CN112779178A - 地衣芽孢杆菌a6菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A6菌株及其应用。A6菌株具耐碱性，可在碱性条件下生长并分泌蛋白酶。该菌株可用于几丁质生物质的发酵，获得具降低的蛋白质及/或矿物质含量的经降解的几丁质生物质及经发酵的培养基。

Description

地衣芽孢杆菌A6菌株及其应用

技术领域

本发明提供一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A6菌株及其应用。具体而言，该菌株具耐碱性，可在碱性条件下生长并分泌蛋白酶，可用于进行几丁质生物质的发酵，获得具降低的蛋白质及/或矿物质含量的经降解的几丁质生物质及经发酵的培养基。

背景技术

几丁质(chitin)，是广泛存在于自然界的含氮多醣生物性聚合物，分布于节肢动物外部骨骼、软件动物内骨格、以及真菌、藻类细胞壁。几丁质及其衍生物，包括几丁聚醣(chitosan)，具生物兼容性及多种生物活性，应用广泛，包括：食品工业、医药、制药、农业、纺织、化妆品、饲料等领域。

在自然状态下，几丁质通常与其他非几丁质成分，例如，蛋白质、无机盐类(如，碳酸钙或其它矿物质)、脂质、色素等，结合成一种构造相当复杂的错合物。因此，从含有几丁质的天然原料萃取出几丁质，须依序将其他成分予以去除。目前几丁质与几丁聚醣的生产，主要以海洋甲壳类动物(如，虾、蟹)的外壳为原料，以化学法达成，包括强碱处理(例如，NaOH，1M，1-72小时，65-100℃)，以去除蛋白质及脂质，以及强酸处理(例如，HCl，0.275-2M，1-48小时，RT-100℃)，以去除矿物质。化学法需要高浓度的酸碱及大量水清洗，成本高、危险性高且会造成环境严重污染；又如此极端的条件可能导致所得的几丁质结构受到影响，且从原料去除下来的蛋白质、脂质及矿物质等，因存在强酸强碱成分，难以再利用。另一种方法是微生物发酵法，利用微生物发酵产生酸及蛋白酶，以去除矿物质及蛋白质。常见的微生物包括乳酸菌(LAB)，例如，乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)及乳酸球菌(Lactococcusspp.)等，以及非乳酸菌(non-LAB)，例如，枯草杆菌属(Bacillus spp.)，诸如，枯草杆菌(Bacillus subtilis)及仙人掌杆菌(Bacillus cereus)等。一般微生物发酵至少需要含碳源及氮源的培养基，供微生物生长，以及需将培养基予以高温高压灭菌后再进行微生物接种，增加了工业化的限制。又，传统微生物发酵后，发酵液的酸碱值偏酸，一般须再以碱(例如，碳酸钠或碳酸氢钠)中和，才能再利用。

发明内容

本发明提供一种耐碱性地衣芽孢杆菌A6菌株及其应用。

在一方面，本发明提供一种耐碱性地衣芽孢杆菌A6菌株。本发明的A6菌株从土让中分离，具耐碱性，经鉴定为地衣芽孢杆菌。该菌株已于2018年7月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心)，寄存编号为M2018501。

在另一方面，本发明提供一种利用A6菌株的发酵以降解几丁质生物质的方法。

具体而言，本发明的方法包括：以A6菌株在含有几丁质生物质的培养基中进行发酵，其中，该几丁质生物质包括几丁质及含蛋白质的非几丁质成分，该发酵在碱性条件下进行，其容许A6菌株生长并分泌蛋白酶，以降解该几丁质生物质的含蛋白质的非几丁质成分，获得发酵后产物，所述发酵后产物含有经降解的几丁质生物质及经发酵的培养基。

在部分具体实施例中，可视需要地，自该发酵后产物回收该经降解的几丁质生物质及/或经发酵的培养基。

在部分具体实施例中，所述的几丁质生物质包括海洋甲壳类动物的外壳、海洋软件动物的内壳、及/或昆虫的虫体及/或蛹壳。在一特定具体实施例中，所述的几丁质生物质是黑水虻蛹壳。

