CN112779321B - 用于检测gck-mody基因突变的方法及其试剂盒 - Google Patents
用于检测gck-mody基因突变的方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了对人群单基因遗传病进行基因检测时确定DNA混合样本(DNA pooling)数目的方法，可以适用于大量样本的高效分析，并且可以显著降低对人群单基因遗传病进行基因检测的成本。结合本发明提供的引物组可以实现对大量样本的GCK‑MODY测序和GCK基因突变的检测。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体地涉及与疾病相关的基因的检测。
背景技术
单基因遗传病是单个基因变异引起的遗传病，是受一对等位基因控制的遗传病。目前已知的很多遗传病都属于单基因病，如血友症、色盲、多指、并指、苯丙酮尿症等等。遗传病一般困扰终生、难以治疗，有些即使可以治疗，费用也十分昂贵，更重要的是，患者可能将突变的基因遗传给下一代。单基因遗传病通常发病率较低。
隐性单基因遗传病患儿双亲往往没有任何症状，常规产检难以检出，直到患儿出生后才发现病症。如夫妻双方在备孕期或孕早期进行单基因遗传病携带者筛查，及时发现致病变异携带情况，提示生育患儿的风险，可通过遗传咨询、产前检测或诊断、辅助生殖技术等有效预防部分单基因遗传病出生缺陷的首次发生。
而且，通过基因测序对临床症状不明显的发病率很低的单基因遗传病进行大规模人群的检测筛选时，成本极高，严重阻碍了基因测序在单基因遗传病检测中的推广应用。
青少年发病的成人型糖尿病(MODY)就是一种由于单基因突变导致的糖尿病，该病的特征表现为：发病年龄早，常染色体显性遗传。葡萄糖激酶(GCK)单基因突变导致的MODY2(GCK-MODY)是最常见的MODY亚型之一。GCK-MODY患者血糖感知能力上调，从出生起就表现为轻微的血糖升高，由于缺乏对该疾病的重视，且GCK-MODY患者无明显的特异性临床表现，许多GCK-MODY患者被错误的诊断为I型或II型糖尿病。此外，无症状的GCK-MODY患者在妊娠期糖筛时可被诊断为妊娠糖尿病，但是GCK-MODY患者在妊娠期需根据胎儿是否遗传到GCK突变来采取特异性干预措施：当胎儿未遗传到母亲的GCK突变时，需对孕妇进行胰岛素治疗，防止胎儿过度生长出现巨大儿，导致不良妊娠结局；当胎儿遗传到母亲的GCK突变时，则胎儿与母亲的葡萄糖感知能力处于同时上调状态，无需进行干预，若使用胰岛素过度治疗将导致胎儿生长发育迟缓。
MODY大约占糖尿病人群的1-2％，但是由于GCK-MODY患者没有特异性的临床表型特征，其诊断的基础是基因测序。传统的基因测序包括全基因组测序、全外显子测序等，是一项成本极高的检查，从而导致存在基因检测的推广难度大的瓶颈。因此，目前需要既能实现对大规模人群，
比如孕妇高通量检测GCK-MODY，同时降低GCK-MODY检测成本的方法，从而对GCK-MODY进行精准诊疗，尤其是实现对孕妇中GCK-MODY患者的精准筛查，有助于减少不良妊娠结局，改善孕期和围产期精准护理，促进优生优育。
发明内容
本发明提供了对人群单基因遗传病进行基因检测时确定DNA混合样本(DNApooling)数目的方法，将待检测DNA样本混合的策略是将多个个体的DNA样本按照一定比例混合后再进行PCR、位点扫描和分型的方法，可以适用于大量样本的高效分析，并且可以显著降低对人群单基因遗传病进行基因检测的成本，而且准确性较高。
将所述确定DNA混合样本数目的方法应用于在糖尿病和自然人群中检测GCK-MODY患者时，发现可将检测成本降至百元以下，甚至是50元以下，从而可实现大规模的人群筛查，惠及更多的人群，尤其是孕妇，解决了由于检测费用高而导致的基因检测推广难度大的问题。
DNA混合样本(DNA pooling)策略具有低成本、效率高的优点，可以对大量样本进行高效分析，但是前提也需要超高灵敏度和超高特异性的PCR检测系统。
本申请设计了一组PCR引物，利用多重PCR结合高通量测序的方法，在一次PCR反应中对GCK基因的外显子及其侧翼的50bp片段进行扩增和检测，具有灵敏度高、特异性强、准确性高等优点；同时结合根据本发明确定的DNA混合样本策略实现了成本的显著降低。
第一方面，本发明提供了经DNA混合样本法对人群单基因遗传病进行基因检测时确定DNA混合样本数目的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)确定人群中单基因遗传病的发病率；
(2)根据以下公式计算混合的DNA样本数目：
-1/2+sqrt(1/4+1/a％)＜n<1/2+sqrt(1/4+1/a％)
其中，a％为发病率，n为混合的样本数目，sqrt表示求平方根的函数。
上述公式是根据成本最低化的原则基于数学模型获得的，假定每次基因检测所花费用为M，单基因遗传病在人群中的发病率为a％，每个混合样本中混合n个个体的样本，其中包括N个单基因遗传病患者，总成本的范围在NM/n+N*a％*M～NM/n+N*a％*n*M之间。成本最低的混合方案应满足以下条件：
NM/n+N*a％*n*M＜NM/(n-1)+N*a％*(n-1)*M
NM/n+nNM*a％＜NM/(n+1)+N*a％*(n+1)*M
根据上述数学模型获得的确定DNA混合样本数目的公式可以用于发病率较低的单基因遗传病利用DNA混合样本进行基因测序时确定混合样本的数目，所述公式与发病率相关，基于成本最低化的原则。
在一些实施方案中，所述单基因遗传病为GCK-MODY。糖尿病人群中GCK-MODY的发病率为约1.6％，自然人群中GCK-MODY的发病率为约0.1％。因此可以计算出糖尿病人群的混合样本数目为约8人，自然人群的混合样本数目为约32人。
第二方面，本发明提供了用于在人群中扩增单基因遗传病的单基因和/或在人群中检测单基因遗传病的单基因突变的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)确定人群中单基因遗传病的发病率；
(2)根据以下公式计算混合的DNA样本数目：
-1/2+sqrt(1/4+1/a％)＜n<1/2+sqrt(1/4+1/a％)，
其中，a％为发病率，n为混合的样本数目，sqrt表示求平方根的函数；
(3)将第(2)步确定的DNA样本数目的样本混合；
(4)利用引物组对步骤(3)获得的DNA混合样本进行PCR反应，使得扩增出单基因遗传病的单基因。
所述的混合的DNA样本数目是同时在一次PCR反应中混合的样本的数目，是能够在一次PCR反应中检测的人数。
在一些实施方案中，还包括对步骤(4)获得的扩增出单基因遗传病的单基因进行测序的步骤。优选地，所述测序为二代测序。
第三方面，本发明提供了用于扩增GCK基因和/或检测GCK基因突变的引物组，所述引物组具有SEQ ID NO：1-22所示的核苷酸序列作为正向引物，以及与所述正向引物对应的具有SEQ ID NO：23-44所示的核苷酸序列作为反向引物。
所述的引物组具体参见下表1：
表1：
