CN112798481A - 一种用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂，所述的试剂由以下组分组成：稀释液、密度液、缓冲液，且所述密度液中包含醇类物质，所述醇类物质的浓度为0.1％‑50％。本发明属于体外诊断领域领域。本发明提供一种用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂，本试剂既可单独检测蛋白颗粒浓度，又可以与其他仪器试剂联用同时检测脂蛋白胆固醇亚组份，而不必分两次检测，节省了时间和成本，具有较高的商业价值，能够广泛地应用于临床检验以及科研实验中。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断领域，具体说是一种既能够用于检测血清样本中脂蛋白组分的颗粒浓度的试剂。
背景技术
众所周知，按照脂蛋白的密度不同，可以将脂蛋白分为乳糜微粒(CM)，极低密度脂蛋白(VLDL)，中间密度脂蛋白(IDL)，低密度脂蛋白(LDL)，和高密度脂蛋白(HDL)。临床上，通常测定各类脂蛋白的胆固醇含量，用于指导诊断。目前临床上常规测定的不仅有总胆固醇(T-CH)，还有LDL-C，HDL-C。其中LDL-C的含量过高容易导致动脉粥样硬化，俗称坏胆固醇，而HDL-C对血管具有一定的保护作用，俗称好胆固醇。但最近的研究表面，无论是LDL-C，还是HDL-C均具有异质性，其临床意义也不完全相同。如LDL-C可以分成许多亚组分，小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)，由于其结构更加致密，更加容易引起动脉粥样硬化，也称为B型，而大而轻低密度脂蛋白胆固醇(LLDL-C)则相比之下致动脉粥样硬化的能力较弱，又称为A型。在HDL-C中，也可以至少分为两种主要亚组分，如大而轻的HDL2颗粒，以及小而密的HDL3颗粒，一些研究证据已经显示测量HDL的亚组分比仅测量HDL能够更好地反应反应心血管疾病的风险。
传统地，脂蛋白的检测都是通过检测脂蛋白颗粒中胆固醇的含量来评估。由于技术上的原因，很少有直接检测脂蛋白颗粒浓度的，如VLDL颗粒浓度、LDL颗粒浓度、HDL颗粒浓度。事实上这些脂蛋白颗粒浓度的检测，从另外一个角度反映了体内脂蛋白的水平，具有评估心血管疾病风险的作用。
一种方法是核磁共振法，该方法利用其脂蛋白的甲基上的氢的型号，通过复杂的算法，装换为脂蛋白及其亚组份的颗粒浓度，但是该法的技术门槛较高，不仅仪器昂贵，且对操作人员的要求高，故而该方法更加适合于科研用途，而在临床检验中推广有一定的难度。
公开号为US5284773A，US5633168A的美国专利公开了vertical auto profile(简称 VAP)的相关技术，该技术是利用超速离心分离脂蛋白，用于检测不同脂蛋白的胆固醇含量的方法；美国专利公开号为US9239280B2的发明专利描述了一种(vertical lipoproteinprofile，简称VLP)技术，该技术利用超速离心法分离脂蛋白后，用于检测不同脂蛋白颗粒浓度的方法，与核磁共振法类似，其检测的是脂蛋白的颗粒浓度；公开号为CN110108673A的中国专利则是结合了上述几个专利，公开了一种能够同时检测不同脂蛋白的胆固醇和脂蛋白的颗粒浓度的方法。
但由于上述专利中超速离心分离系统的限制，使得各种脂蛋白之间并不能充分地分离，相邻的脂蛋白之间容易受到干扰。当检测系统为VLP检测系统(所使用的仪器称为血脂颗粒检测仪)时，其散射光信号的检测与脂蛋白颗粒的大小有关，当大小颗粒之间分离得不够充分时，大颗粒对小颗粒的这种影响就更为明显，尤其是LDL-P(相对较小)极容易受到IDL-P(相对较大)、VLDL-P(大颗粒)的干扰，特别是当样本中甘油三酯的浓度较高时，这种干扰更为明显，且这几个项目都会明显受到正干扰，可能是高甘油三酯的样本中，会有一定的乳糜颗粒，其对其他脂蛋白的干扰效果大小依次为VLDL-P、IDL-P、LDL-P。甚至严重时影响LDL-P、IDL-P、VLDL-P等项目的精密度。因此无论是专利US9239280B2 中单独检测脂蛋白颗粒浓度，还是CN110108673A中同时检测脂蛋白胆固醇和脂蛋白颗粒浓度，都表现为较差的精密度和较容易受到高甘油三酯样本的影响。。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：一种密度梯度分离试剂，使用该试剂进行密度梯度超速离心后，能显著提高脂蛋白颗粒浓度检测系统的精密度，同时减小高甘油三酯样本的干扰。本发明可与其他专利(如背景技术)联合应用，既可以单独检测脂蛋白颗粒浓度，又可以同时检测脂蛋白胆固醇亚组份，而不必分两次检测，节省了时间和成本。
本发明所采取的技术方案是：提供一种用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂，所述的试剂由以下组分组成：