在部分具体实施例中，在发酵前，所述的几丁质生物质经切碎、研磨及/或灭菌处理，然后与含碳源的水溶液混合，形成该培养基。

在部分具体实施例中，该发酵于35℃至37℃、pH7.0以上至11及好氧环境下进行3至15日。

在部分具体实施例中，该经降解的几丁质生物质进一步予以脱色处理、及/或去乙酰化处理，以获得几丁聚醣。

特定而言，本发明提供一种从黑水虻萃取几丁质的方法，其包括：

(a)提供黑水虻蛹壳，加入至碱性含碳源的培养液；

(b)将A6菌株接种于该培养液中进行发酵，其中该发酵于35℃至37℃、pH7.0以上至11及好氧环境下进行3至15日；以及

(c)收集发酵残渣，获得经分离的几丁质。

在又一方面，本发明提供一种所述的A6菌株用于降解几丁质生物质及获得经分离的基丁质的用途。

在更一方面，本发明提供一种发酵组合物，其包括如所述的发酵后产物或自该发酵后产物回收的经发酵的培养基。

本发明之一或多个具体实施例的详述列于下方的说明中。本发明的其他特征或优势可由下列数个具体实施例的详细说明及所附的主张而更臻清楚。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前面的概述以及以下对本发明的详细描述。为了说明本发明，在附图中示出了目前较佳的实施例。然而，应该理解的是，本发明不限于所示的精确布置和手段。

在附图中：

图1显示A6菌株具有长度为1,410bp的16S rDNA序列(SEQ ID NO:3)。

具体实施方式

除非另有定义，本文所使用的技术性及科学性术语具有本发明领域的技术人员所能常规理解的意义。本文所使用的冠词“一”与“一者”是指一个或多于一个(亦即，至少一者)的该冠词语法对象。举例而言，“一组件”是指一个组件或多于一个的组件。本文所使用的“包含”或“包含有”等词通常用于包括/涵盖意指允许存在一或多个特征、成分、或组分的意义。“包含”或“包含有”等词涵盖“组成”或“由～组成”等词。本文中使用的“约”或“近似”等词意指本领域普通技术人员理解的可接受偏差程度，其可在一定程度上根据文中的使用而变化。一般而言，例如，“约”或“近似”可指引用值附近±10％、±5％、或±3％范围的数值。

本文所描述的“几丁质(chitin)”是一种主要由N-乙酰化葡糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)单体单元组成的碳水化合物聚合物。本文所描述的“几丁质生物质(chitinous biomass)”是指含有几丁质的天然生物来源。几丁质存在于许多种类的基丁质生物质中，例如，节肢动物的骨架或壳、软件动物内骨格、真菌、藻类细胞壁等。在天然状态下，几丁质通常非以纯化或分离的形式存在，而是与非几丁质成分，主要是蛋白质及矿物质，例如，碳酸钙及磷酸钙等无机盐，连结合在一起。海洋甲壳类(如虾、蟹)壳的几丁质含量较高，占约30～55％(w/w)，蛋白质占约15～29％(w/w)及矿物质占约33～55％(w/w)；昆虫的蛹壳含有几丁质占约25～33％(w/w)，蛋白质占约55-62％(w/w)及矿物质占约8～10％(w/w)。

本文所描述的“几丁聚醣(chitosan)”是一种主要由D-葡糖胺的单体单元组成的碳水化合物聚合物。几丁质与几丁聚醣的区别主要在于乙酰化程度。几丁质具高度乙酰化，几丁聚醣则为高度去乙酰化。具体而言，几丁聚醣的去乙酰化程度大于50％、60％、70％、80％、85％、90％、或95％。几丁质的乙酰化可由本领域已知的方式进行，例如，高温强碱处理。