表1所示的引物组可以实现在一次PCR反应中对GCK基因的10个外显子及其侧翼的50bp片段的区域进行扩增和检测，扩增片段的长度在150-299个bp之间。扩增出GCK基因的所有外显子及外显子侧翼的内含子，覆盖了具有临床意义的突变位点，实现了对GCK基因目标区域100％的富集和覆盖；简化了对序列突变的检测，因为引物组中每个引物对的特异性较好，扩增出的每个基因片段大小都不相同，分布在150-299bp的范围内，不会引起引物与模板的非特异性结合，扩增结果可以真实准确反应GCK基因的序列信息。
经血液和唾液样本的DNA进行验证，发现所述的引物组的平均特异性在91％以上，具体而言，血液样本的平均特异性为92.21％，唾液样本的平均特异性为91.25％。平均91％以上的扩增序列都是目标序列，显示了所述引物组的较高特异性。
本申请中利用上述引物组可以实现在一个PCR反应(即采用一个反应管)中进行GCK基因的突变检测，因此降低了成本，提高了效率。而且，因为每个引物对儿获得的扩增子的大小均不相同，均可利用琼脂糖凝胶电泳进行分离，每个扩增子可以分别反映出GCK基因不同位置处的外显子及外显子侧翼内含子区域的编码信息，因此，本发明提供的引物组的可靠性较好。
第四方面，本发明提供了用于扩增GCK基因和/或检测GCK基因突变的试剂盒，所述试剂盒包含第三方面的引物组。
优选地，所述试剂盒还包含DNA聚合酶。
第五方面，本发明提供了用于扩增GCK基因和/或检测GCK基因突变的方法，所述方法包括：将第三方面的引物组与生物样品的分离的核酸相混合，进行PCR反应，获得扩增产物。或者利用本发明第四方面所述的试剂盒对生物样品进行PCR扩增获得扩增产物。
在一些实施方案中，所述方法还包括对所述的扩增产物构建文库及测序的步骤。优选地，所述测序为二代测序。
优选地，所述方法还包括对PCR反应的扩增产物和/或所构建的文库进行纯化的步骤。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)将第三方面的引物组与生物样品的分离的核酸相混合，进行PCR反应，获得扩增产物；
(2)对第(1)步获得的扩增产物进行纯化；
(3)对步骤(2)获得的纯化产物构建文库；
(4)对步骤(3)获得的文库进行纯化；
(5)对步骤(4)获得的纯化文库进行测序。
在一些实施方案中，所述测序为第二代测序。
优选地，所述对PCR反应的扩增产物和/或所构建的文库进行纯化包括采用磁珠进行纯化的步骤。
优选地，所述对PCR反应的扩增产物或所构建的文库进行纯化包括以下步骤：
(1)向扩增产物或所构建的文库中加入磁珠；
(2)用磁力架吸附步骤(1)的磁珠，直至溶液澄清后去除上清，保留磁珠；
(3)加入乙醇，用磁力架吸附磁珠以洗涤DNA；
(4)用磁力架吸附步骤(3)的磁珠，直至溶液澄清后去除上清；
(5)重复步骤(3)和(4)后，室温放置，直至乙醇完全挥发；
(6)加入无酶水溶解步骤(5)获得的磁珠上的DNA，用磁力架吸附磁珠，回收上清。
优选地，所述PCR反应的退火温度为58-64℃，优选为60℃。
优选地，所述构建文库反应中的退火温度为58-64℃，优选为60℃。
优选地，所述PCR反应进行32-37个循环(cycles)，优选地，进行35个循环(cycles)。
优选地，所述构建文库反应进行6-10个循环(cycles)，优选地，进行8个循环(cycles)。
第六方面，本发明提供了第三方面的引物组、第四方面的试剂盒在制备用于诊断GCK-MODY的试剂中的应用。
第七方面，本发明提供了用于在人群中扩增GCK基因和/或在人群中检测GCK基因突变的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)确定人群中GCK-MODY的发病率；
(2)根据以下公式计算混合的DNA样本数目：
-1/2+sqrt(1/4+1/a％)＜n<1/2+sqrt(1/4+1/a％)
其中，a％为发病率，n为混合的样本数目，sqrt表示求平方根的函数；
(3)将第(2)步确定的DNA样本数目的样本混合；
(4)利用引物组对步骤(3)获得的DNA混合样本进行PCR反应，使得扩增出GCK基因。
上述公式是根据成本最低化的原则获得的，假定每次基因检测所花费用为M，GCK-MODY在人群中的发病率为a％，每个混合样本中混合n个个体的样本，其中包括N个GCK-MODY患者，总成本的范围在NM/n+N*a％*M～NM/n+N*a％*n*M之间。成本最低的混合方案应满足以下条件：
NM/n+N*a％*n*M＜NM/(n-1)+N*a％*(n-1)*M
NM/n+nNM*a％＜NM/(n+1)+N*a％*(n+1)*M
糖尿病人群中GCK-MODY的发病率为约1.6％，自然人群中GCK-MODY的发病率为约0.1％。因此可以计算出糖尿病人群的混合样本数目为8人，自然人群的混合样本数目为32人。
在一些实施方案中，还包括对步骤(4)获得的扩增出的GCK基因进行测序的步骤。
所述的混合的DNA样本数目是同时在一次PCR反应中混合的样本的数目，是能够在一次PCR反应中检测的人数。
在一些实施方案中，利用表1的引物组或以下表2中的引物组对步骤(3)获得的DNA混合样本进行PCR反应。
以下表2中的引物组具有SEQ ID NO：45-66所示的核苷酸序列作为正向引物，以及与所述正向引物对应的具有SEQ ID NO：67-88所示的核苷酸序列作为反向引物。
表2
表1和表2所示的引物组均可实现在一次PCR反应中对GCK基因的10个外显子及其侧翼的50bp片段的区域进行扩增和检测，扩增片段的长度在150-299个bp之间。扩增出GCK基因的所有外显子及外显子侧翼的内含子，覆盖了具有临床意义的突变位点，实现了对GCK基因目标区域100％的富集和覆盖；简化了对序列突变的检测，因为引物组中每个引物对的特异性较好，扩增出的每个基因片段大小都不相同，分布在150-299bp的范围内，不会引起引物与模板的非特异性结合，扩增结果可以真实准确反应GCK基因的序列信息。
经血液和唾液样本的DNA进行验证，发现所述的引物组的平均特异性在90％以上，显示了所述引物组的较高特异性。
在一些实施方案中，所述方法的第(4)步骤还包括以下步骤：
(a)将表1的引物组或以下表2中的引物组与第(3)步的DNA混合样本相混合，进行PCR反应，获得扩增产物；
(b)对第(a)步获得的扩增产物进行纯化；
(c)对步骤(b)获得的纯化产物构建文库；
(d)对步骤(c)获得的文库进行纯化；
(e)对步骤(d)获得的纯化文库进行测序。
在一些实施方案中，所述测序为第二代测序。
优选地，所述对PCR反应的扩增产物和/或所构建的文库进行纯化包括采用磁珠进行纯化的步骤。
优选地，所述对PCR反应的扩增产物或所构建的文库进行纯化包括以下步骤：
(1)向扩增产物或所构建的文库中加入磁珠；
(2)用磁力架吸附步骤(1)的磁珠，直至溶液澄清后去除上清，保留磁珠；
(3)加入乙醇，用磁力架吸附磁珠以洗涤DNA；
(4)用磁力架吸附步骤(3)的磁珠，直至溶液澄清后去除上清；
