CN112782132A - 一种基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂的方法 - Google Patents

一种基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于乙酰胆碱酯酶‑金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂的方法，包括如下步骤，(1)制备乙酰胆碱酯酶‑金纳米簇溶液，加入不同浓度的有机磷酸酯阻燃剂，测定含有不同浓度有机磷酸酯阻燃剂的乙酰胆碱酯酶‑金纳米簇在315nm激发波长下的荧光强度，计为F，建立荧光强度变化率(F‑F0)/F0与不同浓度有机磷酸酯阻燃剂的标准曲线；(2)将待测样品加入乙酰胆碱酯酶‑金纳米簇溶液中，测定荧光强度，根据步骤(1)的标准曲线，计算待测样品中有机磷酸酯阻燃剂的浓度。本发明的乙酰胆碱酯酶作为金纳米簇的还原剂和保护剂直接参与到有机磷酸酯阻燃剂荧光检测中，简化检测信号传递过程，减少组成复杂导致的检测不灵敏与干扰。

Description

一种基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂的 方法
技术领域
本发明属于纳米材料荧光检测领域，具体涉及一种基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂的方法。
背景技术
有机磷酸酯阻燃剂是一种降低火灾风险的材料助剂，广泛应用于各行业各类产品中，包括建材、纺织、塑料、电子、造纸和家装等。阻燃剂虽然有助于保障人类生命和财产安全，但由于其不与材料化学结合，广泛存在于水体中，通过废水或工厂排放、挥发、物件磨损或溶解等途径释放。对水体生物以及人类健康有毒害作用。因此发展简单、灵敏、快速、可靠的测定方法尤为迫切。有机磷酸酯阻燃剂在水体中浓度含量低，分析方法众多：气相色谱-氮磷检测、气相色谱-火焰光度检测、气质联用、液质联用、电喷射离子化、电子俘获负离子等。然而这些方法都存在所用仪器较为复杂、昂贵、耗时、需要专业的操作人员等缺点。
荧光检测中应用纳米材料检测，近年发展迅猛备受热捧，纳米材料由于其超细、无毒、具有独特的核/表面结构、荧光度高、生物相容性好等特点而备受关注。其中，蛋白质稳定金纳米簇是一类独特的生物纳米材料，具有强发光和高特异性的化学识别特性，适用于离子、无机物、有机物和生物分子的荧光检测。据报道，有机磷酸酯阻燃剂由于其有P＝O磷酸酯型结构以及其空间结构小等优势，能与乙酰胆碱酯酶上的氨基酸特异性结合，且比其他抑制剂在形成共价键上有一定竞争力。但是，如Lei C,Wang Z,Nie Z,et al.ResurfacedFluorescent Protein as a Sensing Platform for Label-Free Detection of Copper(II)Ion and Acetylcholinesterase Activity[J].Analytical Chemistry,2015,87(3):1974-1980.和Xie,Huizhi,Bei,Feng,Hou,Juying.、A highly sensitive dual-signalingassay via inner filter effect between g-C 3 N 4,and gold nanoparticles fororganophosphorus pesticides[J].Sensors and Actuators B:Chemical:S0925400517316775.和利用乙酰胆碱酯酶检测污染物的方法，都存在信号传递过程复杂，复杂的过程会导致检测不灵敏，容易出现干扰的缺点。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种高选择性、高灵敏性、操作简单的基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂的方法，并用于检测环境水体中的有机磷酸酯阻燃剂。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂的方法，包括如下步骤：
(1)制备乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液，加入不同浓度的有机磷酸酯阻燃剂，调节pH6.0～9.0，孵育30～70min，测定含有不同浓度有机磷酸酯阻燃剂的乙酰胆碱酯酶-金纳米簇在315nm激发波长下，在398nm发射波长处的荧光强度，计为F，空白乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液的荧光强度计为F0，计算荧光强度变化率(F-F0)/F0的值，建立荧光强度变化率(F-F0)/F0与不同浓度有机磷酸酯阻燃剂的标准曲线；
(2)将待测样品加入乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液中，调节pH6.0～9.0，孵育30～70min，测定待测样品在315nm激发波长下，在398nm发射波长处的荧光强度，计算荧光强度的变化率，根据步骤(1)的标准曲线，计算出待测样品中有机磷酸酯阻燃剂的浓度。
优选地，所述制备乙酰胆碱酯酶-金纳米簇的方法为：将乙酰胆碱酯酶与氯金酸混合均匀，调节pH 10.0～14.0，40～90℃下反应12～24h，得到乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液。
优选地，乙酰胆碱酯酶-金纳米簇时调节pH 12.0～12.6，75～85℃下反应17～19h。
优选地，混合后所述乙酰胆碱酯酶与氯金酸的浓度比为3～5mU:1mmol/L。
优选地，步骤(1)中，所述加入不同浓度的有机磷酸酯阻燃剂，最终体系不同浓度的有机磷酸酯阻燃剂的浓度范围为0～4000ng/L。
优选地，步骤(1)中，所述标准曲线中有机磷酸酯阻燃剂的线性范围为50～1000ng/L，最低检测限为30ng/L。
优选地，步骤(1)中所述有机磷酸酯阻燃剂为磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)，CAS号：13674-84-5。
优选地，步骤(1)和步骤(2)中，所述pH为7.0～8.0，孵育温度为20～45℃，孵育时间为40～70分钟。
优选地，步骤(1)和步骤(2)中，调节pH为7.4±0.5，孵育温度为40±3℃，孵育时间为50±5分钟。