本文所描述的“降解(digest)”几丁质生物质是指，天然形式的几丁质生物质经处理以去除非几丁质成分，也就是将天然形式的几丁质生物质中的几丁质部分与非几丁质成分(主要是蛋白质及矿物质)予以分离，使得经处理后的几丁质生物质含有含量较低的非几丁质成分。本文所描述的经降解的几丁质生物质含有“含量较低”的非几丁质成分，意旨相较于未经处理或处理前的天然形式的几丁质生物质而言，经降解的几丁质生物质所含有的非几丁质成分的含量降低，例如，减少50％、60％、70％、80％、90％或以上(以重量计)。另一方面，本文所描述的经降解的几丁质生物质亦可表示经分离或经纯化的几丁质。在本发明中，当以“分离”或“纯化”描述几丁质时，其应理解为非绝对的分离或纯化，而是相对的分离或纯化。举例而言，经分离的几丁质是指相较于其天然存在形式而言，纯度较高。在部分具体实施例中，经分离的几丁质实质上不含非几丁质成分，意指经分离的几丁质含有小于(以重量计)30％(例如，小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于3％)的非几丁质成分(主要是蛋白质及矿物质)，几丁质成分大于(以重量计)70％(例如，大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％)。

本文所描述的“发酵”是指有机物经微生物在厌氧条件下生长产生的酶的作用而予以分解，产生更简单的有机分解产物。可以理解的是，此处所描述的厌氧条件，并非严格的或绝对的厌氧条件，因为发酵也会有氧情况下发生。

本文所描述的“碱性条件”是指pH不小于7的情况，例如，pH7.0以上至11。可使用此领域习知的碱性试剂调整溶液或培养基至所需的pH值，包括但不限于氢氧化钾(KOH)、氢氧化钠(NaOH)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、或其任何组合。

本文所描述的“培养基”是指供微生物生长或发酵的培养基。具体而言，培养基含有碳源，例如，葡萄糖、麦芽糖、蔗糖及乳糖中的一种或多种。可视需要地，培养基尚可添加氮源，例如，蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、硝酸铵、尿素及大豆粉中的一种或多种，微量元素、矿物盐及/或其他可能的营养成分等。

本发明从台湾苗栗土壤，使用碱性TSB琼脂培养基，分离菌株。在碱性条件下，仅形成少数菌落。挑选单一菌落进行纯化，再将纯化后的菌落接种于含有昆虫蛹壳的碱性(约pH10)葡萄糖水溶液进行发酵，基于耐碱性及蛋白酶活性，筛选出A6菌株。A6菌株已于2018年7月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心)，寄存编号为M2018501。

本发明的A6菌株具以下特征：革兰氏阳性，好氧菌，杆菌，能运动，在TSB琼脂培养基上的菌落呈现乳白色且黏稠，可于35-37℃生长，至少可耐受pH 11.0的碱性环境，且可分泌蛋白酶。进一步进行16S rDNA序列分析，结果如图1及表1(实施例1)所示。综合鉴定结果，A6菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

本发明的A6菌株具耐碱性，可在碱性条件下生长并分泌蛋白酶，故可应用于降解几丁质生物质，以萃取出几丁质。

因此，本发明提供A6菌株用于降解几丁质生物质及获得经分离的基丁质的用途。本发明也提供一种利用A6菌株的发酵以降解几丁质生物质的方法。

具体而言，本发明的方法包括：以A6菌株在含有该几丁质生物质的培养基中进行发酵，该发酵在碱性条件下进行，其容许A6菌株生长并分泌蛋白酶，以降解该几丁质生物质的非几丁质成分，获得发酵后产物，所述发酵后产物含有经降解的几丁质生物质(即，经纯化或分离的几丁质)及经发酵的培养基。

在部分具体实施例中，所述的几丁质生物质包括海洋甲壳类动物(如，虾、蟹、龙虾、小龙虾)的外壳、海洋软件动物(乌贼、鱿鱼)的内壳、及/或昆虫(如，甲虫、蝗虫、黑水虻)的虫体及/或蛹壳。较佳地，几丁质生物质经清洗、切碎、研磨、干燥及/或灭菌处理。在特定实例中，海洋甲壳类动物(如，虾、蟹)的外壳经清洗后干燥及研磨，大小约5至50目左右。在另一特定实例中，昆虫蛹壳经清洗后干燥及打碎，大小约0.1至1公分。更佳地，几丁质生物质可经碱液处理(例如，浸泡于碱性水溶液，如NaOH，pH 10)，可初步去除蛋白质，也可达初步灭菌效果。