(5)重复步骤(3)和(4)后，室温放置，直至乙醇完全挥发；
(6)加入无酶水溶解步骤(5)获得的磁珠上的DNA，用磁力架吸附磁珠，回收上清。
优选地，所述PCR反应的退火温度为58-64℃，优选为60℃。
优选地，所述构建文库反应中的退火温度为58-64℃，优选为60℃。
优选地，所述PCR反应进行32-37个循环(cycles)，优选地，进行35个循环(cycles)。
优选地，所述构建文库反应进行6-10个循环(cycles)，优选地，进行8个循环(cycles)。
上述方法用于疾病诊断治疗目的或非疾病诊断治疗目的。
DNA混合样本(Pooling)技术，也称作DNA混合池，是将提取的多个DNA样本混合在一起组成DNA文库，进行基因测序等后续研究，此技术的应用使大规模测序研究成本得到了解决，本发明通过构建数学模型获得了对大规模人群筛选单基因遗传病的基因测序根据成本原则计算混合的DNA样本数目的数学公式。
第二代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)，使得基因研究领域得到扩大，研究内容多样化，比如全基因组重测序、从头测序、转录组测序、外显子测序、表观遗传学。全基因组重测序，外显子测序和转录组测序可以实现与参考序列的比对分析，筛选出相关的易感基因突变位点，包括单核苷酸多态性、单核苷酸变异、插入缺失变异、拷贝数变异和结构变异，实现基因多态性分析、遗传进化分析以及致病和易感性基因等的筛查。
基因组覆盖度，是指测序获得的序列占整个目标序列的比例。如果基因组测序的覆盖度是98％，就意味着2％的序列区域未通过测序获得。覆盖度100％，就意味着所有的序列区域都通过测序获得。
附图说明
图1显示了利用表1的引物组扩增得到的GCK基因覆盖图；
图2显示了利用表1的引物组扩增得到的GCK基因的覆盖度；
图3显示了利用表2的引物组扩增得到的GCK基因的覆盖度；
图4显示了利用表2的引物组扩增的片段长度符合扩增的要求；
图5显示了对应于不同发病率的单基因遗传病的DNA混合样本数目的最优方案。
具体实施例
本申请基于GCK-MODY单基因遗传病，根据成本最低化的原则基于数学模型获得了采用DNA混合样本测序时混合的DNA样本数目的计算公式：
-1/2+sqrt(1/4+1/a％)＜n<1/2+sqrt(1/4+1/a％)
其中，a％为发病率，n为混合的样本数目，sqrt表示求平方根的函数。
可以看出所述公式仅与发病率相关，计算简单、方便，可以推广至所有发病率较低的单基因遗传病采用DNA混合样本测序时混合的DNA样本数目的计算和确定。
本申请利用表1和表2的引物组对510人的糖尿病人群和2548人的自然人群的GCK基因进行测序发现510人的糖尿病人群中8个人具有突变位点；2548人的自然人群中25个人具有突变位点。由此，计算出510人的糖尿病人群的GCK-MODY发病率为大约1.6％，2548人的自然人群的GCK-MODY发病率为大约0.1％，与现有技术中报道的糖尿病人群的GCK-MODY发病率为大约1.6％，自然人群的GCK-MODY发病率为大约0.1％相吻合。而且，如果不采用pooling策略，GCK基因检测平均每个人的花费约为120元。在自然人群中检测5000人的GCK基因时，如果在基因组水平进行10个样本pooling，每个人的平均花费约为31元；而根据上述数学模型计算所得最优的pooling size为32人，在基因组水平进行32个样本pooling时每个人的平均花费不超过26.5元。检测5000例糖尿病人群的GCK基因，在基因组水平进行10个样本pooling，每个人的平均花费在46元以下，而根据上述数学模型计算所得最优的pooling size为8人，每个人的平均花费不超过45.3元。因此，提示了结合目标人群的发病率及上述数学模型，计算最优的pooling方案，降低大样本人群中的检测成本。
采用本申请表1和表2的引物组结合DNA混合样本策略，对于临床上没有诊断方法，需要采用基因测序进行诊断的GCK-MODY糖尿病的诊断具有深远的意义，因为降低成本的基因测序可以实现对大规模人群，尤其是孕妇进行基因测序，将孕妇和胎儿的GCK-MODY糖尿病与I型或II型糖尿病区分开来。对于当胎儿未遗传到母亲的GCK突变时，需对孕妇进行胰岛素治疗，防止胎儿过度生长出现巨大儿，导致不良妊娠结局；当胎儿遗传到母亲的GCK突变时，则胎儿与母亲的葡萄糖感知能力处于同时上调状态，无需进行干预，避免使用胰岛素过度治疗导致的胎儿生长发育迟缓。
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
引物组设计以及利用所设计的引物组进行多重PCR扩增
1.引物设计
针对GCK基因10个外显子区域进行引物设计，共包含22对引物，引物的扩增片段长度在150-299之间，引物的具体信息参见表1和表2。
2.多重PCR扩增
1)将引物干粉用无酶水配制为100μM储存液(加入的无酶水的体积参照干粉合成后的说明)；
2)将每对引物储存液用无酶水稀释为10μM工作液；
3)配制Primer Panel Mix A和Primer Panel Mix B：GCK-1-1～GCK-1-11引物每管取5μl混合制备Primer Panel Mix A，GCK-2-1～GCK-2-11引物每管取5μl缓和制备Primer Panel Mix B；
4)按照表1所示的扩增体系将所需试剂混合，混匀离心后，进行PCR扩增反应，反应条件见下表3和表4：
表3：多重PCR扩增体系
| 试剂名称 | 体积/样本 |
| Phusion U Multiplex PCR Master Mix | 10μL |
| Primer Panel Mix A(or Primer Panel Mix B) | 1-3μL(均可) |
| DNA | 20ng |
| Milli-Q Water | Up to 20μL |
表4：多重PCR扩增条件
3.PCR产物纯化
1)第一步PCR扩增结束后，得到A、B两种扩增产物，将两者混合后的进行下述纯化步骤；
2)向混合的液体中加入50μL磁珠，充分混匀，室温静置5min；
3)用磁力架吸附磁珠2-5min，直至溶液澄清后小心去除上清，保留磁珠；
4)加入200μL 80％乙醇，用磁力架反复来回吸附磁珠洗涤DNA；
5)用磁力架吸附磁珠30s，直至溶液澄清后，小心去除上清，避免吸到磁珠；
6)重复步骤4-5；
7)室温放置8min，直至乙醇完全挥发；
8)加入10μl无酶水溶解磁珠上的DNA，室温静置5min后，用磁力架吸附磁珠，回收上清至新的EP管。
4.文库构建
表5：文库构建反应体系
| 试剂名称 | 体积/孔 |
| Phusion U Multiplex PCR Master Mix | 10μL |
| Barcode | 1μL |
| DNA(上一步PCR的产物) | 10μL |
| Milli-Q Water | Up to 20μL |
表6：文库构建反应条件
5.文库纯化
1)向PCR反应后的反应液中加入20μL磁珠，充分混匀，室温静置5min；