本发明直接用乙酰胆碱酯酶合成金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂，可以简化检测信号传递过程，减少组成复杂导致的检测不灵敏与干扰。因此，建立一种高选择性、高灵敏性、操作简单的乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂方法具有重要意义。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明为一种基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂的方法，通过有机磷酸酯阻燃剂与乙酰胆碱酯酶-金纳米簇相互作用导致其空间结构和电位发生改变，引起金纳米簇的聚集荧光增强。本发明的乙酰胆碱酯酶作为金纳米簇的还原剂和保护剂直接参与到有机磷酸酯阻燃剂荧光检测中，简化了检测信号传递过程，减少组成复杂导致的检测不灵敏与干扰。
2、乙酰胆碱酯酶用量低于其他作为间接物质参与的荧光检测的用量，降低成本。
3、检测方法灵敏度和选择性高，在实际应用中也具有广阔的应用前景，这为环境水体中有机磷阻燃剂的检测提供了一条有效的途径。
附图说明
图1为本发明实施例1中乙酰胆碱酯酶合成的金纳米簇的最佳激发和发射光谱图。
图2为本发明实施例2中荧光强度随着磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)浓度(0～4000ng/L)的变化图。
图3为本发明实施例2中荧光强度变化率(F-F0)/F0与磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)浓度(50～1000ng/L)的标准曲线图。
图4为本发明实施例3中tris-HCl缓冲溶液的pH对乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测1000ng/L磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)的荧光强度变化率(F-F0)/F0的影响图。
图5为本发明实施例4中孵育温度对乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测1000ng/L磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)的荧光强度变化率(F-F0)/F0影响图。
图6为本发明实施例5中乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)的孵育时间对金纳米簇荧光强度的影响图。
图7为本发明实施例6中乙酰胆碱酯酶-金纳米簇选择性实验图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
金纳米簇荧光材料的制备：10mmol/L氯金酸1mL与0.2U/ml乙酰胆碱酯酶100μL混合，在80℃下预热5分钟，然后剧烈震荡混匀，加入1.0mol/L tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)和1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至12.3，并使混合液最终反应体积达到2mL，此时乙酰胆碱酯酶与氯金酸浓度比(mU:mmol/L)为4:1。在80℃下反应18小时，用0.45μm滤头过滤大颗粒金，10kDa超滤管超滤13分钟后得到浅白色溶液，在365nm的紫外光源照射下有明显的蓝色荧光，即得到乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液，溶液浓度约为5mmol/L。获得的乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液最大激发波长和发射波长分别为315nm和398nm(见图1)，量子产率为3.5970ns，4℃下保存能保证一周的相对稳定，荧光强度及最大发射峰位置保持不变。
实施例2
基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂的方法的建立：将实施例1所得的乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液100μL与不同浓度的磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)混合，再加入1.0mol/L tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)得到2mL混合溶液，磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)的最终体系浓度为0,25,50,100,300,500,700,900,1000,1500,2000,2500,3000and 4000ng/L。40℃下孵育50分钟，测定含有不同浓度磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)的乙酰胆碱酯酶-金纳米簇在315nm激发波长下的荧光强度，计为F，0ng/L浓度下的荧光强度计为F0(见图2)，计算荧光强度变化率(F-F0)/F0的值，建立(F-F0)/F0与磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)浓度的标准曲线，由图3可得检测磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)的线性范围为50～1000ng/L，最低检测限为30ng/L。
实施例3
基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂孵育条件的优化：将实施例1所得的乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液100μL与磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)混合，再加入1.0mol/L tris-HCl缓冲溶液(调节混合溶液pH范围为6.0～9.0)得到2mL混合溶液，磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)的最终体系浓度为1000ng/L。40℃下孵育50分钟，测定含有磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)的乙酰胆碱酯酶-金纳米簇在315nm激发波长下的荧光强度，计为F，同时测0ng/L浓度下乙酰胆碱酯酶-金纳米簇的荧光强度，计为F0，计算荧光强度变化率(F-F0)/F0的值，如图4所示，孵育结束后，tris-HCl缓冲溶液调节混合溶液pH为7.4时所得的荧光强度变化率最高。
实施例4