稀释液、密度液、缓冲液(最好有个比例范围)，且所述密度液中包含醇类物质，所述醇类物质的浓度为0.1％-50％，所述稀释液、密度液、缓冲液的体积配比为1：(35-45)：(110-130)。。
作为优选的方案，所述醇类物质含有的碳原子个数为1个、2个、3个或4个。
作为优选的方案，所述醇类物质为甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇、异丙醇、丙二醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇中的一种或多种。
作为优选的方案，所述醇类物质的浓度为1％-5％。
作为优选的方案，所述密度液中还包括NaCl以及EDTA。
作为优选的方案，所述的密度液的典型配方(用NaCl调整至指定密度)包括但不限于：
配方A：NaCl，0.1mM EDTA，0.1％乙醇，密度1.05g/cm3；
配方B：NaCl，0.1mM EDTA，25％乙醇，密度0.98g/cm3；
配方C：NaCl，0.1mM EDTA，5％乙醇，密度1.05g/cm3；
配方D：NaCl，0.1mM EDTA，1％异丙醇，密度1.05g/cm3；
配方E：NaCl，0.1mM EDTA，5％异丙醇，密度1.03g/cm3；
配方F：NaCl，0.1mM EDTA，0.5％正丙醇，密度1.05g/cm3；
配方G：NaCl，0.1mM EDTA，0.5％正丁醇，密度1.05g/cm3；
配方H：NaCl，0.1mM EDTA，1％异丁醇，密度1.05g/cm3；
配方I：NaCl，0.1mM EDTA，0.5％叔丁醇，密度1.05g/cm3；
配方J：NaCl，0.1mM EDTA，0.1％乙二醇，密度1.05g/cm3；
配方K：NaCl，0.1mM EDTA，0.5％丙二醇，密度1.05g/cm3；
作为优选的方案，所述稀释液为KBr溶液、NaBr溶液或蔗糖溶液中的一种，且所述稀释液的密度为1.21g/cm3。
作为优选的方案，所述缓冲液可以是，Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐)缓冲液、MOPS(3-(N-吗非啉)乙磺酸)缓冲液，TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)缓冲液中的一种。
作为优选的方案，所述试剂的使用方法主要包括以下步骤：
一、采用稀释液稀释血清样本并充分混匀得到稀释样本，并在离心管中加入密度液；取部分稀释样本，并从离心管底部中缓缓将稀释样本加入至离心管中得到混合液；
二、将处理好后的混合液离心管放入至超速离心机中进行离心处理，且所述超速离心机采用的转子为垂直转子，离心结束后即得分层试剂；
三、将上述分层试剂取出后放入血脂颗粒检测仪中进行检测，并在血脂颗粒检测仪中加入缓冲液，检测时按照检测仪的使用说明进行操作，离心后的脂蛋白按照脂蛋白密度大小排列顺序依次经过散射光检测器，散射光检测器将接受到的信号依次记录，最终检测仪经过计算即得样本中脂蛋白的颗粒浓度，完成检测。
作为优选的方案，所述步骤二中，离心处理的具体工艺为转速60000-70000rpm，温度 20-25℃，加速＝6，减速＝6，且离心时间为20-30分钟。
本发明的目的是为了减少样本中高甘油三酯检测的干扰，经过大量的配方调整，起初均未能获得良好的相关，直至发明人在密度液中添加了醇类物质之后，才出乎意料地发现该类物质的添加能够明显改善高甘油三酯样本检测时的精密度，进而发现对于甘油三酯造成的干扰有明显的降低作用。对于本发明中在密度液中所添加的醇类物质，并无特殊的要求，具体来说只要是醇类物质均具有良好的效果，本发明人尝试了大量地醇类物质，及其不同浓度。一般而言，当醇所含的碳原子数目为1-4个时，均具有较好的效果，包括但不限于以下醇类物质：甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、正丙醇、丙二醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇等。其浓度范围为0.1％-50％之间都具有良好的效果。当然当醇的浓度过大时，可能不太好调整密度，故而更加常用的浓度一般是0.5％-25％，最常用的是1％-5％。密度液在检测过程中主要是用来调整密度使用，即与稀释液配套使用，使离心前的样本能够形成上下两层不同的密度，从而使离心后形成连续的密度梯度。便于脂蛋白按密度梯度分离。
