CN112774645B - 一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠及其制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠及其制备方法及其用途，磷脂微珠的配方按照质量份数包括：32‑36份琼脂，20‑24份明胶，26‑30份磷脂酰胆碱，28‑32份磁粉，6‑10份聚乙二醇单甲醚；制备方法，包括：配置琼脂‑明胶混合溶液；在乙醇中加入磷脂酰胆碱、聚乙二醇单甲醚表面活性剂搅拌混合；将琼脂‑明胶混合溶液加入有机溶剂后与表面活性剂混合后再加入磁粉，搅拌、加冰水，得到磷脂微珠；本发明的磷脂微珠对核酸的吸附力均匀，且吸附能力强，增加了核酸与核酸之间、核酸与细胞因子之间的接触机会，可应用于基于人工抗原呈递细胞的T细胞扩增，能够增加扩增量和质量。

Description

一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠及其制备方法及其 用途
技术领域
本发明涉及生物材料领域，特别是一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠及其制备方法 及其用途。
背景技术
在正常的免疫反应中，抗原特异性T细胞需要至少两个信号的刺激才能进行增殖并对抗 原产生免疫应答。第一信号来自TCR识别MHC/抗原肽复合物，传递抗原特异性识别信号； 第二信号由抗原呈递细胞(APC)的共刺激分子提供，为非特异性协同刺激信号。在和APC识 别结合的过程中，多种跨膜分子聚集在富含神经鞘磷脂和胆固醇的“筏”状结构上，并相互靠 拢成簇，形成细胞间相互结合的部位，这种结构成为免疫突触。免疫突触的形成有助于增强 TCR与抗原肽-MHC复合物相互作用的亲和力和促进T细胞信号转导分子的相互作用，其数 量和分布直接决定了T细胞活化的程度。
抗原呈递细胞(APC)是指能够摄取、加工处理抗原，并将处理过的抗原呈递给T细胞 的一类免疫细胞。树突细胞(DC)是迄今为止发现的人体内最强的专职性APC，已被广泛应 用于过继性免疫细胞治疗领域。然而，DC在体外培养条件下，其分化状态难以控制，并且患 者自体来源的DC难以规模化获取。在当今研发异体通用型细胞治疗产品的大趋势背景下， DC的应用受到巨大限制。人工抗原呈递细胞(aAPC)能模拟DC体外诱导抗原特异性T淋巴细胞活化、增值，引起T淋巴细胞对抗原相关靶细胞的杀伤效应。现有技术以磁珠同时负载人工合成的目标抗原肽以及细胞因子，作为诱导T细胞的活化、增值的双信号分子，可替代APC发挥T细胞激活功能，是一种极具前景的T细胞规模化扩增培养解决方案。
市场需要一种更高效激活T细胞，并且易规模化生产的aAPC，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠 及其制备方法及其用途，本发明的磷脂微珠能增加磁珠与抗原肽-MHC复合物的结合效率， 对抗原肽-MHC复合物的吸附力均匀，且吸附能力强，增加了T细胞表面信号转导分子的相 互作用，提高T细胞扩增数量和质量。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠，配方按照质量份数包括：32-36份琼脂，20-24 份明胶，26-30份磷脂酰胆碱，28-32份磁粉，6-10份聚乙二醇单甲醚。
前述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠，配方按照质量份数包括：34份琼脂， 22份明胶，28份磷脂酰胆碱，30份磁粉，8份聚乙二醇单甲醚。
前述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠，磷脂微珠的粒径≤2μm。
一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠的制备方法，包括如下步骤：
按照配方准备材料，配方按照质量份数包括：32-36份琼脂，20-24份明胶，26-30份磷脂酰胆碱，28-32份磁粉，6-10份聚乙二醇单甲醚；
将琼脂溶解在热水中，配成琼脂溶液，再向其中加入明胶，使之溶解；
在乙醇中加入磷脂酰胆碱、聚乙二醇单甲醚搅拌混合，得到第一混合液；
将琼脂-明胶混合溶液与等体积的有机溶剂混合，搅拌，得到第二混合液；
将第一混合液倒入第二混合液，搅拌，得到第三混合液；
在第三混合液中加入磁粉，搅拌1分钟后，加入冰水，继续搅拌得到磷脂微珠。
前述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠的制备方法，有机溶剂包括：乙酸丁酯， 氯仿，汽油。