2)用磁力架吸附磁珠2-5min，直至溶液澄清后去除上清，保留磁珠；
3)加入200μL 80％乙醇，用磁力架反复来回吸附磁珠洗涤DNA；
4)用磁力架吸附磁珠30s，直至溶液澄清后，小心去除上清，避免吸到磁珠；
5)重复步骤4-5；
6)室温放置8min，直至乙醇完全挥发；
7)加入20μl无酶水溶解磁珠上的DNA，室温静置5min后，用磁力架吸附磁珠，回收上清至新的EP管；
8)测定文库浓度。
6.文库质检和上机测序
7.突变位点结果注释
实施例1利用表1的引物组进行PCR扩增
分别采用6例来自于血液和6例来自于唾液样本的DNA，利用表1的引物组进行扩增及测序，具体的特异性结果如下表7，其中血液样本和唾液样本的平均特异性分别为92.21％和91.25％。
表7：扩增体系特异性
| 样本编号 | 血液样本 | 样本编号 | 唾液样本 |
| A01 | 0.926421247 | A07 | 0.925325711 |
| A02 | 0.921028152 | A08 | 0.909607595 |
| A03 | 0.919981356 | A09 | 0.915062707 |
| A04 | 0.931412141 | A10 | 0.895322696 |
| A05 | 0.918928511 | A11 | 0.90819824 |
| A06 | 0.915019602 | A12 | 0.921748681 |
下表8和表9显示了扩增均衡度，是用每个扩增子扩增得到的reads数表征的。6例血液样本和6例唾液样本中，每个扩增子扩增得到的reads数以及平均值见下表8和表9：
表8：
表9：
采用表1的引物组获得的扩增片段长度参见下表10：
表10：
| 扩增子名称 | 扩增片段大小 | 扩增子名称 | 扩增片段大小 |
| T1P315 | 240 | T2P315 | 211 |
| T1P316 | 240 | T2P316 | 251 |
| T1P317 | 223 | T2P317 | 257 |
| T1P318 | 218 | T2P318 | 247 |
| T1P319 | 239 | T2P319 | 258 |
| T1P320 | 259 | T2P320 | 226 |
| T1P321 | 237 | T2P321 | 255 |
| T1P322 | 200 | T2P322 | 257 |
| T1P323 | 220 | T2P323 | 258 |
| T1P324 | 250 | T2P324 | 224 |
| T1P325 | 244 | T2P369 | 249 |
| T2P314 | 250 |
采用表1的引物组扩增得到的GCK基因如图1所示，其中灰色区域为GCK基因的外显子区，黄色部分为侧翼区50bp长度。
采用表1的引物组获得的GCK基因的覆盖度参见图2，其中显示了对GCK基因10个外显子的扩增情况，红色区域表示基因的外显子区，白色区域表示扩增引物区，可以看出，表1的引物组实现了对GCK基因外显子区100％的富集和覆盖。
实施例2利用表2的引物组进行PCR扩增
分别采用10例糖尿病患者的DNA，并采用表2的引物组对10例样本的DNA进行扩增、建库以及测序，其中每个样本对应的特异性参见下表11，10例样本的平均特异性为0.9。
表11：扩增体系特异性
| 样本编号 | 501 | 502 | 503 | 504 | 505 | 506 | 507 | 508 | 509 | 510 |
| 特异性 | 0.90 | 0.90 | 0.90 | 0.89 | 0.91 | 0.90 | 0.87 | 0.91 | 0.92 | 0.91 |
下表12显示了扩增均衡度，是用每个扩增子扩增得到的reads数表征的。10例样本中，每个扩增子扩增得到的reads数以及平均值见下表12：
表12：扩增均衡度
通过对10例样本的分析，证明该扩增体系具有良好的扩增特异性(>90％)，22对引物构成的扩增子中，具有良好的扩增均衡度。
采用表2的引物组获得的每个扩增子的片段长度参见下表13：
表13：
| 扩增子名称 | 扩增片段大小 | 扩增子名称 | 扩增片段大小 |
| GCK-1-1 | 272 | GCK-2-1 | 268 |
| GCK-1-2 | 268 | GCK-2-2 | 272 |
| GCK-1-3 | 231 | GCK-2-3 | 259 |
| GCK-1-4 | 257 | GCK-2-4 | 259 |
| GCK-1-5 | 273 | GCK-2-5 | 162 |
| GCK-1-6 | 261 | GCK-2-6 | 259 |
| GCK-1-7 | 148 | GCK-2-7 | 243 |
| GCK-1-8 | 225 | GCK-2-8 | 259 |
| GCK-1-9 | 266 | GCK-2-9 | 272 |
| GCK-1-10 | 273 | GCK-2-10 | 214 |
| GCK-1-11 | 270 | GCK-2-11 | 230 |
采用表2的引物组获得的GCK基因的覆盖度参见图3，其中显示了对GCK基因10个外显子的扩增情况，红色区域表示基因的外显子区，白色区域表示扩增引物区，可以看出，表2的引物组实现了对GCK基因外显子区100％的富集和覆盖。
图4显示了利用表2的引物组进行扩增时，每个扩增子的片段长度在148bp-272bp的范围内，符合扩增的要求。
实施例3DNA pooling法
每个混合样本中应混合的样本数(pool size)计算：
根据成本最低化的原则，每个混合样本中应混合的样本数根据患病率不同对应一种最优方案。假定每次基因检测所花费用为M，糖尿病在人群中的发病率为a％，每个混合样本中n个个体，其中包括N个糖尿病患者，总成本的范围在NM/n+N*a％*M～NM/n+N*a％*n*M之间。成本最低的混合方案应满足以下条件：
NM/n+N*a％*n*M＜NM/(n-1)+N*a％*(n-1)*M
NM/n+nNM*a％＜NM/(n+1)+N*a％*(n+1)*M
根据此数学模型，得到不同患病率对应的最优混合方案如图5所示，基于图5获得了如下所示的计算公式：
-1/2+sqrt(1/4+1/a％)＜n<1/2+sqrt(1/4+1/a％)，
其中，a％为发病率，n为混合的样本数目，sqrt表示求平方根的函数。
糖尿病人群中GCK-MODY的发病率为约1.6％，自然人群中GCK-MODY的发病率为约0.1％。因此可以计算出糖尿病人群的混合样本数目为8人，自然人群的混合样本数目为32人。
实施例4在糖尿病人群中利用表1或表2的引物组采用pooling策略进行GCK基因的测序
