CN112812197A - 一种兰州百合多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兰州百合多糖及其制备方法和应用。本发明从兰州百合中分离纯化得到多糖LP80‑1，该多糖未被报道过，并对其分子量、单糖组成、化学结构等进行了分析鉴定，确定了其重均分子量和结构组成。细胞实验表明，该多糖具有显著的抗乳腺癌和肝癌活性，因此，该多糖具有开发成抗乳腺癌和肝癌药物的前景。

Description

一种兰州百合多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化学领域，涉及多糖及其制备方法和应用，具体涉及一种兰州百合多糖及其制备方法和应用。

背景技术

百合作为一味常见的中药，其性平味甘微苦，无毒，入心，肺二经。传统中医认为百合具有宁心安神、美容养颜、防癌抗癌等功效，用于阴虚燥咳，劳嗽咳血，虚烦惊悸，失眠多梦，精神恍惚。百合中除去含有对人体有益的丰富的蛋白质、磷脂、氨基酸、维生素和微量元素等营养物质外，还含有百合多糖、甾体皂苷、生物碱等多种生物活性成分。

多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，广泛存在于动物、植物和微生物中。多糖结构极其复杂，分为一级结构和高级结构，多糖一级结构主要包括重均分子量、单糖组成的种类和比例、连接位点、连接顺序，糖苷键的构型，是否有特殊基团，如乙酰基、硫酸基等，以及它们的连接位置等。近年来研究表明，天然多糖具有多种生物活性，如抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗骨质疏松、降血糖等，并且其具有无毒、可降解、生物相容的特点，因此受到科研人员越来越多的关注。

兰州百合(Lilium davidii var.unicolor Cotton)是百合科百合属川百合的一个变种，主要分布在兰州甘肃、平凉、天水等地区，其鳞茎在中国乃至整个亚洲地区被人们誉为“唯一的甜百合”，被用作食品已有数百年历史，最早载于《神农本草经》。兰州百合多糖具有提高免疫力、耐疲劳、降血糖、润肺止咳等功效，具有极高的药用价值。

目前，已有一些兰州百合多糖的报道，但是没有本发明多糖的报道，特提出本发明申请。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兰州百合多糖及其制备方法和应用。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

一种兰州百合多糖，该多糖从新鲜的兰州百合中提取得到，其单糖组成为葡萄糖和甘露糖，二者摩尔比为1:1.65；该多糖的重均分子量为4010Da。

进一步地，所述多糖的连接方式包含→4)-β-Glcp-(1→、→4)-β-Manp-(1→、→4)-2-OAc-β-Manp-(1→、β-Manp-(1→和α-Glcp-(1→。

一种上述兰州百合多糖的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1，兰州百合多糖提取：

将新鲜的兰州百合洗净，烘干，粉碎；先用95％乙醇加热回流提取以除去脂溶性物质；提取后的药材烘干，去离子水进行提取，提取液减压浓缩，获得兰州百合多糖的浓缩液；

步骤S2，兰州百合多糖分级醇沉：

兰州百合多糖浓缩液中加入95％乙醇，搅拌，直至溶液最终醇浓度为40％，静置过夜，析出沉淀即为百合40％部位粗多糖；以此类推，依次获得60％部位粗多糖和80％部位粗多糖；

步骤S3，兰州百合多糖分离纯化：

取适量80％部位粗多糖溶于去离子水，振荡，超声，使其充分溶解，过0.45μm滤膜，上样于DEAE Sepharose Fast Flow柱(3cm×42cm)，用300mL去离子水洗脱，流速1mL/min，每9mL接一管，采用苯酚-浓硫酸法进行隔瓶检测，合瓶，标为LP80-中，减压浓缩，获得中性糖LP80-中；

取适量中性糖LP80-中溶于去离子水，充分溶解，过0.45μm水膜，上样于SephacrylS-400HR柱(1.6×55cm)，用去离子水洗脱，流速0.5mL/min，每3mL接一管，采用苯酚-浓硫酸法进行隔瓶检测，合瓶，减压浓缩，无水乙醇沉淀，烘干，即得。

进一步地，每9mL接一管，将19-25管合瓶。

进一步地，每3mL接一管，将17-23管合瓶。

上述兰州百合多糖用于制备抗肿瘤药物的用途，所述肿瘤为乳腺癌或肝癌。

有益效果：

本发明从兰州百合中分离纯化得到多糖LP80-1，并对其分子量、单糖组成、化学结构等进行了分析鉴定，确定了其重均分子量和结构组成。细胞实验表明，该多糖具有显著的抗乳腺癌和肝癌活性，因此，该多糖具有开发成抗乳腺癌和肝癌药物的前景。