对于检测的操作步骤，首先是需要将样本进行稀释，即用稀释液将血清样本稀释40 倍或其他合理倍数，这与检测的灵敏度有关，检测灵敏度如果高，可以稀释更多的倍数。典型的稀释手法是50ul的血清加入1950ul的稀释液，充分混匀。另外再取一个5.0ml的Polyallomer快封管(即离心管，也可采用功能类似的离心管替换)加入3800ul的密度液，所用密度液可以是上述提到的任何一种配方的试剂。然后，取1200ul预先稀释好的样本，从离心管底部缓缓加入。将处理好的样本放入超速离心机中，进行离心，必须使用垂直转子，如VTi-65.2转子，一次可以离心16个样本，当然也可以选择其他类型的垂直转子。可以根据密度液的不同，设置不同的离心程序，如密度液的密度越小，可以考虑离心的时间就越短。最常用的离心时间是30min，也可以使用28min或25min等。离心的转速通常设置是65000rpm，离心温度控制在23℃附近，加速＝6，减速＝6。离心完后的样本，必须小心地从离心机中拿出来，以免过大的剧烈震动影响已经离心完成的样本。然后将该样本使用血脂颗粒检测仪进行检测，检测时该仪器需要相应的缓冲液，主要目的是时整个检测过程有一个合适的缓冲环境，过酸或者过碱都有可能影响检测的效果，通常来说对于缓冲液没有太特殊的要求，只要能够提供相对中性的缓冲环境即可，以下缓冲液都可以选择:Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES(4-(2-羟乙基)-1- 哌嗪乙烷磺酸半钠盐)缓冲液、MOPS(3-(N-吗非啉)乙磺酸)缓冲液，TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)缓冲液。检测时的具体操作按照仪器使用说明进行。主要原理是在合适的缓冲环境下，离心后的脂蛋白按照脂蛋白密度大小排列顺序依次经过散射光检测器，散射光检测器将接受到的信号依次记录，由于信号的强度大小，与某一时间点通过该散射光检测器的脂蛋白颗粒浓度相关，进而反应了样本中脂蛋白的颗粒浓度。通过专用的软件，以及合适的校准，最终能够获得关于各个脂蛋白的颗粒浓度的详细信息，所检测的项目包括：HDL颗粒浓度(HDL-P)、LDL颗粒浓度(LDL-P)、IDL颗粒浓度(IDL-P)、 Lpa颗粒浓度(Lpa-P)、VLDL颗粒浓度(VLDL-P)。详细的原理可以参见US9239280。本发明的试剂可以在上述的血脂颗粒检测仪上使用，也可以在如CN110108673A中描述的检测系统中使用，该检测系统能够同时检测脂蛋白胆固醇和脂蛋白颗粒浓度。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
试剂配制与检测步骤
取血清50ul，加入1950ul的稀释液(见下表一)，混匀。取一5.0ml的Polyallomer快封管，加入3800ul的密度液(见下表一)，再从底部缓缓加入预先稀释好的血清样本1200ul。将该离心管放入转子VTi-65.2转子中，并用Beckman超速离心机离心。参数：转速＝65000rpm，时间(见下表)，温度＝23℃，加速＝6，减速＝6。
将离心后的样本小心地移至脂蛋白颗粒浓度检测仪器上，进行检测。上机检测时所用的缓冲液为20mM磷酸缓冲液，pH7.0。
表一、不同组合的配方
上表中的部分物质未注明浓度，如KBr，是用来调整稀释液的密度的，根据稀释液的密度1.21，则加入固体KBr直至密度为1.21g/ml为止，NaBr、蔗糖等同理。密度液组分中的NaCl也是用来调整密度的，根据最终密度的不同，加入的NaCl量也会略有不同。
实施例2
精密度实验
取一份样本，利用本检测系统，重复检测10次，计算脂蛋白颗粒浓度的精密度，其结果见表2，采用的样本配方为实施例中所配置的配方，如表2中的配方1对应表1中的配方1(组分：稀释液KBr，密度1.21g/ml；密度液NaCl，0.1mM EDTA，0.1％乙醇，密度1.05g/ml；离心时间30min)，下同。
表2精密度(样本1，TG浓度：1.5mM)
表3精密度(样本2，TG浓度：2.0mM)
表4精密度(样本3，TG浓度：3.2mM)
表5精密度(样本4，TG浓度：4.5mM)
表6精密度(样本5，TG浓度：6.2mM)
由此可见，本检测系统，检测几种不同的脂蛋白颗粒浓度，均具有较好的精密度。相比之下，对照组的精密度随着样本中甘油三酯浓度的升高而使CV变大，当样本中的TG浓度为2mM时，已经可以发现CV已经有所变差，当样本中的TG浓度大于3.2mM时，可以看出，这几个项目的精密度已经变化很大，当样本中的TG浓度大于4.5mM时，CV基本在10％以上了。当TG浓度进一步升高时，CV将进一步变差。而本发明的试剂的精密度却没有明显变差的迹象，因此本发明在临床上具有较好的应用前景。
实施例3
线性实验
每个项目都取一份高值样本，用水稀释成不同的浓度梯度，用本检测系统进行检测，验证其线性范围。所验证的各项目具体线性范围分别为HDL-P：1-80umol/L；LDL-P：20-6000nmol/L；Lpa-P：2-300nmol/L；IDL-P：1-100nmol/L；VLDL-P：2-500nmo/L。线性范围验证的判定稀释R2的具体结果见表3。
表7线性范围验证结果
由此可见，这几个脂蛋白颗粒浓度类的项目的线性范围能够满足指标要求，覆盖临床检测所需范围，在此段线性范围内，具有较好的线性。
实施例4
干扰实验