按照目前的市场测序价格行情，如果不采用pooling策略，GCK基因检测平均每个人的花费约为120元；检测5000例糖尿病人群的GCK基因，在基因组水平进行10个样本pooling，每个人的平均花费不超过46元；而根据上述数学模型计算所得最优的pooling数为8人，每个人的平均花费不超过45.3元。提示结合目标人群的发病率及实施例3的数学模型，利用所计算出的最优pooling方案，降低了大样本人群中的检测成本。而且因为pooling数为8人的成本低于pooling数为10人的成本，说明了样本混合数目的合理性，并且达到很好的检测效果，同时也说明了表1或表2引物组的特异性和灵敏度，以及扩增片段的覆盖度实现了GCK基因外显子区100％的富集和覆盖。
实施例5在自然人群中利用表1或表2的引物组采用pooling策略进行GCK基因的测序
按照目前的市场测序价格行情，如果不采用pooling策略，GCK基因检测平均每个人的花费约为120元；在自然人群中检测5000人的GCK基因时，如果在基因组水平进行10个样本pooling，每个人的平均花费约为31元；而根据上述数学模型计算所得最优的poolingsize为32人，在基因组水平进行32个样本pooling时每个人的平均花费不超过26.5元。并且达到很好的检测效果，同时说明了样本混合数目的合理性，以及表1或表2引物组的特异性和灵敏度，以及扩增片段的覆盖度实现了GCK基因外显子区100％的富集和覆盖。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 生物岛实验室
中国科学院大学
<120> 用于检测GCK-MODY基因突变的方法及其试剂盒
<130> P2020-1-0127.CN
<160> 88
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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cacgtgtggg gagcacttc 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 2
gggacgagaa gaggactacg a 21
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 5
atacctggac atagggcagg t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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cactcggtat tgacgcacat g 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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cattcaccat tgccaccaca tc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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gatggagtac atctggtgtt tggt 24
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
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atctccttct gcatccgtct ca 22
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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tggcaagacc cttctcaaag ag 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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gacaccccat tcctgttcct ac 22
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<211> 21
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<220>
<223> Forward Primer
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gatgaaggtg atctcgcagc t 21
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<220>
<223> Forward Primer
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<220>
<223> Forward Primer
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acaagcccat tatctgcaat gg 22
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<211> 21
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<220>
<223> Forward Primer
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<223> Forward Primer
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cattgttccc ttctgctcct ga 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> Forward Primer
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ggtatggggg ctacatttga ag 22
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<211> 19
<212> DNA
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<220>
<223> Forward Primer
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acctcccgtc aggactagc 19
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> Forward Primer
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cattgctccc caggagattc tg 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> Forward Primer