附图说明

图1所示为LP80-1的HPGPC谱图；

图2所示为LP80-1的单糖组成色谱图；

图3所示为LP80-1的红外谱图；

图4所示为LP80-1的¹HNMR谱图；

图5所示为LP80-1的¹³CNMR谱图；

图6所示为LP80-1的¹H-¹H COSY谱图；

图7所示为LP80-1的HSQC谱图；

图8所示为LP80-1的HMBC谱图；

图9所示为LP80-1的电镜扫描图，其中A:×5000；B：×30000；

图10所示为LP80-1对MDA-MB-231、MCF7、HepG2细胞的抑制率。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

实施例1：兰州百合多糖LP80-1的分离提取

1、兰州百合多糖LP80-1的分离提取

1.1兰州百合多糖提取

将15kg新鲜的兰州百合洗净，50℃下烘干，粉碎为2-3cm²的小片。先用95％乙醇加热回流提取3次，料液比1：5(w/v)，提取时间2h，以除去脂溶性物质；提取后的药材50℃下烘干，去离子水1:10(w/v)进行提取，90℃下提取2h，重复2次，合并提取液，60℃下减压浓缩至原体积的1/6，获得兰州百合多糖的浓缩液。

1.2兰州百合多糖分级醇沉

兰州百合多糖浓缩液中加入95％乙醇，同时用玻璃棒不断搅拌，直至溶液最终醇浓度为40％，4℃下静置过夜，析出沉淀即为百合40％部位粗多糖。以此类推，依次获得60％部位粗多糖、80％部位粗多糖，80％部位上清液继续减压浓缩加无水乙醇，4℃下静止过夜，析出沉淀为S部位粗多糖。

1.3兰州百合多糖分离纯化

取80％部位粗多糖100mg溶于5mL去离子水，振荡，超声，使其充分溶解，过0.45μm滤膜，上样于DEAE Sepharose Fast Flow柱(3cm×42cm)，依次用300mL去离子水、300mL0.1M NaCl溶液洗脱，流速1mL/min，每9mL接一管。采用苯酚-浓硫酸法进行隔瓶检测，以洗脱管为横坐标，样品吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，将19-25管合瓶，标为LP80-中；将75-91管合瓶，标为LP80-0.1。经过多次上样，积累LP80-中和LP80-0.1组分，50℃减压浓缩。LP80-0.1组分用3500透析袋透析48h，浓缩、真空干燥箱干燥，分别获得中性糖LP80-中和酸性糖LP80-0.1。

取20mg经DEAE Sepharose Fast Flow柱初步纯化的中性多糖样品溶于1mL去离子水，充分溶解，过0.45μm水膜，上样于Sephacryl S-400HR柱(1.6×55cm)，用去离子水洗脱，流速0.5mL/min，每3mL接一管，苯酚-浓硫酸法进行隔瓶检测，490nm下测定其吸光值。以洗脱管为横坐标，样品吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线。以此为依据，将17-23管合瓶。经过多次上样，积累LP80-1组分，50℃减压浓缩，无水乙醇沉淀，真空干燥箱烘干，获得80％部位中性糖，命名为LP80-1。

2、兰州百合多糖LP80-1结构鉴定

用酸水解、红外、核磁共振技术、高效液相色谱，对兰州百合多糖LP80-1进行结构解析。

2.1分子量的测定

将5mg兰州百合多糖LP80-1样品用1mL去离子水充分溶解，进行HPGPC分析。

2.2兰州百合多糖LP80-1单糖组成分析

2.2.1混合标准单糖的PMP衍生化：分别取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖各1mg，配成1mg/mL的标准品溶液。各取100μL单糖标准品混合于反应管中。取100μL混标溶液，先加入100μL 0.6M NaOH溶液混合一段时间，再加入200μL 0.5M的PMP溶液，在70℃烘箱中反应90min。冷却至室温，加0.3M HCl溶液至中性。加去离子水补至1mL，然后加1mL的氯仿溶液，充分振荡、离心，取水层，重复三次。

2.2.2样品溶液的PMP衍生化：精密称取5mg样品，加入3mL 3mol/L的TFA溶液，充入氮气、密封，110℃下水解6小时，反应结束后，冷却至室温，加入MeOH，减压浓缩，重复三次，最后用去离子水溶解。取100μL水解液，先后加入100μL 0.6M的NaOH溶液和200μL0.5 M的PMP溶液，在70℃烘箱中反应90min。冷却至室温后，加0.3M HCl溶液至中性，补足1mL，加1mL的氯仿溶液，充分振荡、离心，取水层，重复三次。水层过膜以进行HPLC检测。