在部分具体实施例中，所述的培养基包含选自由葡萄糖、麦芽糖、蔗糖及乳糖所组成者的至少一种或多种的碳源。在特定实例中，所述的培养基为葡萄糖水溶液，浓度可视需要调整，可为1-10％(w/v，g/ml)，例如，1-5％(w/v，g/ml)、1-3％(w/v，g/ml)。

在部分具体实施例中，几丁质生物质与培养基的比例可为1：5至1：100(w/v，g/ml)，例如，1：5至1：70(w/v，g/ml)、1：5至1：50(w/v，g/ml)、1：5至1：30(w/v，g/ml)。

根据本发明，发酵在碱性条件下进行，例如，pH7.0以上至11。在部分具体实施例中，所述的培养基调整为具有7.0以上至11的pH值以进行发酵，例如，pH 9.5-10.5，更特定为pH 10.0。本发明的方法的特点之一在于，A6菌株具耐碱性，可在碱性条件下生长。因此，培养基调整为碱性pH之后可不经额外灭菌处理，即可直接接种A6菌株进行发酵，A6菌株在碱性条件下生长会自然形成优势菌，其它微生物多数无法在碱性条件下生长，故可避免污染问题，同时简化发酵流程，更适合大规模工业应用。

发酵可在允许A6菌株于此处所述的培养基发酵的条件下进行，例如，25-40℃(例如，25-30℃、25-35℃、30-40℃、或35-37℃)，达适当的一段时间(例如，2-15天、3-15天、或3-10天)。较佳地，在进行微生物发酵前，可先将菌种培养隔夜形成种子液，再将种子液加入发酵培养基进行发酵。典型地，种子液的细菌浓度达10⁶-10⁸CFU/ml，例如，约10⁷CFU/ml。可视需要地，发酵过程可进行搅拌、震荡以促进微生物生长。

完成发酵后，可获得发酵后产物，其包括经降解的几丁质生物质及经发酵的培养基。在部分具体实施例，进一步可自所得的发酵后产物，分别回收该经降解的几丁质生物质及经发酵的培养基。回收可通过本领域习知的方法达成，例如，离心或过滤。回收所得的经降解的几丁质生物质(发酵残渣部分)具降低的蛋白质及矿物质含量，表示A6菌株不但可降解几丁质生物质的蛋白质成份，也可去除几丁质生物质的矿物质成份。回收所得的经降解的几丁质生物质可视为经分离或经纯化的几丁质，典型地，其中的非几丁质成分(主要是蛋白质及矿物质)小于30％(w/w)(基于全部几丁质生物质的总重，以重量计)，几丁质部分占70％(w/w)以上(基于全部几丁质生物质的总重，以重量计)。

在一特定具体实施例中，所述的几丁质生物质是黑水虻蛹壳。黑水虻是完全变态类拟态似蜂的昆虫，成虫的外型呈亮黑色，寿命仅5到7天，幼虫以有机资源物为食，由于成虫不取食，不会与人类竞争食物和有限的土地资源，且生产成本低廉又不易腐败，是极具潜力的昆虫源几丁质原料。具体而言，本发明从黑水虻萃取几丁质的方法包括：(a)提供黑水虻蛹壳，加入至碱性含碳源的培养液；(b)将A6菌株接种于该培养液中进行发酵，其中该发酵于35℃至37℃、pH7.0以上至11及好氧环境下进行3至15日；以及(c)收集发酵残渣，获得经分离的几丁质。

在部分具体实施例中，回收所得的经降解的几丁质生物质可进一步予以清洗及/或脱色处理(例如，以小苏打(NaHCO₃)或过氧化氢(H₂O₂)脱色)。在部分具体实施例中，回收所得的经降解的几丁质生物质可进一步予以乙酰化处理(例如，热碱处理)，以获得几丁聚醣。此外，在部分具体实施例中，发酵造成培养基酸化，使得回收所得的经发酵的培养基相较于发酵前的酸碱值约降低1-2个pH，例如，发酵前的酸碱值为pH10，则发酵后的酸碱值约pH8。发酵液无需特别调整酸碱值，可作为微生物肥料或饲料添加物的使用。在部分具体实施例中，回收所得的经发酵的培养基含有多肽、胺基酸、碳水化合物、蛋白酶等有机成分。在应用上，所得的发酵后产物或从该发酵后产物回收的经发酵的培养基可作为微生物肥料。在部分具体实施例中，所得的发酵后产物或从该发酵后产物回收的经发酵的培养基，尚可视需要予以其他处理，包括但不限于灭菌、过滤、浓缩、冻干或其任何组合。在部分具体实施例中，回收所得的经发酵的培养基，可作为饲料添加物。

