105℃杀青0.5h，随后80℃烘干至恒重。将分离得到的根际砂自然风干后保存，用于测定根际砂水溶态Cr浓度。
2、实验结果
不同处理下，玉米各组织生物量和株高如表2所示。其中M0、M1、M2和M3分别表示灭菌土处理中，不接菌、每7天接菌、每30天接菌和每60天接菌处理。Y0、Y1、Y2和Y3分别表示不灭菌土处理中，不接菌、每7天接菌、每30天接菌和每60天接菌处理。
表2土培实验玉米各组织鲜重及株高
Figure BDA0002886432100000081
不同大写字母表示灭菌或不灭菌土壤下，不同接菌频率具有显著差异(p<0.05，T-test)，不同小写字母表示相同接菌频率下，灭菌和不灭菌土壤处理具有显著差异(p<0.05，Duncan's test，n＝4)。
从表2可以看出，在灭菌土和不灭菌土处理中，与不接菌相比，接种菌株B-28均能显著促进玉米叶和玉米粒生物量不同程度增加，增长幅度分别为：叶10.4～22.2％和玉米粒14.5～31.6％，其中M1和Y1处理中，玉米粒的生物量增幅最大分别为25.2％和31.6％，说明在灭菌土和不灭菌土处理下，每7天接菌处理均更有利于玉米粒生物量的增长。在灭菌和不灭菌土壤处理中，玉米根、茎和玉米穗轴的生物量在接种处理中也不同程度增加。
在土壤盆栽实验中，与不接菌处理相比，接种B-28菌株能显著提升叶和玉米粒的生物量，其他玉米组织也有不同程度地增长。
实施例5不同处理对土壤理化性质及Cr形态的影响
1、实验方法
栽培和接种方法同实施例2中的土壤盆栽实验设计方法。
将自然风干的根际土壤研磨至全部通过2mm孔径筛，参照国标GBT23739-2009方法测定有效态Cr，具体方法为：称取5.00g过筛土壤于锥形瓶中，加入25mLDTPA提取剂，在室温条件下180rpm震荡2h后，随后取出离心，最后将上清液过0.45μm滤膜后保存待测。根际土硝酸铵提取态Cr测定：称取5.00g过筛土壤于锥形瓶中，加入25mL1MNH4NO3溶液，于室温条件(25℃)下180rpm水平震荡2h后取出，离心取上清液过0.45μm滤膜后保存待测。
玉米根际土壤的pH值的测定参考国标NY/T1377-2007。称取10g过2mm筛的土样于50mL离心管中，加入25mL煮沸冷却的去离子水，震荡5min，然后室温静置2h，最后采用pH(梅特勒-托利多FE28-Standard)计测定上清液pH值。
2、实验结果
在不同处理下，玉米根际土壤的硝酸铵提取态Cr和DTPA提取态Cr含量如表3所示。其中注：M0、M1、M2和M3分别表示灭菌土处理中，不接菌、每7天接菌、每30天接菌和每60天接菌处理。Y0、Y1、Y2和Y3分别表示不灭菌土处理中，不接菌、每7天接菌、每30天接菌和每60天接菌处理。
表3玉米根际土壤DTPA提取态、NH4NO3提取态Cr、有机质和pH值
Figure BDA0002886432100000091
Figure BDA0002886432100000101
不同大写字母表示灭菌或不灭菌土壤下，不同接菌频率具有显著差异(p<0.05，T-test)，不同小写字母表示相同接菌频率下，灭菌和不灭菌土壤处理具有显著差异(p<0.05，Duncan's test，n＝4)。
从表3可以看出，在灭菌土壤处理中，与未接菌M0处理相比，接种B-28菌株处理下玉米根际土硝酸铵提取态Cr降低7.8～18.5％，此外DTPA提取态Cr的含量下降也8.4～11.9％。其中M1处理降幅最大，分别为18.5％和11.9％。
在不灭菌土壤处理中，与对照Y0相比，不同频率接菌处理的玉米根际土壤硝酸铵提取态Cr降低16.8～22.5％，DTPA提取态Cr降低3.4～11.8％，并且均在Y1处理具有最大降幅。
综上结果，接种B-28菌株能不同程度地降低玉米根际土壤硝酸铵提取态Cr和DTPA提取态Cr的含量，从而阻控了玉米对Cr的累积。此外，在灭菌和不灭菌处理中，每7天接菌一次处理下的NH4NO3提取态Cr和DTPA提取态Cr均具有最大降幅，这表明增加接菌频率能有效促进土壤中植物有效态Cr的钝化。在不同处理中，M1和Y1处理组的土壤有机质含量高于未接菌处理，分别升高25.6％和23.2％，而其他频率接菌处理中的有机质含量无与不接菌处理无显著差异。灭菌土壤处理中，接种B-28菌株及其接菌频率均对土壤的pH值无显著影响。但相同接种频率处理下，灭菌土壤的pH值会更高，例如M0和M3处理组土壤的pH值为6.52和6.50，而Y0和Y3处理组的土壤pH值为6.36和6.33。实施例6不同处理对玉米吸收Cr的影响
1、实验方法
栽培和接种方法同实施例2中的土壤盆栽实验设计方法。
玉米根茎叶、玉米粒和玉米穗轴的Cr浓度测试方法：
待玉米生长25天后进行收获，采用抖根法小心将玉米幼苗与根际砂分离，玉米根用去离子水冲洗干净后用0.5mM CaCl2溶液浸泡30min以去除玉米根表面吸附的Cr，然后再次用去离子洗净并用吸水纸吸干表面水分，最后将玉米根和茎叶、玉米粒、穗轴分离，分别称取每盆根和茎叶的鲜重后放置于恒温烘箱中105℃杀青30min，随后80℃烘干至重量恒定。分别称取每盆玉米根和茎叶、玉米粒、穗轴的总干重，用不锈钢研磨机研磨至粒径<0.25mm后保存备用。分别称取烘干研磨后的玉米根和茎叶、玉米粒、穗轴样品0.1g，加入8mL浓硝酸(GR浓度68％)，于微波消解仪(CEM MARS6 240/50)中消解。同时消解灌木枝叶GBW077602(GSV-1)作为标准品和空白样品以作为整个消解过程的质量控制。消解后赶酸、定容并采用石墨炉原子吸收分光光度仪(PerkinElmer 900T)测定消解液中Cr含量。