前述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠的制备方法，将琼脂溶解在60℃的热水中， 配成琼脂溶液，再向其中加入明胶，使之溶解。
前述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠的制备方法，将琼脂-明胶混合溶液与等体 积的有机溶剂混合，开动搅拌，转速为200转/分，得到第二混合液。
前述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠的制备方法，将第一混合液倒入第二混合 液，搅拌，转速380转/分，得到第三混合液。
前述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠的制备方法，在第三混合液中加入磁粉， 转速为160转/分，搅拌1分钟后，加入冰水，转速为,320转/分，继续搅拌得到磷脂微珠。
一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠的用途，用于基于人工抗原呈递细胞的T细胞扩 增，方法包括如下步骤：
将磷脂磁珠，抗原肽复合物，CD3抗体，放入洗涤缓冲液中4℃孵育一天，获得负载抗 原肽表位的aAPC微珠；
将aAPC微珠与分离的单个核细胞共孵育，孵育8天后加入细胞因子，每次换液都加一 次细胞因子，培养体系中细胞因子浓度为500U/ml，共孵育4周。
本发明的有益之处在于：
本发明的磷脂微珠对抗原肽复合物的吸附能力强，同时增加T细胞表面信号转导分子的 相互作用，有利于免疫突触的形成，提高T细胞扩增数量和质量；
本发明微珠的配方中磷脂酰胆碱和聚乙二醇单甲醚对微珠的吸附能力具有协同增效的作 用，二者配合在吸附能力和提高T细胞扩增量和质量上具有很大的进步；
本发明的微珠的物理参数与硅质膜二氧化硅磁珠相似，可以完全代替其在各个领域的应 用，具有优秀的研究前景。
附图说明
图1是本发明实验二中各组T细胞和靶细胞按照不同效靶比共培养后，用CFSE染料标 记法检测靶细胞裂解率。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠，配方按照质量份数包括：32-36份琼脂，20-24 份明胶，26-30份磷脂酰胆碱，28-32份磁粉，6-10份聚乙二醇单甲醚。作为一种优选，配方按照质量份数包括：34份琼脂，22份明胶，28份磷脂酰胆碱，30份磁粉，8份聚 乙二醇单甲醚。
一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠的制备方法，包括如下步骤：
按照配方准备材料；
将琼脂溶解在热水中，作为一种优选，热水为60℃的热水，配成琼脂溶液，再向其中加 入明胶，使之溶解；
在乙醇中加入磷脂酰胆碱、聚乙二醇单甲醚搅拌混合，作为一种优选，转速为200转/分， 得到第一混合液；
将琼脂-明胶混合溶液与等体积的有机溶剂混合，搅拌，作为一种优选，转速380转/分， 得到第二混合液；作为一种实施例，有机溶剂包括：乙酸丁酯，氯仿，汽油；作为一种优选， 选用乙酸乙酯无毒更优。
将第一混合液倒入第二混合液，搅拌，作为一种优选，转速380转/分，得到第三混合液；
在第三混合液中加入磁粉，作为一种优选，转速为160转/分，搅拌1分钟后，加入冰水， 作为一种优选，转速为320转/分，继续搅拌得到磷脂微珠。
根据如下配方的实施例和优选转速温度的方法得到样品1-3和对比样品1-2；
实施例1：32g琼脂，24g明胶，26g磷脂酰胆碱，28g磁粉，10g聚乙二醇单甲醚；
实施例2：36g琼脂，20g明胶，30g磷脂酰胆碱，32g磁粉，6g聚乙二醇单甲醚；
实施例3：34g琼脂，22g明胶，28g磷脂酰胆碱，30g磁粉，8g聚乙二醇单甲醚；
对比实施例1：34g琼脂，22g明胶，28g磷脂酰胆碱，30g磁粉；
对比实施例2：34g琼脂，22g明胶，30g磁粉，8g聚乙二醇单甲醚；
对比样品3：美天旎公司CD3抗体偶联磁珠：
检测样品3得到的微珠物理参数为：磷脂微珠的粒径≤2μm；蛋白质结合能力强：比表面 积>31m2/g，蛋白结合能力>16ug蛋白/mg磁珠；操作性能好：磁粉分散均匀，具有超顺磁 性，饱和磁化强度为83-90emu/g，磁吸相应时间快；磁吸时间20S以内。
实验一，对样品1-3和对比样品1-3做沙门氏菌吸附实验；
将沙门氏菌用荧光标记后的培养液，分别与等量的各个样品磁珠进行离心，将磁珠用缓 冲液冲洗后，进行涂布，紫外线灯观察细菌数量对比，具体数据如表1所示：
表1
细菌数量 密集程度 明显的空缺数
样品1 2468 密 0
样品2 2073 密 1
样品3 3062 密 0
对比样品1 646 稀疏 8
对比样品2 837 稀疏 7