因此，本发明尚提供一种发酵组合物，其包括如本文所描述的以A6菌株与几丁质生物质进行微生物发酵获得的发酵后产物，或去除发酵残渣部分的经发酵的培养基。

在部分具体实施例中，本发明的发酵组合物可作为微生物肥料。特定而言，所述的发酵后产物或经发酵的培养基可与其它肥料微生物(例如，固氮菌、根瘤菌)或有机肥料(例如，绿肥、泥碳)混合在一起。

在部分具体实施例中，本发明的发酵组合物可作为饲料。特定而言，所述的发酵后产物或经发酵的培养基可与饲料载体(例如，玉米粉、稻谷、麦类、高粱类、豆粕)混合在一起。

透过以下实施例进一步说明本发明，提供这些实施例是为了说明而非限制。根据本发明的内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神与范围的情况下，可以对所公开的特定具体实施例进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。

实施例1：地衣芽孢杆菌A6的分离及鉴定

采集台湾苗栗土壤，将土壤悬浮在无菌生理盐水溶液中，以50℃热处理约30分钟。将经热处理的溶液的上清液适当稀释并涂布于TSB琼脂培养基(配方：胰蛋白胨(tryptone)、大豆蛋白胨(soytone)2.5克、葡萄糖(glucose)2.5克、K₂HPO₄ 2.5克、NaCl 5.0克、洋菜(agar)15克，加蒸馏水至1.0公升，酸碱值调整至pH10，经高温灭菌后使用)，在35℃条件下培养3天，以形成菌落。将不同菌株接种于含有黑水虻蛹壳粉末的碱性(约pH 10)葡萄糖水溶液进行发酵。结果显示，大多数菌株无法正常生长，挑选出耐碱菌株且发酵后水解蛋白效率较高者，命名为A6菌株。

A6菌株接种于TSB琼脂培养基，在35℃、好氧条件下培养24小时，可形成菌落。菌落呈现乳白色且黏稠。以革兰氏染剂染色，显示该菌株为革兰氏阳性。以显微镜观察，显示该菌株为杆菌，能运动。

此外，进行A6菌株的遗传学特征鉴定。抽取A6菌株的基因组DNA作为模版，加入16S核糖体DNA(16S rDNA)正反引子(16S-27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO:1)及1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO:2))、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs等试剂，进行16S rDNA序列的PCR扩增。PCR反应结束后，以琼脂胶体电泳分析PCR产物，再将含有预测大小的PCR产物片段的胶体切下纯化。随后进行定序，结果显示，A6菌株具有长度为1,410bp的16S rDNA序列(SEQ ID NO:3)(图1)。以美国国家生物技术信息中心(NCBI)16S核糖体RNA(16s RNA)数据库与目前已知序列进行同源比对。比对结果显示，A6菌株与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的序列最为接近，相同度达99％以上。

表1：比对结果

根据上述形态、生理生化特征与遗传学特征，将A6菌株鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A6菌株，已于2018年7月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心)，寄存编号为M2018501。

实施例2：以A6菌株发酵从黑水虻蛹壳萃取几丁质

收集黑水虻蛹壳，将之打碎，大约0.1-1cm。取黑水虻蛹壳碎末20g，加入至300mL碱性水溶液(NaOH，pH 10)，以121℃灭菌30分钟。取出灭菌后的黑水虻蛹壳碎末，加入600mL的1％(w/v)碱性葡萄糖水溶液中(蛹壳(g)：葡萄糖水溶液(mL)＝1：30，pH 10)，形成含有黑水虻蛹壳碎末的碱性葡萄糖水溶液，供后续接种菌株进行发酵(因在碱性条件下，多数菌无法存活，故该含有黑水虻蛹壳碎末的碱性葡萄糖水溶液于发酵前无需进行高温高压灭菌)。