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ggcttggtga aagcgataag ag 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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cccccagcct tagttttggt a 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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gcttctcttc tgcccagctt c 21
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 24
tgtctacgcg cgctgc 16
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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aggacgggga tgcaaagg 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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gcaagtacat gggcgagct 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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ccaaagttgc tcccgtgatt g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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actgaagcaa cccaggtctt c 21
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> Reverse Primer
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gcatccttct caactggacc aa 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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gttgcagtgt ccctgaggaa ta 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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ctctttgtaa tatccgggct cagt 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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tgagaagatg ggtcatcctg ac 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 33
gaagccttgg atatttccac ttcag 25
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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ctctccatgc ccaacctaag at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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gttcccaagc tccaagattt cg 22
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<220>
<223> Reverse Primer
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ccctccctgg agaacgaga 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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gctacatgga ggagatgcag aa 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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actgcctgcc tttctccttg 20
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<212> DNA
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<220>
<223> Reverse Primer
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gactcagccc tgcagaaata tga 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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accatggcgt gcatcttcc 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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gacacacttc tctctgtgcc tt 22
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 42
tgcaggagga ggacctgaag 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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ctctgtactg atggctccac at 22
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<212> DNA
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<220>
<223> Reverse Primer
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aaggctacag catgtgctag g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Forward Primer
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gtagacacgc tctcgcaggc 20
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<212> DNA
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<220>
<223> Forward Primer
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atgtacttgc cacctatgag cttct 25
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<223> Forward Primer
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ggtcatactc cagcaggaac tcg 23
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<212> DNA
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<220>
<223> Forward Primer
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cttacccacg atcatgccga c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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gccagaatta gctaatgtga tgcttc 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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cttgtccagg aagtcggaga tgc 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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gagtacatct ggtgtttggt cttca 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 52
catccgtctc atcaccttct tca 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 54
tgtgcataaa atcagattct gaggct 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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cctcattcca agccatacag tagtg 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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cacgtgtggg gagcacttcc 20
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<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> Forward Primer
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ctacgaaatc ttggagcttg ggaac 25
<210> 58
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<212> DNA
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<220>
<223> Forward Primer
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cgccctgaga ccaagtctgc 20
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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aaaaacaagc ccattatctg caatgg 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Forward Primer
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acatcaccgg ttgttaagta gtttgg 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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ctcacccctc tccgtttgat agc 23
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 62
tttgaatcca gatctccctt ctgagc 26
<210> 63
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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cctcccgtca ggactagctg 20
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<212> DNA
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<220>
<223> Forward Primer