对比样品3 1024 较稀疏 5
由表1可知：样品3的数量密度＞样品1＞样品2＞对比样品3＞对比样品2＞对比样品 1。
且样品1-3的密度均为密集，采用市面上的硅质膜二氧化硅磁珠有明显的空缺，对比样 品1、2均比较稀疏。
由此可知：本发明的配方得到的微珠对大分子蛋白质具有很好的吸附能力，且聚乙二醇 单甲醚与磷脂酰胆碱具有协同作用，合并使用时才能具有优秀的吸附效果。
实验二：以下通过本发明的样品3和对比样品3应用于基于人工抗原呈递细胞的T细胞 扩增方法，包括：
1.外周血单个核细胞(PBMC)分离：
留取健康供者外周血4ml，以Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心，分离出单个核细胞 约2×108个，采用磁珠法从PBMC中分离获得较纯的CD3+T细胞。37℃培养备用。
2.aAPC的构建：
将2.0×109/ml实验一制备获得的微珠10μl，HLA-A2-Ig二聚体2μg，100μg/ml CD3抗体 50μl，2mg/ml抗原肽表位(DLMSSTKGL)1.5μl混合于磁珠洗涤缓冲液，4℃孵育1天。获得具有抗原肽表位，靶向白血病肿瘤细胞的aAPC复合体，记做aAPC微珠。
同时用美天旎公司的CD3抗体耦合磁珠与HLA-A2-Ig二聚体2μg，2mg/ml抗原肽表位 (DLMSSTKGL)1.5μl混合于磁珠洗涤缓冲液，4℃孵育1天。该磁珠记做CM微珠。
3.抗原特异性T细胞的激活：
aAPC组将孵育过的人工APC复合体(HLA-A2-Ig二聚体-抗原肽，CD抗体与微珠)与分离的单个核细胞混合孵育。
CM组用传统的CD3抗体耦合磁珠(CM磁珠)与分离的单个核细胞混合孵育。
Ctrl组不加人工APC复合体。
孵育第8天在以上混合培养体系中各加入人白细胞介素2(hIL-2)(上海华新生物高技术 有限公司)(500U/ml)，每次换液均加IL-2，共孵育4周。
4.CFSE标记法检测抗原特异性T细胞对白血病肿瘤细胞的特异性杀伤作用
CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够轻易穿透细胞 膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。可以利用CFSE标记活细胞 的原理对肿瘤细胞进行标记和定量，从而检测T细胞对肿瘤靶细胞的杀伤效率。具体方法为： 靶细胞等量分成两个组，调整至相同的细胞密度。分别用低浓度和高浓度CFSE染色，其中 高浓度染色的靶细胞与不染色的免疫细胞按照一定比例共培养。孵育一段时间后，将高浓度 染色的靶细胞管(连同免疫细胞)与低浓度染色的靶细胞管等量混合。最后，通过比较CFSE 低浓度标记组和CFSE高浓度标记组的靶细胞百分比，计算T细胞对靶细胞的杀伤率。具体 步骤如下：
4.1将对数期的Raji细胞300-500g离心1-5min，去上清。用PBS重悬细胞，调整细胞密度至(1-2)×107个/ml。
4.2将Raji细胞悬液等量分成两份，一份记作CFSE高标记细胞，另一份记作CFSE低标记细胞。CFSE低标记细胞用低浓度CFSE(0.5μM)染色，CFSE高标记细胞用高浓度CFSE (5μM)标记。染色方法具体如下：在管内按照既定浓度加入CFSE染料(Invitrogen)，避光 37℃孵育10min。
4.3加入至少2倍体积冷的完全培养基终止标记，300-500g离心5min。
4.4去上清，收集细胞沉淀，用完全培养基洗2遍。
4.5将染色的Raji细胞接种至96孔板中，CFSE高标记组(CFSE高标记细胞+T细胞)：每个孔接种Raji细胞(5×104个/100μl)，加入不同处理的T细胞(aAPC组，CM组)，使CAR-T细胞与Raji细胞的个数比分别为1:1、1:3、1:9、1:27；CFSE低标记组(只有CFSE低标记细胞)：每个孔接种Raji细胞(5×104个/100μl)单独培养，并用完全培养基补足至相同体积。同时设置未与T细胞共培养的CFSE高标记细胞孔作为对照组。
6、37℃孵育6小时后，CFSE高标记组与CFSE低标记组所有细胞，按1:1混合，并将混合后的细胞记作实验组混合细胞。同时收集对照组(只有CFSE高标记细胞)与CFSE低 标记组所有细胞，按1:1混合，并将混合后的细胞记作对照组混合细胞。
7、流式上机，检测各个组FITC单通道的荧光值。
8、靶细胞裂解率分析：流式上机后，应检测出两个FITC阳性峰，分别是CFSE高标记和低标记细胞峰，测得CFSE高标记组和低标记组靶细胞比例。然后按照以下公式计算T细胞对靶细胞杀伤率(％)：
T细胞对靶细胞的杀伤率(％)＝100％-[(实验组混合细胞中CFSE高标记细胞占比％/ 实验组混合细胞中CFSE低标记细胞占比％)/(对照组混合细胞中CFSE高标记细胞占比％/对 照组混合细胞中CFSE低标记细胞占比％)]×100％。