另一方面，取得A6菌株，接种于碱性TSB培养液(pH 10)，震荡培养约24小时至菌液浓度达10⁷CFU/mL，作为种子液。接种10％A6菌株种子液(约60mL)至上述含有黑水虻蛹壳碎末的碱性葡萄糖水溶液，于37℃以200rpm震荡培养，进行微生物发酵。

经10天发酵，将发酵产物予以过滤或离心，分别获得固体(蛹壳)部分及发酵液部分。固体(蛹壳)部分以清水洗净，获得去除大部份蛋白质与矿物质的几丁质，经分析其去蛋白质率为78％，去灰质率为89.7％，所含几丁质比例可达70％或更高(基于蛹壳总重)，回收比例大约是25～33％。所得的几丁质产物进一步以小苏打(碳酸氢钠，NaHCO₃)或过氧化氢(H₂O₂)脱色(依比例1:30(w:v)加入蛹壳及去离子水，再加入0.1％的十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、0.5％NaHCO₃，待完全溶解后，加入H₂O₂至最终浓度4％进行漂白，并以NaOH调至pH11，以加热板加热至75℃)，或以碱处理进行去乙酰化反应(依比例1:40(w:v)加入蛹壳及50％NaOH，进行高温121℃作用5小时，过滤去除碱液并冲洗，再重复去乙酰化反应一次，再过滤去除碱液并冲洗至中性后烘干)。获得几丁聚醣产物，其经分析生菌量低于标准值。另一方面，发酵液部分，经检测pH经发酵后降至约8，含有多肽、胺基酸、碳水化合物、蛋白酶等有机成分。

实施例2：比较分析

本发明的方法以A6菌株发酵从黑水虻蛹壳萃取几丁质，经比较发现，效率优于以传统化学萃取法(酸碱处理)，其他菌株因无法在碱性环境下生长，水解蛋白质效率明显不佳。表2显示比较结果。

表2

注1.干重：分别是发酵前和发酵后的黑水虻蛹壳的粉末干燥的重量

注2.去蛋白率＝【(未发酵的蛹壳的原始重(kg)x未发酵的粗蛋白％)-(发酵后蛹壳的原始重(kg)x发酵后的粗蛋白％)】/(未发酵的蛹壳的原始重(kg)x未发酵的粗蛋白％)x100％

注3.去矿物质率(去灰质率)＝【(未发酵的蛹壳的原始重(kg)x未发酵的粗灰分％)-(发酵后蛹壳的原始重(kg)x发酵后的粗灰分％)】/(未发酵的蛹壳的原始重(kg)x未发酵的粗灰分％)x100％

如表2所示，传统化学萃取方法或其他菌株在碱性条件下进行的微生物发酵法的去蛋白率低于40％，去灰质率低于80％。相较之下，本发明的方法以A6菌株在碱性条件下发酵萃取几丁质，可达去蛋白效率77.71％，去灰质率为89.7％，明显较佳。

此外，分别以传统化学酸碱处理法及本发明的微生物发酵法，从黑水虻蛹壳萃取几丁质。在传统化学酸碱处理法中，将约6.7kg黑水虻蛹壳粉末，使用盐酸约2.2kg进行酸处理，以及使用氢氧化钠约10.05kg进行热碱处理(100℃，1当量浓度)，最后以大量(至少约15倍体积)清水冲洗(产生碱液污染)，可得约1kg几丁质产物。相较之下，在本发明的微生物发酵法中，以A6菌株发酵从黑水虻蛹壳萃取几丁质，以最终获得约1kg几丁质产物而言，仅需使用氢氧化钠约54g，用以维持微生物发酵所需碱性条件，用量远低于化学酸碱处理法。又，本发明的微生物发酵同时达到去蛋白及去矿物质的效果(无须再进行酸处理)，发酵完成后，仅需简单冲洗固体(蛹壳)部分，即可获得去除大部份蛋白质与矿物质的几丁质；同时，发酵后酸碱值下降至约pH8.0，发酵液无需特别调整酸碱值，可作为微生物肥料或饲料添加物的使用。