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tggctgtgag tctgggagtg 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
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cagccttagt tttggtaatc tgcaaa 26
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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catttctcca gagaggggtc 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> Reverse Primer
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
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<223> Reverse Primer
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acaagcatca gatgaaacac aaga 24
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<211> 23
<212> DNA
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tgttgcagtg tccctgagga ata 23
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tccctcctcc tctttgtaat atcc 24
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<220>
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<220>
<223> Reverse Primer
<400> 81
tacatggagg agatgcagaa tgt 23
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 82
atgatctcct gctactacga agac 24
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 83
tcccaaaacc tctcaaagct atgg 24
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 84
tcttccagct cttcgactac atct 24
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 85
aggctgacac acttctctct g 21
<210> 86
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 86
tccccctccc tgtgcag 17
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 87
aggtcagatg gaacctcttc ttc 23
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 88
cttacgctcc aaggctacag 20
Claims (15)
1.用于确定GCK-MODY单基因遗传病进行GCK基因检测的DNA混合样本数目的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)确定人群中GCK-MODY单基因遗传病的发病率；以及
(2)根据以下公式计算混合的DNA样本数目：
-1/2+sqrt(1/4+1/a％)＜n<1/2+sqrt(1/4+1/a％)
其中，a％为发病率，n为混合的样本数目，sqrt表示求平方根的函数。
2.用于在人群中扩增GCK-MODY单基因遗传病的GCK基因和/或在人群中检测GCK-MODY单基因遗传病的GCK基因突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)确定人群中GCK-MODY单基因遗传病的发病率；
(2)根据以下公式计算混合的DNA样本数目：
-1/2+sqrt(1/4+1/a％)＜n<1/2+sqrt(1/4+1/a％)，
其中，a％为发病率，n为混合的样本数目，sqrt表示求平方根的函数；
(3)将第(2)步确定的DNA样本数目的样本混合；
(4)利用引物组对步骤(3)获得的DNA混合样本进行PCR反应，从而扩增出GCK-MODY单基因遗传病的GCK基因作为扩增产物，
所述方法为非诊断目的。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于利用SEQ ID NO：1-22所示的核苷酸序列作为正向引物，以及SEQ ID NO：23-44所示的核苷酸序列作为反向引物；或利用SEQ ID NO：45-66所示的核苷酸序列作为正向引物，以及SEQ ID NO：67-88所示的核苷酸序列作为反向引物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法还包括以下步骤：
(a)对第(4)步获得的扩增产物进行纯化；
(b)对步骤(a)获得的纯化产物构建文库；
(c)对步骤(b)获得的文库进行纯化；以及
(d)对步骤(c)获得的纯化文库进行测序。
5.根据权利要求4所述的方法，其中：所述测序为第二代测序。
6.根据权利要求4所述的方法，其中：采用磁珠进行纯化。
7.根据权利要求4所述的方法，其中：所述PCR反应的退火温度为58-64℃。
8.根据权利要求4所述的方法，其中：所述PCR反应的退火温度为60℃。
9.根据权利要求4所述的方法，其中：所述构建文库反应中的退火温度为58-64℃。
10.根据权利要求4所述的方法，其中：所述构建文库反应中的退火温度为60℃。
11.根据权利要求4所述的方法，其中：所述PCR反应进行32-37个循环。
12.根据权利要求4所述的方法，其中：所述PCR反应进行35个循环。
13.根据权利要求4所述的方法，其中：所述构建文库反应进行6-10个循环。
14.根据权利要求4所述的方法，其中：所述构建文库反应进行8个循环。
15.根据权利要求4所述的方法，其中：在测序之前还包括测定文库浓度的步骤和/或文库质检的步骤。
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