基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂孵育条件的优化：将实施例1所得的乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液100μL与磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)混合，再加入1.0mol/L tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)得到2mL混合溶液，磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)的最终体系浓度为1000ng/L。20℃～60℃下孵育50分钟，测定含有磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)的乙酰胆碱酯酶-金纳米簇在315nm激发波长下的荧光强度，计为F，同时测0ng/L浓度下乙酰胆碱酯酶-金纳米簇的荧光强度，计为F0，计算荧光强度变化率(F-F0)/F0的值，如图5所示，孵育结束后，孵育温度为40℃时所得的荧光强度变化率最高。
实施例5
基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂孵育条件的优化：将实施例1所得的乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液100μL与磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)混合，再加入1.0mol/L tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)得到2mL混合溶液，磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)的最终体系浓度为1000ng/L。40℃下孵育0～70分钟，测定含有磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)的乙酰胆碱酯酶-金纳米簇在315nm激发波长下的荧光强度变化。如图6所示，孵育时间需50分钟。
实施例6：
基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂的方法，需考察其选择性：将环境样品中可能存在的干扰离子(Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Cu2+，Zn2+，Fe3+)与其他阻燃剂(TBBPA，BDE-47，BDE-209)分别加入到实施例1所得乙酰胆碱酯酶-金纳米簇中，乙酰胆碱酯酶-金纳米簇100μL，反应总体积为2mL，干扰物最终浓度为0.1mmol/L，在实施例2-实施例5所得的最优孵育条件下进行孵育。如图7所示，干扰物质在315nm激发波长下均未引起明显的荧光强度变化，只有1000ng/L磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)使乙酰胆碱酯酶-金纳米簇的荧光强度明显增强。说明本方法检测有机磷酸酯阻燃剂具有较高选择性。
实施例7：
实际样品检测：在自来水和珠江水中加入确定浓度的磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)，通过0.22μm滤头过滤杂质后与实施例1所得乙酰胆碱酯酶-金纳米簇充分混合，在实施例2-实施例5所得的最优孵育条件下进行孵育，在315nm激发波长下的测定实际样品荧光强度，根据实施例2所得标准曲线计算得到样品磷酸三(2-氯丙基)酯(TClPP)浓度，并考察乙酰胆碱酯酶-金纳米簇在实际样品检测中的可行性。测定结果见表1。自来水样品(98.0％–103.3％)和珠江样品(99.0％–104.5％)的回收率合理，相对偏差小于5％，所得结果表明，该方法在实际样品中具有潜在的适用性。
表1
Figure BDA0002263970740000051
Figure BDA0002263970740000061
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于乙酰胆碱酯酶-金纳米簇检测有机磷酸酯阻燃剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液，加入不同浓度的有机磷酸酯阻燃剂，调节pH6.0～9.0，孵育30～70min，测定含有不同浓度有机磷酸酯阻燃剂的乙酰胆碱酯酶-金纳米簇在315nm激发波长下，在398nm发射波长处的荧光强度，计为F，空白乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液的荧光强度计为F0，计算荧光强度变化率(F-F0)/F0的值，建立荧光强度变化率(F-F0)/F0与不同浓度有机磷酸酯阻燃剂的标准曲线；
(2)将待测样品加入乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液中，调节pH 6.0～9.0，孵育30～70min，测定待测样品在315nm激发波长下，在398nm发射波长处的荧光强度，计算荧光强度的变化率，根据步骤(1)的标准曲线，计算出待测样品中有机磷酸酯阻燃剂的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备乙酰胆碱酯酶-金纳米簇的方法为：将乙酰胆碱酯酶与氯金酸混合均匀，调节pH 10.0～14.0，在40～90℃下反应12～24h，得到乙酰胆碱酯酶-金纳米簇溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，制备乙酰胆碱酯酶-金纳米簇时调节pH12.0～12.6，在75～85℃下反应17～19h。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，混合后所述乙酰胆碱酯酶与氯金酸的浓度比为3～5mU:1mmol/L。
5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述加入不同浓度的有机磷酸酯阻燃剂，最终体系不同浓度的有机磷酸酯阻燃剂的浓度范围为0～4000ng/L。
6.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述标准曲线中有机磷酸酯阻燃剂的线性范围为50～1000ng/L，最低检测限为30ng/L。
7.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述有机磷酸酯阻燃剂为磷酸三(2-氯丙基)酯，CAS号：13674-84-5。
8.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述pH为7.0～8.0，孵育温度为20～45℃，孵育时间为40～70分钟。
9.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，调节pH为7.4±0.5，孵育温度为40±3℃，孵育时间为50±5分钟。
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