例如，测得实验组混合细胞中CFSE高标记细胞占比42.5％，CFSE低标记细胞占比57.5％； 测得对照组混合细胞中CFSE高标记细胞占比49.5％，CFSE低标记细胞占比51.5％，那么特 异性裂解率(％)＝100％-(42.5％/57.5％)/(49.5％/51.5％)×100％。
实验结果如图1和表2所示。
表2 T细胞对靶细胞的裂解率(％)
Figure BDA0002861415630000062
结果分析：使用aAPC微珠孵育的T细胞和靶细胞Raji按照不同效靶比共培养后，在效 靶比为1:1时，细胞裂解率达到60％以上。相比CM组和对照组T细胞，aAPC孵育的T细 胞的靶细胞杀伤能力显著增强。
综上两个实验可知：本发明的磷脂微珠对大分子抗原肽-MHC复合物具有较强吸附能力， 能够应用于人工抗原呈递细胞以及抗原特异性T细胞的扩增，提高T细胞扩增数量和质量。 其他应用也具有前景，只要是使用了本发明的磷脂微珠，均在本发明的保护范围内。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解， 上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案， 均落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠，其特征在于，配方按照质量份数包括：32-36份琼脂，20-24份明胶，26-30份磷脂酰胆碱，28-32份磁粉，6-10份聚乙二醇单甲醚；
作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠的制备方法，包括如下步骤：
按照配方准备材料，配方按照质量份数包括：32-36份琼脂，20-24份明胶，26-30份磷脂酰胆碱，28-32份磁粉，6-10份聚乙二醇单甲醚；
将琼脂溶解在热水中，配成琼脂溶液，再向其中加入明胶，使之溶解；
在乙醇中加入磷脂酰胆碱、聚乙二醇单甲醚搅拌混合，得到第一混合液；
将琼脂-明胶混合溶液与等体积的有机溶剂混合，搅拌，得到第二混合液；
将第一混合液倒入第二混合液，搅拌，得到第三混合液；
在第三混合液中加入磁粉，搅拌1分钟后，加入冰水，继续搅拌得到磷脂微珠。
2.根据权利要求1所述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠，其特征在于，配方按照质量份数包括：34份琼脂，22份明胶，28份磷脂酰胆碱，30份磁粉，8份聚乙二醇单甲醚。
3.根据权利要求1所述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠，其特征在于，所述磷脂微珠的粒径≤2μm。
4.根据权利要求1所述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠，其特征在于，所述有机溶剂包括：乙酸丁酯，氯仿，汽油。
5.根据权利要求1所述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠，其特征在于，将琼脂溶解在60℃的热水中，配成琼脂溶液，再向其中加入明胶，使之溶解。
6.根据权利要求1所述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠，其特征在于，将琼脂-明胶混合溶液与等体积的有机溶剂混合，开动搅拌，转速为200转/分，得到第二混合液。
7.根据权利要求1所述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠，其特征在于，将第一混合液倒入第二混合液，搅拌，转速380转/分，得到第三混合液。
8.根据权利要求1所述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠，其特征在于，在第三混合液中加入磁粉，转速为160转/分，搅拌1分钟后，加入冰水，转速为,320转/分，继续搅拌得到磷脂微珠。
9.根据权利要求1所述的一种作为人工抗原呈递细胞的磷脂微珠的用途，其特征在于，用于基于人工抗原呈递细胞的T细胞扩增，方法包括如下步骤：
将磷脂磁珠，抗原肽复合物，CD3抗体，放入洗涤缓冲液中4℃孵育一天，获得负载抗原肽表位的aAPC微珠；
将aAPC微珠与分离的单个核细胞共孵育，孵育8天后加入细胞因子，每次换液都加一次细胞因子，培养体系中细胞因子浓度为500U/ml，共孵育4周。
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