色谱柱为Aglient ZORBAX SB-C18(4.6×250mm)，流动相为0.05M的磷酸盐缓冲液-乙腈(v：v＝83:17)，流速为1mL/min，进样量为10μL，检测波长250nm。

2.3兰州百合多糖LP80-1红外分析

取约2mg干燥的兰州百合多糖样品与适量KBr粉末充分研磨，经压片机挤压成透明薄片，在4000-400cm^-1范围内进行红外扫描，分辨率为16。

2.4兰州百合多糖LP80-1核磁共振分析

取50mg兰州百合多糖样品溶于550μL的重水中，加热超声，使其充分溶解，过0.45μm水膜，转移至核磁管中，利用600M核磁共振仪获得其¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC谱、HMBC谱、¹H-¹HCOSY谱。

2.6兰州百合多糖LP80-1微观形态观察

取微量干燥的LP80-1多糖样品均匀的散布在双面胶上，另一面附在样品台上，然后涂覆导电膜，利用扫描电镜观察其微观形态，最终获得不同放大倍数的形态图。

3、结果

3.1、兰州百合多糖LP80-1的基本性质结果

LP80-1的HPGPC谱图如图1所示，其显示LP80-1的重均分子量为4010Da。

3.2兰州百合多糖LP80-1的单糖组成分析

将LP80-1水解后，采用HPLC-PMP柱前衍生化的方法对其进行单糖组成分析，结果如图2所示，其中峰1为甘露糖，保留时间为16.42；峰2为葡萄糖，保留时间为36.23，结果表明，LP80-1主要由甘露糖和葡萄糖组成，根据峰面积计算可知其组成摩尔比为1.65:1。

3.3兰州百合多糖LP80-1的红外分析

LP80-1的红外吸收光谱如图3所示，3379.29cm^-1是-OH的伸缩振峰，2893.22cm^-1是C-H的伸缩振动峰，这两个峰是多糖类化合物的特征吸收峰。1735.93cm^-1是乙酰基或者酸酯中C＝O的共价振动峰，1651.07cm^-1是酰胺键中的C＝O的共价振动峰；1419.61cm^-1为C-H的变角振动峰；1381.03cm^-1为O-H的弯曲振动峰，1249.87cm^-1为C-H的弯曲振动峰；1200cm^-1-1000cm^-1是C-O-H的伸缩振动及C-O-C糖苷键的环振动，1157.29cm^-1，1064.71cm^-1，1033.86cm^-1验证了吡喃环的存在。802.39cm-1由同相环伸缩振动和甘露糖吡喃环中C₂-H键的变形产生，887.26cm^-1和802.39cm^-1表明该样品含有β构型葡萄糖和β构型的甘露糖。

3.4兰州百合多糖LP80-1的核磁分析

LP80-1的¹H-NMR(图4)和¹³C-NMR(图5)的谱图中可以看出，氢信号和碳信号主要分别位于3.0ppm-5.5ppm和60ppm-110ppm的区域。2.07ppm的氢信号，174.26ppm和21.15ppm的碳信号，HSQC谱(图7)中的2.07/21.15ppm信号，HMBC谱(图8)中的2.07/174.26ppm信号，表明LP80-1中含有乙酰基。此外，HMBC谱中5.39/174.26ppm信号和HSQC谱中5.39/72.40ppm信号，表明乙酰基与化学位移值为72.40的碳上的氧相连。综合LP80-1的¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC谱、HNBC谱可知，LP80-1由5种糖残基组成，HSQC谱中端基信号4.40/103.28ppm,4.64/100.75ppm,4.82/99.84ppm,4.72/100.33ppm,5.30/92.89ppm，分别归属于→4)-β-Glcp-(1→、→4)-β-Manp-(1→、→4)-2-OAc-β-Manp-(1→、β-Manp-(1→和α-Glcp-(1→，将这五种糖残基分别命名为A、B、C、D、E。根据¹H-¹H COSY谱(图5)，依次推断H1/H2、H2/H3、H3/H4、H4/H5、H5/H6的化学位移值，然后根据HSQC谱确定各糖残基的C2、C3、C4、C5、C6的化学位移值，最终通过HMBC谱中C-H的间接相关验证，各残基的化学位移值归属结果如表1所示。

各残基之间的相互连接关系根据HMBC谱中的相关信号进行推断。4.40/77.29ppm(AH1-BC4)，4.65/79.22ppm(BH1-AC4)信号，表明→4)-β-Glcp-(1→与→4)-β-Manp-(1→相互连接，4.40/79.22ppm(AH1-AC4)信号，表明LP80-1中存在重复的→4)-β-Glcp-(1→片段。4.64/77.31ppm(BH1-CC4)信号，表明B残基的O-1与C残基的C-4相连。4.72/77.29ppm(DH1-BC4)信号、4.72/79.22ppm(DH1-AC4)信号，表明C残基的O-1连接在B残基的C-4和B残基的C-4。