表3

*以取得约1kg几丁质产物计。

于本说明书实施例揭示的内容，本发明所属领域技术人员可明显得知前述实施例仅为例示而非限制；本发明所属技术领域技术人员可通过诸多变换、替换而实施，并不与本发明的技术特征有所差异。依据说明书实施例，本发明可有多种变换仍无碍于实施。本说明书提供的权利要求界定本发明的范围，该范围涵盖前述方法与结构及与其相等的发明。

序列信息细菌27F即1492R 16S rDNA基因区域的PCR增幅序列引子：530F及805R

数据库：NCBI 16S核醣体RNA序列

16S rDNA全长序列

TCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAATACATGCAAGTCGAGCGGACCGACGGGAGCTTGCTCCTTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTCAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAG TTTGTA

生物材料寄存

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A6菌株，已于2018年7月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心)，寄存编号为M2018501。

序列表

<110> 财团法人农业科技研究院

<120> 地衣芽孢杆菌A6菌株及其应用

<130> ATI0026CN

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16S-27F 引子

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1492R 引子

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1410

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)

<400> 3

tcaggacgaa cgctggcggc gtgcttaata catgcaagtc gagcggaccg acgggagctt 60

gctcctttag gtcagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg 120

ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatgcttga ttgaaccgca tggttcaatc 180

ataaaaggtg gctttcagct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt 240

gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac 300

tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg 360

gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaaactc 420

tgttgttagg gaagaacaag taccgttcga atagggcggt accttgacgg tacctaacca 480

gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 540

cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc 600

ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga 660

attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac 720

tctctggtct gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac 780

cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gagggtttcc gccctttagt 840

gctgcagcaa acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa 900

aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 960

agaaccttac caggtcttga catcctctga caaccctaga gatagggctt ccccttcggg 1020

ggcagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080

tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt 1140

gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1200

acctgggcta cacacgtgct acaatgggca gaacaaaggg cagcgaagcc gcgaggctaa 1260

gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc 1320

tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1380

acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta 1410

Claims (10)

1.一种分离的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A6菌株，寄存于中国典型培养物保藏中心，寄存编号为M2018501。

2.一种降解几丁质生物质的方法，该几丁质生物质包括几丁质及含蛋白质的非几丁质成分，其包括：

以A6菌株在含有该几丁质生物质的培养基中进行发酵，该发酵在碱性条件下进行，其容许A6菌株生长并分泌蛋白酶，以降解该几丁质生物质的含蛋白质的非几丁质成分，获得发酵后产物，所述发酵后产物含有经降解的几丁质生物质及经发酵的培养基；以及

可视需要地，自该发酵后产物回收该经降解的几丁质生物质及/或经发酵的培养基。

3.如权利要求2的方法，其中该几丁质生物质包括海洋甲壳类动物的外壳、海洋软件动物的内壳、及/或昆虫的虫体及/或蛹壳。

4.如权利要求3的方法，其中该昆虫为黑水虻。

5.如权利要求2的方法，其中在发酵前，该几丁质生物质经切碎、研磨及/或灭菌处理，然后与含碳源的水溶液混合，形成该培养基。

6.如权利要求2的方法，其中该发酵于35℃至37℃、pH7.0以上至11及好氧环境下进行3至15日。

7.如权利要求2的方法，其进一步包括：将回收的经降解的几丁质生物质予以脱色处理、及/或去乙酰化处理，以获得几丁聚醣。

8.一种从黑水虻萃取几丁质的方法，其包括：

(a)提供黑水虻蛹壳，加入至碱性含碳源的培养液；

(b)将A6菌株接种于该培养液中进行发酵，其中该发酵于35℃至37℃、pH7.0以上至11及好氧环境下进行3至15日；以及

(c)收集发酵残渣，获得经分离的几丁质。

9.一种如权利要求1所述的A6菌株用于降解几丁质生物质及获得经分离的基丁质的用途。

10.一种发酵组合物，其包括如权利要求2所述的发酵后产物或自该发酵后产物回收的经发酵的培养基。

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