制备2份混合血清，一份为正常甘油三酯的样本混合的，经检测其TG浓度为1.2mM。另一份为高甘油三酯的样本混合的，经检测其TG浓度为4.2mM。按照等比例混合怎TG的浓度为2.7mM。针对某一条件下，其干扰效果按下面方法计算：(高TG样本测值+低TG样本测值)/(等比例混合样本测值*2)，注意：此处的认为高TG样本被低TG样本稀释2 倍后，其干扰能力明显变小，实际上可能仍然存在较大干扰，干扰效果可能还是被低估，但不影响本实验中不同方案之间的比对关系。
表8干扰效果验证结果
由此可见，当试剂中不添加醇类物质时，LDL-P、Lpa-P、IDL-P、VLDL-P都比较容易受到高TG样本的干扰的影响。当试剂中添加了醇类物质时，这几个项目受高TG的干扰明显减小不少。因此本发明有力与减少血脂颗粒检测时的TG干扰，能为临床提供更加精准的检测结果。
实施例5
样本比对
选取正常TG的样本40例，用不同的几组配方的试剂进行检测。分析其与对照配方的相关性，结果见表9.
表9不同配方的检测结果的相关性
由此可见，对于正常TG的样本，这几组不同的配方与对照配方相比，其结果具有良好的相关性。即试剂中添加醇类物质并不影响检测结果。
综上，通过本发明的试剂能够有效地对血清样本进行密度梯度分层，从而进行之后的脂蛋白等物质的检测步骤，本试剂既可单独检测蛋白颗粒浓度，又可以与其他仪器试剂联用同时检测脂蛋白胆固醇亚组份，而不必分两次检测，节省了时间和成本，具有较高的商业价值，能够广泛地应用于临床检验以及科研实验中。
以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体结构允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂，其特征在于：所述的试剂由以下组分组成：稀释液、密度液、缓冲液，且所述密度液中包含醇类物质，所述醇类物质的浓度为0.1％-50％，所述稀释液、密度液、缓冲液的体积配比为1：(35-45)：(110-130)。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂，其特征在于：所述醇类物质含有的碳原子个数为1个、2个、3个或4个。
3.根据权利要求1所述的用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂，其特征在于：所述醇类物质为甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇、异丙醇、丙二醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂，其特征在于：所述醇类物质的浓度为1％-5％。
5.根据权利要求1所述的用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂，其特征在于：所述密度液中还包括NaCl以及EDTA。
6.根据权利要求1所述的用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂，其特征在于：所述稀释液为KBr溶液、NaBr溶液或蔗糖溶液中的一种，且所述稀释液的密度为1.21g/cm3。
7.根据权利要求1所述的用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂，其特征在于：所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐缓冲液、3-(N-吗非啉)乙磺酸缓冲液，N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液中的一种。
8.根据权利要求7所述的用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂，其特征在于：所述缓冲液的pH为6.0-8.0，浓度范围为20-50mM。
9.一种权利要求1-8所述用于检测脂蛋白颗粒浓度的试剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、采用稀释液稀释血清样本并充分混匀得到稀释样本，并在离心管中加入密度液；取部分稀释样本，并从离心管底部中缓缓将稀释样本加入至离心管中得到混合液；
二、将处理好后的混合液离心管放入至超速离心机中进行离心处理，且所述超速离心机采用的转子为垂直转子，离心结束后即得分层试剂；
三、将上述分层试剂取出后放入血脂颗粒检测仪中进行检测，并在血脂颗粒检测仪中加入缓冲液，检测时按照检测仪的使用说明进行操作，离心后的脂蛋白按照脂蛋白密度大小排列顺序依次经过散射光检测器，散射光检测器将接受到的信号依次记录，最终检测仪经过计算即得样本中脂蛋白的颗粒浓度，完成检测。
10.根据权利要求9中所述试剂的使用方法，其特征在于，所述步骤二中，离心处理的具体工艺为转速60000-70000rpm，温度20-25℃，加速＝6，减速＝6，且离心时间为20-30分钟。
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