3.5兰州百合多糖LP80-1的电镜扫描

图9中A与B是兰州百合多糖LP80-1在扫描电镜下放大5000倍和30000倍的图像，图像显示LP80-1是分布均匀的椭球型颗粒。

实施例2：兰州百合多糖LP80-1的抗肿瘤活性研究

一、实验仪器和材料

DMEM培养基、RPMI-1640培养基购于Gibco公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜、MTT均来自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯；酶标仪。

二、实验方法

分别取处于对数生长期且状态优良的MCF7、MDA-MB-231、HepG2细胞株，移去培养基，预冷无菌PBS缓冲溶液清洗三次，加入一定量0.25％胰蛋白酶消化10～30s，使贴壁细胞脱落，为避免消化过度对细胞造成损伤，消化的过程中需在倒置显微镜下观察，待细胞收缩变圆后加入适量DMEM完全培养基来终止消化，用1mL移液枪缓慢吹打混匀后，计数并制备相应密度单细胞悬液。根据计数结果将单细胞悬液稀释至4×10⁴个/mL，接种于96孔培养板，100μL/孔，置恒温CO₂培养箱中培养24h后换液。加样组与对照组均设5个平行孔，每块板均设有空白对照组(仅加培养基)。共设4个浓度50、100、200、400μg/mL。受试样品作用24h后，每孔加入20μLMTT，继续避光培养4小时，吸去上清液，每孔加入DMSO 100μL，在摇床上振摇5min，用酶联免疫检测仪在570nm测定OD值，并计算细胞的抑制率。

三、实验结果

兰州百合多糖LP80-1的抗肿瘤筛选结果如图10。结果表明，LP80-1对MCF7、MDA-MB-231、HepG2均显示出明显的细胞毒活性，且样品浓度越大，抑制率增强，呈一定的浓度依赖关系。当LP80-1为400μg/mL浓度时，对MCF7细胞的抑制率最高，为87.4％，对HepG2的抑制率次之，为69.4％，对MDA-MB-231的抑制最差，为48.4％；这三者的IC₅₀值分别为142.6μg/mL、171.7μg/mL、386.4μg/mL。

综上可见，本发明发现了一种新的兰州百合多糖，且具有明显的抗乳腺癌和肝癌活性，具备开发成抗乳腺癌和肝癌药物的前景。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (6)

1.一种兰州百合多糖，其特征在于：该多糖从新鲜的兰州百合中提取得到，其单糖组成为葡萄糖和甘露糖，二者摩尔比为1:1.65；该多糖的重均分子量为4010Da。

2.根据权利要求1所述的兰州百合多糖，其特征在于：所述多糖的连接方式包含→4)-β-Glcp-(1→、→4)-β-Manp-(1→、→4)-2-OAc-β-Manp-(1→和β-Manp-(1→、α-Glcp-(1→。

3.一种权利要求1所述兰州百合多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，兰州百合多糖提取：

将新鲜的兰州百合洗净，烘干，粉碎；先用95％乙醇加热回流提取以除去脂溶性物质；提取后的药材烘干，去离子水进行提取，提取液减压浓缩，获得兰州百合多糖的浓缩液；

步骤S2，兰州百合多糖分级醇沉：

兰州百合多糖浓缩液中加入95％乙醇，搅拌，直至溶液最终醇浓度为40％，静置过夜，析出沉淀即为百合40％部位粗多糖；以此类推，依次获得60％部位粗多糖和80％部位粗多糖；

步骤S3，兰州百合多糖分离纯化：

取适量80％部位粗多糖溶于去离子水，振荡，超声，使其充分溶解，过0.45μm滤膜，上样于DEAE Sepharose Fast Flow柱(3cm×42cm)，用300mL去离子水洗脱，流速1mL/min，每9mL接一管，采用苯酚-浓硫酸法进行隔瓶检测，合瓶，标为LP80-中，减压浓缩，获得中性糖LP80-中；

取适量中性糖LP80-中溶于去离子水，充分溶解，过0.45μm水膜，上样于Sephacryl S-400HR柱(1.6×55cm)，用去离子水洗脱，流速0.5mL/min，每3mL接一管，采用苯酚-浓硫酸法进行隔瓶检测，合瓶，减压浓缩，无水乙醇沉淀，烘干，即得。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：每9mL接一管，将19-25管合瓶。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：每3mL接一管，将17-23管合瓶。

6.权利要求1或2所述的兰州百合多糖用于制备抗肿瘤药物的用途，所述肿瘤为乳腺癌或肝癌。

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