2、实验结果
土壤盆栽实验中各处理中，玉米根茎叶的Cr浓度的结果如图4(a)。在灭菌土处理中，接种B-28菌株处理与不接菌对比，根部Cr含量下降21.3～48.8％、茎Cr含量下降33.2～48.2％，叶片Cr含量下降13.1～46.6％。在M1处理组中，根部Cr含量下降48.8％，茎和叶分别下降48.2和46.6％，下降比例均为最大，这表明更高的接菌频率更有利于降低玉米根部的Cr吸收，但玉米茎和叶的Cr含量不受接菌频率的影响。
在不灭菌土壤处理中，与Y0(不接菌)相比，不同频率B-28菌株接种频率(Y1、Y2和Y3)下，根Cr含量下降21.0～34.9％、茎Cr含量下降31.2～40.7％、叶Cr含量下降31.1～34.8％。此外，接菌频率不会引起对根，茎和叶的Cr含量出现显著变化。
不同处理下玉米粒和玉米穗轴的Cr含量如图4(B)。灭菌土处理中，与不接菌处理(M0)相比，不同的接菌频率均能显著降低玉米粒和玉米穗轴的Cr含量，降幅分别为17.4～38.6％和17.8～40.3％。其中玉米粒(可食用部分)的Cr含量从M0处理的0.114mgkg-1降低至M1处理的0.070mgkg-1，降幅最大为38.6％。
不灭菌土处理中，接种B-28菌株处理下玉米粒和玉米穗轴的Cr含量分别显著降低20.5～34.0％和8.5～36.4％。其中作为可食用部位的玉米粒从Y0处理的0.112mgkg-1降低至Y1处理的0.074mgkg-1，显著降低34.0％。
综上结果，在灭菌或不灭菌土壤处理中，增加B-28菌株的接菌频率有利于玉米粒Cr含量的降低，此外接种B-28菌株后，玉米粒的Cr含量符合国际食品中污染物标准。
在本实验中，不同接菌频率处理均能显著降低玉米组织的Cr含量。在不同的接菌频率中，每7天接菌处理(M1和Y1)下各玉米组织Cr降低幅度总体上高于每30天接菌处理(M2和Y2)及每60天接菌处理(M3和Y3)，这表明增加接菌次数有利于降低玉米对Cr的吸收。同时，在灭菌土壤处理组中B-28菌株阻控玉米Cr吸收的能力优于未灭菌土壤，这表明菌株在根际土壤的竞争能力弱于土著微生物。
结果表明，B-28菌株阻控玉米吸收土壤Cr的的主要机制为：菌株能有效地定殖于玉米根部，并通过菌株细胞壁和胞外聚合物中的磷酸基团、羟基和酰胺基团络合Cr，从而降低根际土壤中硝酸铵提取态Cr和DTPA提取态Cr浓度。土壤中有效性Cr的浓度降低，玉米对Cr的累积也随之下降，向地上部转运的Cr也相应减少。因此，将菌株B-28大量接种于玉米根系中，是降低玉米Cr积累的有效途径。
在灭菌土处理中，与不接菌处理(M0)相比，接种B-28菌株能显著降低玉米根际硝酸铵提取态Cr和DTPA提取态Cr的含量，而在不灭菌土处理中，与不接菌处理(Y0)相比，硝酸铵提取态Cr和DTPA提取态Cr的含量也显著降低。
土壤盆栽实验各处理中，与不接菌相比，不同接菌频率均能显著降低玉米粒和玉米穗轴的Cr含量，接种菌株B-28的各处理中，玉米粒Cr含量均达到国家食品污染物限量标准。同时随着接种频率的增加，玉米粒中Cr含量具有逐渐降低的趋势。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.蜡样芽孢杆菌B-28在修复重金属Cr污染环境方面的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述修复重金属Cr污染为钝化重金属Cr。
3.蜡样芽孢杆菌B-28在阻控植物对重金属Cr吸收中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述阻控植物对重金属Cr吸收为钝化重金属Cr以阻控植物对重金属Cr的吸收。
5.蜡样芽孢杆菌B-28在钝化重金属Cr方面的应用。
6.一种阻控植物对重金属Cr吸收的方法，其特征在于，在植物根际接种蜡样芽孢杆菌B-28和/或其菌液。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述植物为移苗14～16天后的植物。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述接种频次为每隔7～60天接种一次。
9.根据权利要求6～8任一所述方法，其特征在于，所述植物为玉米。
10.一种修复重金属Cr污染的微生物制剂，其特征在于，包括蜡样芽孢杆菌B-28和/或其菌液。
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CN114573115A (zh) * 2021-08-14 2022-06-03 盐城工学院 蜡样芽孢杆菌fnxj1-2-3在去除废水中六价铬的应用

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